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文章信息
- 黄艳冰, 蒋晓东, 刘威, 黄春帅, 张丽萍, 诸晗宁, 张长生, 张文军
- HUANG Yan-Bing, JIANG Xiao-Dong, LIU Wei, HUANG Chun-Shuai, ZHANG Li-Ping, ZHU Han-Ning, ZHANG Chang-Sheng, ZHANG Wen-Jun
- 叶状蔷薇珊瑚来源真菌Parengyodontium album SCSIO 40430次级代谢产物研究
- Chromanones from Montipora foliosa-derived Parengyodontium album SCSIO 40430
- 微生物学通报, 2018, 45(9): 1881-1888
- Microbiology China, 2018, 45(9): 1881-1888
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180226
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文章历史
- 收稿日期: 2018-03-22
- 接受日期: 2018-05-09
- 网络首发日期(www.cnki.net): 2018-06-06
2. 中国科学院大学 北京 100049;
3. 省部共建华南应用微生物国家重点实验室 南海资源开发和保护协同创新中心(SCS-REPIC) 中山大学 广东 广州 510275
2. University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, South China Sea Resource Exploitation and Protection Collaborative Innovation Center (SCS-REPIC), SunYat-sen University, Guangzhou, Guangdong 510275, China
天然产物或其衍生物是药物或先导药物的重要来源[1]。海洋来源真菌是小分子天然产物的重要来源之一,海洋天然产物中约有1/3的小分子化合物来源于海洋真菌[2]。海洋真菌为了适应特殊的生存环境(高盐、高压和寡营养),往往产生新的代谢途径及生理功能,极大地提高了从中发现结构新颖的活性天然产物、新功能基因及新催化机制的可能性。近年来,研究者们从海洋来源真菌中发现一系列结构新颖、活性广泛的小分子天然产物[2-6]。Cueto等从真菌Aspergillus sp.中分离得到新颖的萜类化合物Aspergilloxide[7]。Khalil等从真菌Aspergillus sp.发酵液中发现新的吗啉二酮Shornephine A,该类化合物能解除多药耐药结肠癌细胞株对阿霉素的抗性[8]。Li等从海绵来源的真菌Niphates recondita中分离得到新颖的混源萜[9]。Meng等从真菌Penicillium bilaiae MA-267发酵液中分离到含有三元桥环的十二烷骨架倍半萜Penicibilaenes A和B,该类化合物对植物病原真菌Colletotrichum gloeosporioides有显著的选择性生长抑制活性[10]。Jia等从软珊瑚来源的真菌Pestalotiopsis sp.发酵液中分离得到一对镜象螺环对映二聚体(+)-(-)-Pestaloxazine A,(+)-Pestaloxazine A对肠道生长病毒EV71有显著的抑制活性[11]。在研究海洋来源微生物次级代谢产物过程中,我们从叶状蔷薇珊瑚中分离得到一株真菌,ITS (Internal transcribed spacer)测序鉴定为Parengyodontium album。Parengyodontium album在2016年由Tsang等首次报道[12],据检索,尚无关于Parengyodontium album次级代谢产物的报道。Parengyodontium album SCSIO 40430在28 ℃、3%的海盐培养基中生长良好。前期对该菌株进行化学(HPLC-DAD)及生物活性筛选,发现该菌株的发酵粗提物有丰富的次级代谢产物且有较好的抑菌活性。进一步从其次级代谢产物中发现3个苯并二氢吡喃酮类化合物(1-3)[13-15]。本文报道了化合物1-3的分离纯化、结构鉴定及其抑菌活性(图 1)。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器真菌试剂盒,Omega Bio-Tek公司;氘代试剂Methonal-d4,剑桥CIL (同位素标准品)公司;色谱纯乙腈,安徽时联公司;其他试剂均为国产分析纯。核磁共振仪Bruker AV-500,布鲁克光谱仪器公司;电喷雾质谱ESI-MS (Maxis quadrupole- time-of-flight mass spectrometer),布鲁克道尔顿公司;高效液相色谱仪,安捷伦科技公司;中压制备层析系统,上海利穗生物化工科技有限公司;硅胶薄层板,烟台江友硅胶开发有限公司;Sephadex LH-20,通用电气医疗集团公司;反相填料(YMC-Pack ODS-A,50 µm,12 nm),YMC公司。
1.2 菌株分离Parengyodontium album SCSIO 40430分离自南海海域的叶状蔷薇珊瑚。菌种分离方法参考文献[16],菌种保存于中国科学院南海海洋研究所海洋微生物菌种中心。
1.3 菌种鉴定Parengyodontium album SCSIO 40430鉴定方法参考文献[17]。采用真菌试剂盒提取DNA,用琼脂糖凝胶电泳检测,设计引物ITS1 (5′-TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3′),以ITS1和ITS4为引物构成的PCR反应体系对目的DNA片段进行扩增[16],经琼脂糖凝胶电泳后回收、测序。最后将得到的DNA序列在NCBI数据库检索,构建系统进化树。
1.4 菌株的发酵培养种子培养与发酵培养采用PDB培养基:马铃薯葡萄糖水24 g,海盐3%,pH 7.0-7.3,6×104 Pa灭菌30 min,冷却备用。
挑取培养皿上的真菌单克隆菌落,接种到种子培养基中(50 mL/250 mL),28 ℃、200 r/min振荡培养5 d,制得种子液;将种子液以5%的接种量(体积百分比)接种于发酵培养基中(200 mL/1 000 mL),28 ℃、200 r/min振荡培养14 d,获得发酵液,共10 L。
1.5 发酵产物的提取与分离收集发酵液,菌丝体用1 L丙酮在室温下浸提3次,合并提取液,减压回收丙酮,经蒸馏浓缩后用丁酮萃取得到浸膏A;水相用丁酮萃取,丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏B。合并A和B后得到粗浸膏(15.0 g)。将粗浸膏用硅胶柱(300-400目)层析,用氯仿/甲醇作为洗脱剂,从体积比100:0-0:100进行梯度洗脱,得馏分Fr.1-5。Fr.3 (1.08 g)用硅胶柱(100-200目)层析,用石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂,从体积比100:0-0:100进行梯度洗脱,得Fr.3-1-Fr.3-10。Fr.3-2 (18.1 mg)用高效液相色谱制备(Phenomenex C18柱,5 μm,150 mm×4.6 mm)得化合物1 (6.01 mg)和化合物2 (8.08 mg);Fr.3-5 (20.02 mg)过LH-20凝胶柱(2.5 cm×100 cm),以氯仿/甲醇体积比1:1作为流动相洗脱,得Fr.3-5-A-F,Fr.3-5-B (6.01 mg)用高效液相色谱制备(Phenomenex C18柱,5 μm,150 mm×4.6 mm)得化合物3 (2.01 mg)。
1.6 活性评价用纸片法粗测化合物1-3对8株指示菌[粪链球菌(Enterococcus faecalis ATCC 29212)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus ATCC 29213)、大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)、弧菌(XSBZ14)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin resistant S. aureus ATCC 43300)、苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis SCSIO BT01)和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)]的生长抑制活性,以万古霉素(Vancomycin)作为阳性对照,以二甲基亚砜(DMSO)作为阴性对照。采用微量肉汤稀释法测定化合物1-3的最小抑菌浓度(MIC)。每个样品重复3次。指示菌中包含MRSA ATCC 43300和A. baumannii ATCC 19606,在二级生物安全实验室的无菌超净台上进行8种指示菌的接种培养和抗菌活性的实验操作。
用DMSO作为溶剂,将化合物1-3配置浓度为2.56 mg/mL的母液,于-80 ℃保存备用。将MH液体培养基加入96孔板中,在第1列中每孔加入200 μL,第2列中加入100 μL,第3列每孔加入195 μL,剩余每列加入100 μL,然后在第3列加入化合物母液5 μL,吹吸混匀,再从第3列吸取100 μL液体置于第4列,吹吸混匀,以此类推,依次往下稀释到第12列,最后一列取100 μL液体弃去。按照同样的方法分别加入DMSO和万古霉素作为对照组。
用无菌的MH液体培养基将培养好的菌液稀释1 000倍,除第1列外每孔加100 μL,使化合物的终浓度分别为64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 μg/mL。以上实验每组做3个平行。37 ℃培养16-20 h后,用酶标仪测定菌液浓度(OD600值),依据菌株在含有不同浓度化合物孔中的生长情况,判断能够有效抑制菌株生长的化合物最小浓度值,即为MIC (Minium inhibitory concentration)值。
2 结果与分析 2.1 菌属鉴定PDA固体培养基上28 ℃培养15 d,菌落直径20 mm-65 mm,菌落中间有紧密的产孢簇,初期乳白色,后期转为米黄色至黄褐色,反面浅腊黄色(图 1A)。将测序后的结果送GenBank数据库做BLAST比对,经检索菌株SCSIO 40430的18S rRNA基因与Parengyodontium album高度相似(100%)。构建菌株SCSIO 40430的Neighbor-Joining (N-J)进化树(图 2)。
2.2 结构鉴定化合物1白色晶体(甲醇、水),HRESI-MS (+)显示其准分子离子峰为m/z 239.128 6 [M+H]+(cal 239.127 8),推测其分子式为C13H18O4。根据1H NMR谱中δ 5.98 (1H,s) 1个质子信号以及13C NMR谱中δC 91.2-166.7的芳香碳信号(图 3,图 4),推测化合物1的结构中存在1个多取代苯环结构。根据1H谱中δH 1.01 (3H,t,J=7.5),δH 1.08 (3H,t,J=7.5),δH 3.86 (3H,s)推测化合物1的结构中存在着2个甲基和1个甲氧基。将以上数据与参考文献[13]对比,确定化合物1为Deoxyphomalone。化合物1通过X-ray单晶衍射进一步确证了其结构(图 1B,CCDC 1831134)。其波谱数据如下:HRESIMS (+) m/z 239.128 6 [M+H]+。1H NMR (CD3OD,500 MHz) δ:5.98 (1H,s,H-4),3.86 (3H,s,H-13),2.97 (2H,t,J=7.5,H-10),2.59 (2H,q,J=7.5,H-7),1.71 (2H,m,H-11),1.08 (3H,t,J=7.5,H-8),1.01 (3H,t,J=7.5,H-12)。13C NMR (CD3OD,125 MHz) δ:165.7 (C,C-1),111.4 (C,C-2),163.6 (C,C-3),91.2 (CH,C-4),162.6 (C,C-5),105.8 (C,C-6),16.4 (CH2,C-7),14.4 (CH3,C-8),207.0 (C,C-9),47.2 (CH2,C-10),19.6 (CH2,C-11),13.8 (CH3,C-12),55.8 (CH3,C-13)。
化合物2白色粉未,HRESI-MS (+)显示其准分子离子峰为m/z 223.096 2 [M+H]+ (cal 223.097 3),推测其分子式为C12H14O4。根据1H NMR谱中δ 5.79 (1H,s) 1个质子信号以及13C NMR谱中δC 93.7-164.3的芳香碳信号(图 3,图 4),推测化合物2的结构中存在1个多取代苯环结构。根据1H谱中δH 0.96 (3H,t,J=7.5),δH 1.34 (3H,t,J=7.5)推测化合物2的结构中存在着2个甲基。将以上数据与参考文献[13-14]对比,确定化合物2为2-Ethyl-3, 5-dihydroxy-11-methylchroman-9-one。其波谱数据如下:HRESIMS (+) m/z 223.096 2 [M+H]+。1H NMR (CD3OD,500 MHz) δ:5.79 (1H,s,H-4),4.40 (1H,m,H-11),2.58 (2H,m,H-10),2.42 (2H,m,H-7),1.34 (3H,d,J=6.0,H-12),0.96 (3H,t,J=7.5,H-8)。13C NMR (CD3OD,125 MHz) δ:164.3 (C,C-1),110.4 (C,C-2),161.0 (C,C-3),93.7 (CH,C-4),160.9 (C,C-5),101.5 (C,C-6),14.5 (CH2,C-7),12.4 (CH3,C-8),198.5 (C,C-9),42.7 (CH2,C-10),73.7 (CH2,C-11),19.5 (CH3,C-12)。
化合物3白色粉末,HRESI-MS (+)显示其准分子离子峰为m/z 237.112 4 [M+H]+ (cal 237.112 1),推测其分子式为C13H16O4。根据1H NMR谱中δ 6.10 (1H,s) 1个质子信号以及13C NMR谱中δC 93.3-164.2的芳香碳信号(图 3,图 4),推测化合物3的结构中存在1个多取代苯环结构。根据1H谱中δH 1.08 (3H,t,J=7.5),δH 1.49 (3H,t,J=7.5),δH 3.80 (3H,s)推测化合物3的结构中存在着2个甲基和1个甲氧基。将以上数据与参考文献[15]相对比,确定化合物3为2-Ethyl-3-hydroxy-5-methoxy- 11-methylchroman-9-one。其波谱数据如下:HRESIMS (+) m/z 237.112 4 [M+H]+。1H NMR (CD3OD,500 MHz) δ:6.10 (1H,s,H-4),4.51 (1H,m,H-11),3.80 (3H,s,H-13),2.59 (2H,m,H-10) 2.57 (2H,m,H-7),1.49 (3H,t,J=6.0,H-12),1.08 (3H,t,J=7.5,H-8)。13C NMR (CD3OD,125 MHz) δ:164.2 (C,C-1),112.0 (C,C-2),163.8 (C,C-3),93.3 (CH,C-4),161.7 (C,C-5),105.7 (C,C-6),16.8 (CH2,C-7),14.1 (CH3,C-8),193.2 (C,C-9),46.4 (CH2,C-10),74.9 (CH2,C-11),21.0 (CH3,C-12),55.9 (CH3,C-13)。
2.3 抑菌活性按照1.6中的实验方法测定化合物1-3抑菌活性(表 1),化合物1和3对所测的指示菌无明显抑制活性,化合物2对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin resistant S. aureus ATCC 43300)、苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis SCSIO BT01)有较好的生长抑制活性,其最小抑菌浓度MIC均为16 µg/mL。
Sample and drugs | MRSA (43300) | B. thuringiensis |
1 | > 128.0 | > 128.0 |
2 | 16.0 | 16.0 |
3 | > 128.0 | > 128.0 |
万古霉素Vancomycina | 0.5 | 1.0 |
注:a:万古霉素为阳性对照. Note: a: Vancomycin is positive control. |
1972年,化合物3首次从Phoma pigmentiuora发酵液中被分离得到,结构确定为4-乙基-5-羟基-3-甲氧基-11-甲基苯并二氢吡喃-9-酮,之后在1992年通过全合成对该结构进行修正,修正为2-乙基-3-羟基-5-甲氧基-11-甲基苯并二氢吡喃-9-酮[15]。在1994年,化合物1和2首次从真菌Photna etheridgei sp.发酵液中被分离得到[13],之后在2017年,从红树林来源的真菌Aspergillus sp. SCSIO 41002中再次分离获得[14]。化合物1对Phellinus tremulae有生长抑制作用[13]。在抑菌活性实验中,我们发现化合物2对MRSA有较好的抑制活性,对其结构优化、改造,或许可以发展成为抗MRSA的先导化合物。珊瑚礁生态系统是热带海洋中重要的生态系统,它为多样、庞大的海底生物提供了生存资源。同时,珊瑚进行拒捕食、防附着、克生、抗微生物等化学防御。珊瑚共附生微生物可能参与了宿主的化学生态学防御[18-19]。Parengyodontium album SCSIO 40430分离自叶状蔷薇珊瑚,其较好的抑菌活性(化合物2)为珊瑚的化学防御提供了支持,也为更好地保护珊瑚礁生态系统提供了线索。
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