饮酒是各国饮食文化的一部分，酒更是许多庆典和社交活动的必备饮料。酒的主要成分是酒精(即乙醇)，还含有高级醇类、脂肪酸类、酯类、醛类等物质。现代医药学家对酒精进行的大量药理研究发现，适量饮酒对中枢神经有兴奋作用，并缓和止痛，可激发细胞保护机能，保护心肌和神经元^[1-2]。然而酒又是被公认“有毒”的饮料之一，长期过量饮酒会引起肝损伤^[3]、慢性胃炎、多发性神经炎、视神经炎和营养缺乏，提高糖尿病^[4]、心血管疾病^[5]等的发生率。

肠道微生物是人体的“微生物器官”，对宿主起生物拮抗、免疫、排毒、营养等生理功能，而宿主则为肠道微生物提供生存条件。宿主影响肠道菌群的同时，肠道菌群又反过来作用于宿主。当宿主与肠道微生物之间的平衡系统遭到破坏时，肠道微生物在种类、数量和定位上发生异常，宿主就会患病或出现病理变化。现代研究表明，肠道微生物与肥胖^[6-7]、糖尿病^[8-9]、中枢神经系统疾病^[10]、肝损伤^[11-13]等多种疾病相关。肠道微生物的研究日趋受到科学家们的关注，深入探究肠道微生物有望解决一些生命科学和医学难题。许多因素可直接或间接影响肠道微生物的生长、繁殖、代谢以及定殖等生理特征。肠道微生物为机体提供屏障作用，具有促进肠道消化吸收的作用，同时其组成也与饮食密切相关。本研究探讨酒精摄入量对小鼠肠道微生物、酶活性及血常规的影响，旨在为人类健康饮酒提供指导。

SPF (Specific pathogen free)级昆明小鼠，体质量20±2 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[实验动物许可证号：SYXK(湘) 2013-0005]。动物饲料由湖南中医药大学动物实验中心提供。乳酸菌、大肠杆菌、双歧杆菌、细菌培养基的配制参考文献[14-15]。

无水乙醇，天津市富宇精细化工有限公司生产；氢氧化钠，西陇化工股份有限公司生产；干酪素，武汉佰兴生物科技有限公司生产；木聚糖，山东欣鼎生物科技有限公司；福林酚试剂，武汉市伟琪博星生物科技有限公司。

手提式高压灭菌锅，广州沪瑞明仪器有限公司；恒温培养箱，上海姚氏仪器设备厂；分光光度计，上海凌析仪器有限公司；水浴锅，苏州力意达仪器科技有限公司；CA-500血液自动分析仪，山东兰桥医学科技有限公司生产。

24只昆明小鼠适应性喂养2 d后，随机分为4组，每组6只，雌雄各半。把无水乙醇和蒸馏水按体积比分别配置成浓度为10%、20%、30%的乙醇水溶液，作为实验小鼠唯一饮水来源。对照组给予蒸馏水自由饮用，低酒精量摄入组给予10%乙醇水溶液，中酒精量摄入组给予20%乙醇水溶液，高酒精量摄入组给予30%乙醇水溶液。每天观察小鼠的情况，每2 d更换一次水或乙醇水溶液，连续一个月。

小鼠禁食12 h，禁水1 h，参照文献[16]的方法眼球采血1.5 mL左右，注入EDTA-K2抗凝管中，混匀后2 h内送至湖南中医药大学第一附属医院检验科，4 h内完成检测。将小鼠断颈处死后立即置于超净工作台上，无菌采集回肠内容物，混匀后置于冰上备用^[17]。

参照文献[16]采用阻抗法测定。

参照文献[18]的方法，分别称取一定量各组动物回肠内容物置于洁净的锥形瓶中，以无菌水稀释后加入15–20颗无菌玻璃珠，37 ℃振荡培养20 min，使微生物充分分散。取一定量的溶液稀释到合适的浓度使平板上菌落数为30–300个，采用涂布法计数。大肠杆菌、细菌37 ℃培养24 h计数，双歧杆菌和乳酸菌37 ℃厌氧培养24 h计数。每一个稀释度重复做3次，计算并求其平均值作为每克肠道内容物所含菌落数。

无菌环境下取所收集到的各组肠道内容物，分别置于装有无菌水的三角瓶中，37 ℃、120 r/min振荡30 min，使酶液充分溶出后3 000 r/min离心8 min，收集上清液即为粗酶液。采用福林酚法测定蛋白酶活性，采用DNS比色法^[18]测定淀粉酶、木聚糖酶和纤维素酶活性。蛋白酶活性和淀粉酶活性以1 g肠道内容物在40 ℃作用15 min生成1 mg还原糖定义为1个酶活单位U。木聚糖酶活性以1 g肠道内容物在50 ℃作用60 min生成1 mg还原糖定义为1个酶活单位U。纤维素酶活性以1 g肠道内容物在50 ℃作用20 min生成1 mg还原糖定义为1个酶活单位U。

所得数据采用平均值±标准差表示，用SPSS 17.0软件进行统计学分析，两组间差异性分析采用t检验，P < 0.05或P < 0.01表示差异有统计学意义。

实验过程中，低酒精量摄入组小鼠表现正常，高酒精量摄入组小鼠进食量比低酒精量摄入组小鼠多，形体增长较快，而且粪便多稀湿。

对不同浓度饮酒小鼠肠道微生物进行计数结果可知(图 1)，低酒精量摄入组小鼠肠道所含乳酸菌菌落数极显著地高于中酒精量摄入组和高酒精量摄入组(P < 0.01)，也高于对照组(P < 0.05)；与对照组相比，低酒精量摄入组小鼠肠道双歧杆菌菌落数降低很多，但显著高于中酒精量摄入组和高酒精量摄入组(P < 0.05或P < 0.01)；低酒精量摄入组和中酒精量摄入组小鼠肠道中大肠杆菌菌落数显著减少(P < 0.05)。以上结果说明，低酒精摄入量能促进有益菌乳酸菌增殖、抑制细菌和大肠杆菌生长，中酒精摄入量和高酒精摄入量同时抑制乳酸菌、双歧杆菌和总细菌的生长。

图 1　酒精摄入量对小鼠肠道微生物的影响 Figure 1　Effect of alcohol in different concentration on the intestinal microbes in mice 注：乳酸菌106 CFU/g、细菌105 CFU/g、双歧杆菌106 CFU/g、大肠杆菌106 CFU/g.与对照组比较：a：P < 0.01，A：P < 0.05；与低酒精量摄入组比较：b：P < 0.01，B：P < 0.05；与中酒精量摄入组比较：c：P < 0.01，C：P < 0.05. Note: Lactobacillus 106 CFU/g, Bacteria 105 CFU/g, Bifidobacteria 106 CFU/g, Colabacillus 106 CFU/g. Compared to control group: a: P < 0.01, A: P < 0.05; Compared to low dose group: b: P < 0.01, B: P < 0.05; Compared to medium dose group: c: P < 0.01, C: P < 0.05.

图选项

由表 1可知，低酒精量摄入组小鼠肠道内容物中所含木聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶的活性均极显著低于正常组(P < 0.01)，但是蛋白酶活性/木聚糖酶活性的比值与正常组差别不大，且远高于中酒精量摄入组和高酒精量摄入组(P < 0.01)，淀粉酶活性/木聚糖酶活性高于对照组且远高于中酒精量摄入组和高酒精量摄入组；高酒精量摄入组小鼠肠道内容物所含木聚糖酶和淀粉酶活性显著高于对照组(P < 0.01)，而蛋白酶活性显著低于对照组(P < 0.01)，同时肠道内纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶活性均比低酒精量摄入组和中酒精量摄入组高，但蛋白酶活性/木聚糖酶活性和淀粉酶活性/木聚糖酶活性比值却远低于对照组和低酒精量摄入组。

血常规检测是临床最常用的基础检测项目之一，它包括红细胞、白细胞、血小板和血红蛋白测定等。红细胞、白细胞和血小板是人体血液的重要成分，其形态和数量的变化可直接或间接反映机体疾病的发生和发展。进行血常规检测和分析有助于疾病的诊断和治疗，对临床和科研都具有重要意义。由表 2可知，中酒精量摄入组小鼠血液中红细胞、白细胞、血小板及血红蛋白等血常规各相关指标与对照组相比变化不大，说明中酒精摄入量对血液影响不大。高酒精量摄入组小鼠血液中血小板计数(PLT)、血小板平均体积(MPV)、白细胞计数(WBC)与对照组相比均有所降低，说明高酒精摄入量可能会对机体的凝血和免疫功能产生潜在的影响；与对照组相比，高酒精量摄入组小鼠血液中红细胞数和血红蛋白含量变化趋势相反，而机体氧气的运输主要靠血细胞中的血红蛋白与氧气结合，可见高酒精摄入量可能会对机体氧气的运输产生影响。相比于对照组，低酒精量摄入组小鼠血液中所含红细胞比容、血小板体积分布宽度、血红蛋白显著降低(P < 0.05)，但血红蛋白量/红细胞计数的值变化不大，且红细胞比容降低，血液黏度越小。与对照组相比，低酒精量摄入组小鼠血液所含血小板体积分布宽度显著降低(P < 0.05)，说明机体血小板体积更趋均匀。

乳酸菌和双歧杆菌都是哺乳动物肠道内的益生菌，黏附于肠上皮细胞，抑制致病菌的黏附、定殖和入侵。乳酸菌可促进营养物质的吸收利用、调节肠道菌群、增强免疫、降低血清胆固醇，其代谢产物能够杀死或抑制多种革兰氏阳性菌的增殖，降低直接引起炎性反应和肠道疾病的细菌数量^[19]。乳酸菌数量的减少可破坏肠道内环境的稳态，成为炎症发生的病理生理基础^[20]。双歧杆菌是构成肠道定殖抗力的主要细菌之一，其代谢产物主要是有机酸，引起肠道pH值下降，抑制了肠道致病菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、艰难梭菌及沙门氏菌等的生长繁殖，而自身的生长不受抑制，维持了肠道菌群的相对平衡^[21-22]，并与肠道上皮细胞保持着和谐共生关系。乙醇是在乳酸菌菌体生存环境中最常见的胁迫因子之一。有研究显示，8%的乙醇能使乳酸菌菌落数增加^[23]，与本研究中低酒精摄入量组的结果相一致。中酒精量摄入组和高酒精量摄入组小鼠肠道所含乳酸杆菌数明显减少，且乳酸菌数量显著低于大肠杆菌数，增大了大肠杆菌与肠黏膜接触的机会，引起肠黏膜炎症反应加重，致病性提高。同时炎症因子激活巨噬细胞在吞噬反应过程中产生ROS (Reactive oxygen species)，抑制乳酸菌的定殖和生物学功能的发挥，进一步降低了肠道屏障功能的发挥。本研究中低酒精量摄入组小鼠肠道双歧杆菌菌落数极显著高于中酒精量摄入组和高酒精量摄入组，乳酸菌菌落数也显著高于对照组，细菌和大肠杆菌菌落数明显低于对照组，说明低酒精摄入量小鼠肠道中乳酸菌和双歧杆菌成为优势菌群，可能抑制了大肠杆菌和细菌的生长。高酒精量摄入组小鼠肠道所含益生菌数量与对照组相比显著降低，而大肠杆菌数量与低酒精量摄入组和中酒精量摄入组差异显著，说明高酒精摄入量可造成小鼠肠道菌群不平衡，内环境被破坏，细菌过度增长，使更多的乙醇在肠腔被转化为乙酸盐和乙醛，后者与细菌的代谢产物共同作用导致对肠黏膜的损伤，引起肠道炎症反应的发生。可见低酒精摄入量慢性饮酒可相对促进益生菌的生长，抑制有害菌的繁殖，调控了菌群平衡，使肠道屏障功能增强。

人和动物肠道中的消化酶对机体营养物质的消化吸收具有关键作用。蛋白酶主要参与蛋白质在肠道中的消化。淀粉酶可催化淀粉水解，降低食糜黏度，防止有害微生物的滋生，促进有益微生物的增长^[24]。木聚糖酶作用于木聚糖，降解戊聚糖成低聚糖和木糖，还能特异性地降解水不溶性戊聚糖，将其转变为水溶性戊聚糖及小分子^[25]，调解动物机体内源性消化酶活性，改善机体对养分的消化吸收状况。纤维素酶可降解纤维素生成葡萄糖。纤维素酶与半纤维素酶、果胶酶等协同作用下可摧毁植物细胞壁，提高营养物质的利用率。

机体肠道中的消化酶部分是由肠道菌群生成。木聚糖酶和纤维素酶主要来自于真菌和细菌，二者活性下降可反映出肠道真菌和细菌数量的变化，本研究中低酒精量摄入组小鼠肠道木聚糖酶和纤维素酶活性下降，与低酒精量摄入组小鼠肠道细菌数和大肠杆菌数的变化趋势相一致。纤维素酶和木聚糖酶具有协同作用。马文鹏等^[26]研究发现当纤维素酶和木聚糖酶酶活比达到2.5时，对酒糟中纤维素和半纤维素组分酶解效果最好。低酒精量摄入组小鼠肠道纤维素酶和木聚糖酶酶活比接近于对照组，远高于中酒精量摄入组和高酒精量摄入组，这说明虽然低酒精量摄入组小鼠肠道中木聚糖酶和纤维素酶活性下降，但两者比值向着最佳协同效果方向转化，更有利于机体对纤维素和半纤维素的消化吸收。肠道自身主要分泌淀粉酶和蛋白酶，若其活性下降会使机体的消化吸收功能受到影响。虽然低酒精量摄入组各消化酶活性均低于对照组，但小鼠肠道淀粉酶活性/木聚糖酶活性比值显著高于其它组，蛋白酶活性/木聚糖酶活性的比值高于对照组，且与中酒精量摄入组和高酒精量摄入组比较差异极显著。少量饮酒调动了机体内源性消化酶活力，调整肠道酶的构成，使酶解效率更高，从而改善了机体对养分的消化吸收状况。

红细胞是血液中数量最多的一种血细胞，具有免疫功能，是机体通过血液运输氧气最主要的媒介。血小板是存在于哺乳动物血液中的有形成分之一，在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成等生理和病理过程中具有重要作用。白细胞是血细胞中一种有免疫功能的细胞，具有抵抗外侵细菌的能力，为机体组织和细胞起到防御作用。Wang等^[27]和Buttari等^[28]研究表明，乙醇可抑制骨髓造血干细胞功能，造成白细胞和血小板减少。本研究结果显示，高酒精量摄入组小鼠血液中PLT、MPV和WBC与对照组相比均降低，说明高酒精摄入量可能会影响小鼠的造血功能和免疫功能。红细胞比容(TCT)是影响血液黏度的重要因素。由血常规数据看出，与对照组相比，低酒精量摄入组小鼠TCT显著降低，表明小鼠血液黏度下降，血流阻力减小；低酒精量摄入组小鼠血小板分布宽度(PDW)降低，说明血小板大小变得更均匀。敬华等^[29]研究表明，适量饮酒具有类似阿司匹林抗血小板聚集的作用，可抑制血栓的形成，对有血栓形成倾向疾病的患者有一定裨益。可见，低酒精摄入量可在一定程度上调节血流，对血管性病变具有一定益处。

总之，酒是一把双刃剑，少量慢性饮酒可调节肠道内环境，增强机体的营养和免疫，有利于血流和机体健康，过量饮酒则对机体的各种生理功能具有潜在的危害性。