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文章信息
- 唐果, 孟泽彬, 文庭池, 李茂双, 姬玉竹, 李维, 王晓桃
- TANG Guo, MENG Ze-Bin, WEN Ting-Chi, LI Mao-Shuang, JI Yu-Zhu, LI Wei, WANG Xiao-Tao
- 响应面法优化粉被虫草中虫草素的提取工艺
- Optimization of extraction of cordycepin from Cordyceps pruinosa by response surface methodology
- 微生物学通报, 2018, 45(6): 1350-1357
- Microbiology China, 2018, 45(6): 1350-1357
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170672
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文章历史
- 收稿日期: 2017-08-27
- 接受日期: 2018-03-29
- 网络首发日期(www.cnki.net): 2018-04-18
2. 贵州大学西南药用生物资源教育部工程研究中心 贵州 贵阳 550025
2. Engineering and Research Center for Southwest Bio-Pharmaceutical Resources of National Education Ministry of China, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025, China
虫草是一种虫菌复合体或菌菌复合体(真菌菌核上寄生),主要寄生于节肢动物,在世界各地均有分布,在中国、日本、韩国等亚洲地区长期作为药物使用[1-2]。粉被虫草Cordyceps pruinosa Petch,民间常作为药物使用,与冬虫夏草同属虫草类真菌,隶属于真菌界(Fungi)子囊菌门(Asomycotsa)子囊菌纲(Ascomycetes)粪壳菌亚纲(Sordariomycetidae)肉座菌目(Hypocreales)虫草菌科(Cordycepitaceae)虫草属(Cordyceps),广泛分布于世界各地[1-2]。早期研究表明粉被虫草具有抗辐射[3-4]、抗真菌、抗细菌[5]、免疫调节[6]及调节心血管系统等作用[7];近来研究报道其甲醇提取物通过抑制NF-κB依赖的炎症基因的表达来抑制炎症,暗示其有治疗内毒素性休克或败血症的潜在价值[8],在食品、医药领域有广泛的应用前景[7]。目前关于粉被虫草活性成分的报道很少,从中仅分离到10余个化合物:N6-(2-羟乙基)-腺苷[9]、多糖ps1、ps2[10]、分子式为C26H32O9的天然色素[11]、虫草素[12]、胆固醇、β-谷甾醇、虫草酸[13]、腺嘌呤、尿苷[14]。
虫草素(Cordycepin)又称虫草菌素、蛹虫草菌素、3′-脱氧腺苷,是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素,是虫草的主要活性物质和特征性成分。虫草素分子式为C10H13N5O3,分子量为251 Da,碱性,针状或片状结晶。虫草素具有广泛的功效,主要包括:抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫调节、抗炎、高血脂调节、抗老化、神经保护、促进学习和记忆、抗氧化剂活性、细胞凋亡,并对类风湿关节炎产生积极影响,在治疗白血病方面已进入临床3期试验;此外,虫草素和脱氧柯福霉素联合使用治疗第二阶段非洲锥虫病已进入临床前评估[15-17]。
2015年我们首次从粉被虫草中分离出虫草素[12],目前还没有关于粉被虫草中虫草素提取的研究报道。虽然虫草素也能用化学合成的方法制取,而且在1960年Todd和Ulbricht就人工合成了虫草素,但目前的研究均存在反应所需条件较高、产率较低等问题[18-19],而虫草类真菌人工培养技术成熟,仍然是虫草素的主要来源。本实验以菌丝体虫草素得率为指标,首次对粉被虫草中虫草素的提取工艺进行了优化研究。
1 材料与方法 1.1 菌种粉被虫草GUCC8552菌株保藏于西南药用生物资源教育部工程研究中心。
1.2 培养基PDA培养基:马铃薯200.0 g切块,水煮沸30 min,过滤取汁,加入葡萄糖20.0 g,琼脂20.0 g,蒸馏水1 000 mL。
种子培养基(g/L):蔗糖10.0,葡萄糖5.0,甘油10.0,黄豆粉5.0,酵母膏1.0,磷酸二氢钾1.0,硫酸镁10.0,氯化钾0.5,七水硫酸亚铁0.01。
液体发酵培养基(g/L):蛋白胨10.0,葡萄糖10.0,蔗糖10.0,硫酸镁1.0,磷酸二氢钾1.0,磷酸氢二钾0.5。
以上培养基均在1×105 Pa灭菌30 min。
1.3 主要试剂和仪器虫草素对照品购于美国Sigma公司;其他试剂均为国产分析纯。
高效液相色谱分析仪,美国安捷伦公司;超声仪,昆山市超声仪器有限公司;电子天平,德国赛多利斯公司。
1.4 粉被虫草菌丝体的发酵制备将保存的GZUCC8552菌株转接于PDA斜面培养基上,26 ℃培养6-7 d,活化2次。用10 mL无菌水洗涤孢子,将4.5×109个孢子接入液体种子培养基中(装液量为200 mL/500 mL三角瓶),26 ℃、100 r/min恒温暗培养6 d,制得种子液。以3 mL/瓶的接种量将种子液接入灭菌的发酵培养基中(装液量为200 mL/300 mL罐头瓶),于室温(约20 ℃)静置暗培养120 d,菌丝体用蒸馏水洗涤后,60 ℃烘干,粉碎过60目筛,备用。
1.5 菌丝体中虫草素的提取精确称取粉被虫草菌粉0.1 g于50 mL具塞试管中,加一定量蒸馏水,在一定功率下常温超声提取,提取液4 000 r/min离心5 min,取上层液体经0.45 μm微孔滤膜过滤,制得提取液。实验平行3次。
1.6 单因素试验(1) 最适提取时间的筛选
以水为溶剂,在液料比20:1和超声功率200 W条件下,分别超声提取5、10、15、20、25 min,然后测定菌丝体虫草素得率,筛选粉被虫草中虫草素的最适提取时间。
(2) 最适液料比的筛选
以水为溶剂,菌丝体干粉按液料比分别为10:1、20:1、30:1、40:1、50:1,超声提取10 min,筛选粉被虫草中虫草素的最适提取液料比。
(3) 最适超声功率的筛选
以水为溶剂,液料比40:1,分别以250、300、350、400、450 W的功率提取,超声提取10 min,测定菌丝体中虫草素提取率,筛选粉被虫草中虫草素的最适提取功率。
1.7 响应面试验以单因素实验结果为基础,选取提取时间、超声功率和液料比3个因素为自变量,以菌丝体虫草素得率为响应值,采用Box-Benhnken中心组合试验设计3因素3水平的响应面分析法(Design expert 8.0.6.1)对菌丝体中虫草素提取过程进行优化,以达到最大限度提取的目的。实验因素与水平设计见表 1。
变量 Variables |
代码 Symbol |
水平 Coded levels |
||
-1 | 0 | 1 | ||
提取时间 Extraction time (min) |
A | 5 | 10 | 15 |
液料比 Liquid-to-solid ratio (V/W) |
B | 30:1 | 40:1 | 50:1 |
超声功率 Ultrasonic power (W) |
C | 350 | 400 | 450 |
参照Meng等(2014)的方法用高压液相色谱法(HPLC)测定虫草素含量[17]。色谱条件:反相C18惠杰型高效液相色谱柱,Hypersil ODS 5 μm,柱长250 mm,管径4.6 mm;流动相甲醇:双蒸水(10:90,体积比);检测波长254 nm;柱温45 ℃;流速1 mL/min;进样量20 μL。
1.9 菌丝体中虫草素得率计算虫草素得率(质量比)=虫草素质量(mg)/菌丝体质量(g)。
1.10 数据处理用SPSS 13.0和Design expert 8.0.6.1软件处理数据,运用OriginLab OriginPro 8.5作图。
2 结果与分析 2.1 时间对菌丝体中虫草素提取效果的影响在所选高效液相色谱条件下,样品虫草素与周围物质的分离情况见图 1。由图 1可以看出,粉被虫草样品中虫草素的保留时间与虫草素标准品一致;同时样品虫草素与周围物质的分离情况很好。说明实验所选HPLC条件适合虫草素的检测。
以水为溶剂,在液料比20:1和超声功率200 W条件下,分别超声提取5、10、15、20、25 min后测定菌丝体虫草素得率,结果见图 2。从图 2可以看出,随着超声时间的增加,虫草素得率呈先上升后下降的趋势,提取10 min时虫草素得率最大。因此,10 min是粉被虫草中虫草素的最适提取时间。
2.2 液料比对菌丝体中虫草素提取效果的影响以水为溶剂,菌丝体干粉按液料比分别为10:1、20:1、30:1、40:1、50:1超声提取10 min,不同液料比菌丝体中虫草素得率结果见图 3。从图 3可以看出,随着液料比的增加,虫草素得率呈先上升后下降的趋势,以液料比为40:1时虫草素得率最大。因此,40:1是粉被虫草中虫草素的最适提取液料比。
2.3 超声功率对菌丝体中虫草素提取效果的影响以水为溶剂,液料比40:1,分别以250、300、350、400、450 W的功率超声提取10 min,测定菌丝体中虫草素提取率,结果见图 4。从图 4可以看出,随着超声功率的增加,虫草素得率呈先上升后下降的趋势,以超声功率为400 W时虫草素得率最大。因此,400 W是粉被虫草中虫草素的最适提取功率。
2.4 响应面法优化粉被虫草中虫草素的提取工艺采用Box-Benhnken中心组合试验设计3因素3水平的响应面分析法,对菌丝体中虫草素提取过程进行优化,响应面分析方案及实验结果见表 2。由Design expert 8.0.6.1软件处理数据,其方差分析结果见表 3。对响应值与各个因素进行回归拟合,该模型对应的回归方程如下:
Y=6.07-0.15A+0.31B+0.069C+0.027AB-0.18AC+0.082BC-0.22A2-0.36B2-0.17C2。
序号 No. |
A | B | C | 虫草素得率 Cordycepin yield (mg/g) |
1 | -1 | -1 | 0 | 5.322 |
2 | 1 | -1 | 0 | 5.125 |
3 | -1 | 1 | 0 | 5.795 |
4 | 1 | 1 | 0 | 5.706 |
5 | -1 | 0 | -1 | 5.652 |
6 | 1 | 0 | -1 | 5.563 |
7 | -1 | 0 | 1 | 6.143 |
8 | 1 | 0 | 1 | 5.352 |
9 | 0 | -1 | -1 | 5.188 |
10 | 0 | 1 | -1 | 5.747 |
11 | 0 | -1 | 1 | 5.161 |
12 | 0 | 1 | 1 | 6.048 |
13 | 0 | 0 | 0 | 6.036 |
14 | 0 | 0 | 0 | 6.122 |
15 | 0 | 0 | 0 | 6.102 |
16 | 0 | 0 | 0 | 6.114 |
17 | 0 | 0 | 0 | 5.988 |
方差来源 Source |
平方和 Sum of squares |
df | 均方 Mean squares |
F | Pr > F |
模型 Model | 2.120 | 9 | 0.240 | 21.49 | 0.000 3 |
A | 0.170 | 1 | 0.170 | 15.48 | 0.005 6 |
B | 0.780 | 1 | 0.780 | 71.18 | < 0.000 1 |
C | 0.038 | 1 | 0.038 | 3.50 | 0.103 7 |
AA | 2.92E-03 | 1 | 2.92E-03 | 0.27 | 0.622 1 |
BB | 0.120 | 1 | 0.120 | 11.22 | 0.012 2 |
CC | 0.027 | 1 | 0.027 | 2.45 | 0.161 5 |
AB | 0.210 | 1 | 0.210 | 18.90 | 0.003 4 |
AC | 0.560 | 1 | 0.560 | 50.67 | 0.000 2 |
BC | 0.130 | 1 | 0.130 | 11.47 | 0.011 6 |
残差 Residual |
0.077 | 7 | 0.011 | ||
失拟项 Lack of fit |
0.063 | 3 | 0.021 | 6.25 | 0.054 5 |
纯误差 Pure error |
0.014 | 4 | 3.38E-03 | ||
总和 Total | 2.200 | 16 |
对二次回归方程进行方差分析,模型P < 0.01,此时回归方差模型极显著,该试验方法可靠。方程失拟项不显著,表明该回归模型与实测值能较好地拟合。回归系数R2=0.965 2 > 0.9,表明该模型相关度好。回归方程各项的方差分析表明:A、B、A2、B2均达到极显著水平,AC、C2达到显著水平。同时由F值可推断[20],在所选择的实验范围内,3个因素对虫草素提取率的影响大小依次为:液料比(B)>提取时间(A)>超声功率(C)。
响应面Y对于因素A、B、C值构成的三维空间在二维平面上的等高图可直观地反映各因素之间的相互作用。Design expert 8.0.6.1软件处理得到响应面分析结果见图 5-7。可以看出,3个三维图均呈钟型,表明本实验所选超声时间、液料比和功率3个因素的设定值范围内包含了响应极值;等高线表明超声时间与液料比之间、超声时间与超声功率之间有较强的交互作用,液料比与超声功率之间交互作用较弱。
根据所得到的模型,预测最优工艺条件:超声时间606 s、水料比45.9:1、超声功率421 W,在此条件下虫草素的得率理论上可达到6.152 mg/g。但考虑到超声仪器每次调节的幅度是50 W的实际情况,将最佳工艺修正为超声时间606 s、水料比45.9:1、超声功率400 W。在修正条件下,实际的提取率为6.136±0.011 mg/g,与理论值较为接近,且与单因素试验中各组最好的提取率均有极显著差异(P < 0.01),表明采用响应面法优化得到的提取条件参数是可靠的。
3 讨论与结论本实验用响应面法对粉被虫草中虫草素的提取工艺进行了优化研究,超声提取的最佳工艺条件为超声时间606 s、水料比45.9:1、超声功率400 W,在此条件下虫草素得率为6.136 mg/g,实验首次对粉被虫草中虫草素的提取工艺进行了研究。
虫草素是虫草中一个主要的、特征性的生物活性物质,是衡量虫草质量的指标性物质之一。目前已报道的虫草素产生菌主要是虫草属的一些种类及从其中分离得到的菌株,包括蛹虫草及其无性型蛹草拟青霉、泰山虫草、九州虫草、蝉花及其无性型蝉拟青霉、香棒虫草、虫草头孢菌、古尼虫草、新疆虫草、蝙蝠蛾被孢霉、拟黑虫草、蝙蝠蛾柱霉、克列特尼棒束孢霉、无冠构巢曲霉[16]、轮枝拟青霉[21]以及粉被虫草[17]。关于虫草素的提取工艺研究绝大多数集中于蛹虫草中虫草素的提取优化,其他种的研究很少。化学物质的提取得率反映了物质的提取效率,也可以反映出物质的含量。殷东林等(2015)测得蛹虫草中虫草素的得率为68.7 mg/g[22],这是已报道的蛹虫草中虫草素的最高含量,也是虫草中虫草素的最高含量。在其他虫草虫草素含量中,李祝等(2011)报道轮枝拟青霉中虫草素优化后得率为3.247 mg/g[21],李瑞雪等(2013)报道蝉拟青霉中虫草素得率约为2.3 mg/g[23]。我们2014年在粉被虫草中发现了虫草素,并在2015年分离到虫草素的单体。在本实验中我们测得了6.136 mg/g的含量,这一含量在所有报道虫草种类中仅次于蛹虫草,高于轮枝拟青霉和蝉拟青霉的含量。由此可见,粉被虫草是提取分离虫草素的一个很有潜力的资源品种,但是目前的主要问题在于含量不高,可以通过优化培养基或培养条件、诱变育种、寻找新种质资源等方式提高粉被虫草中虫草素的含量和产量。
虫草素的来源除了虫草等真菌的生物合成外,还有化学合成。在1960年Todd和Ulbricht人工合成了虫草素之后,又有一些学者进行了研究,但仍然存在反应条件较高、产率较低、生产成本过高等问题[18-19]。到目前为止,生物合成仍然是虫草素提取、分离的主要来源。本实验运用响应面法成功找到了粉被虫草中虫草素的最佳提取工艺,为虫草素的制取提供了有益的参考,有利于对粉被虫草的深度开发利用。
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