微生物学通报  2018, Vol. 45 Issue (6): 1283−1294

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黄程, 吴子君, 何颖慧, 石文苏, 路世娜, 孔召玉, 吴兰
HUANG Cheng, WU Zi-Jun, HE Ying-Hui, SHI Wen-Su, LU Shi-Na, KONG Zhao-Yu, WU Lan
鄱阳湖-乐安河段湿地耐Cu、Zn、Pb植物促生菌的分离、筛选及鉴定
Isolation, screening and identification of Cu, Zn and Pb resistant plant growth-promoting bacteria from Le'an River-Poyang
Lake Wetland
微生物学通报, 2018, 45(6): 1283-1294
Microbiology China, 2018, 45(6): 1283-1294
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170814

文章历史

收稿日期: 2017-10-10
接受日期: 2018-02-05
网络首发日期(www.cnki.net): 2018-03-19
鄱阳湖-乐安河段湿地耐Cu、Zn、Pb植物促生菌的分离、筛选及鉴定
黄程 , 吴子君 , 何颖慧 , 石文苏 , 路世娜 , 孔召玉 , 吴兰     
南昌大学生命科学学院 鄱阳湖环境与资源利用教育部重点实验室    江西 南昌    330031
摘要【背景】 植物促生菌因其对植物生长促进及增强抗逆性等优点在植物-微生物联合修复重金属污染土壤中具有良好应用潜力。在污染土壤中,土著植物促生菌能够更好地定殖并保证促植物生长能力的发挥。【目的】 从常年受上游多种重金属污染的鄱阳湖-乐安河段湿地分离出一批具有多种重金属抗性的优势土著植物促生菌,以期为植物-微生物联合修复重金属污染湿地提供一批优质的菌种资源。【方法】 从乐安河流域戴村受重金属污染的湿地土壤及水体中分离具有Cu、Zn、Pb抗性菌株,测定菌株的促植物生长特性[产IAA (Indole acetic acid)、溶磷、产铁载体及ACC (1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid)脱氨酶活性],挑选促生特性较好的菌株进行16S rRNA基因序列分析鉴定,并测定菌株对其他胁迫条件(抗生素、酸碱、盐)的耐受能力。【结果】 分离得到22株能够同时耐受Cu 50 mg/L、Zn 400 mg/L、Pb 800 mg/L的菌株,其中10株表现出较好的促植物生长特性,对其进行16S rRNA基因序列分析鉴定,有4株属于Ralstonia sp.,3株属于Burkholderia sp.,另3株则分别属于Cupriavidus sp.、Stenotrophomonas sp.和Novosphingobium sp.。基于这10株菌抗性特征的聚类分析及主成分分析,结果与系统发育树分析结果高度一致。【结论】 耐受多种重金属的土著植物促生菌的分离鉴定为重金属污染土壤的植物-微生物联合原位修复提供良好的微生物资源。
关键词重金属污染     植物-微生物修复     植物促生菌     抗性菌株    
Isolation, screening and identification of Cu, Zn and Pb resistant plant growth-promoting bacteria from Le'an River-Poyang
Lake Wetland
HUANG Cheng, WU Zi-Jun, HE Ying-Hui, SHI Wen-Su, LU Shi-Na, KONG Zhao-Yu, WU Lan     
School of Life Sciences, Key Laboratory of Poyang Lake Enviroment and Resource Utilization, Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang, Jiangxi 330031, China
Received: October 10, 2017; Accepted: February 05, 2018; Published online (www.cnki.net): March 19, 2018
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (41601337)
*Corresponding author: WU Lan, E-mail: ncusk724@hotmail.com.
Abstract: [Background] Plant growth-promoting bacteria (PGPB) have good potential in assisting phytoremediation of heavy metal pollution due to their advantages in promoting the growth and heavy metal-resistance of plants. In heavy metal-contaminated soils, indigenous PGPB can better colonize and exert their plant growth-promoting abilities. [Objective] Our aim is to isolate the indigenous heavy mental-resistant PGPB from the Le'an River-Poyang Lake Wetland, which has been polluted by acid mine drainage for many years, thus to provide superior microbial resources for bacterial assisted phytoremediation of heavy metal polluted wetland soil. [Methods] Cu, Zn and Pb-resistant strains were isolated from heavy metal polluted wetland soils and water in Dai cun, which is located in Le'an River. The plant growth-promoting characteristics (IAA (Indole acetic acid), phosphate solubilization, siderophore and ACC (1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid) deaminase activity) of the studied isolates were measured, and the isolates with good growth-promoting characteristics were selected and identified using 16S rRNA gene sequencing. The resistant characteristics (heavy metal, antibiotics, acid and alkali, salt) of the selected strains were also determined. [Results] A total of 22 isolates were able to grow in the presence of Cu 50 mg/L, Zn 400 mg/L and Pb 800 mg/L. Among them, 10 strains showed good plant growth-promoting characteristics. According to 16S rRNA gene sequencing, 4 strains belonged to the genus Ralstonia, 3 strains belonging to the genus Burkholderia and the other 3 strains belonged to the genera Cupriavidus, Stenotrophomonas and Novosphingobium, repectively. The numerical classification based on bacterial resistant characteristics was mostly consistent with their phylogenetic position. [Conclusion] The isolation and identification of multiple heavy mental-resistant PGPB could provide good microbial resources for in situ remediation of heavy metal contaminated soils.
Key words: Heavy metal pollution     Phyto-microbial remediation     PGPB     Resistant strain    

随着工业化、城镇化进程的快速发展,矿产资源的大量开发,各种化学产品的广泛使用,导致工业三废通过大气沉降、污水灌溉等途径进入土壤中,引起土壤重金属污染,其中尤以农田土壤的重金属污染问题日趋严重。根据2014年《全国土壤重金属污染状况调查公报》,我国约有19.4%耕地受到了重金属污染,其中1.8%和1.1%的耕地污染达到了中度和重度污染程度[1],其中大多分布在南方经济发达地区及鱼米之乡。植物修复技术,作为一种成本低、环境友好、可进行原位修复的措施在土壤重金属污染治理中表现出良好的应用前景[2]。然而,随着研究的不断深入和延伸,将这种技术大规模应用于土壤重金属的实际治理中还为时过早。单一的植物修复技术存在诸多不足之处,如重金属胁迫下植物生物量小、生长缓慢且对重金属的耐受性有限[3]等问题。植物-微生物联合修复技术利用微生物-植物的共生关系或共存关系,充分发挥结合植物修复和微生物修复技术的各自优势,提高重金属污染土壤的修复效率,表现出良好的应用潜力。

植物促生菌(Plant growth-promoting bacteria,PGPB)是一类自由生活在土壤或根系周围的有益微生物,能够缓解重金属对植物的毒害,促进植物生长并影响重金属迁移,在植物-微生物联合修复过程中发挥着重要的作用。PGPB能通过产生植物生长激素如IAA (Indole acetic acid),促进植物根系中侧根和不定根的生长,从而促进植物对环境中矿物元素和营养的吸收[4];通过产生ACC (1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid)脱氨酶能降低乙烯的前体物质ACC的浓度,从而降低植物逆境胁迫(旱涝、重金属胁迫、高盐环境等)下乙烯的浓度水平[5]。在重金属污染土壤中,部分PGPB还具有溶磷能力和产铁载体能力,将土壤中难溶性磷转化为可溶性磷,或与铁结合则形成可溶性铁-嗜铁素复合体,提高土壤中可溶性磷和铁的含量,从而促进植物更好的吸收和利用[6]。此外,PGPB还能通过根系代谢活动及其分泌物促进重金属的溶解,提高重金属在土壤中的生物有效性,促进植物对重金属的吸收与富集[7]

然而,目前利用PGPB强化植物修复重金属污染土壤的研究主要停留在修复效果的评价上,大多关注于PGPB对植物生物量、重金属累积量和土壤重金属迁移量的影响,而PGPB作为外源微生物引入对土壤原有微生物群落及其生态效应还不清楚[8]。采用植物-微生物联合技术修复土壤重金属污染,对PGPB的选择上不仅要保证其自身能在污染环境中生存繁殖,也要考虑这些菌株对生态环境可能造成的潜在危害。从污染土壤中原位分离土著PGPB强化植物修复,不仅使本土物种能够更好地适应当地特定环境,而且能够尽量避免非本土化的生态风险[9]

德兴铜矿位于江西省德兴市,是亚洲最大的露天铜矿,已有40余年的采矿历史[10]。鄱阳湖-乐安河(德兴段)是该区重要的河流,主要汇集了矿区酸性废水、尾砂库废水、居民生活污水、工业废水等,流经戴村等多个村庄,下游有大量的农田,对周边生态环境及人类健康造成严重威胁。本研究从乐安河区域受Cu、Zn、Pb等多种重金属污染严重的湿地中分离筛选获得一批具有Cu、Zn、Pb复合抗性的土著菌株。通过测定菌株的促生特性(IAA、溶磷、铁载体、ACC脱氨酶活性),进一步挑选具有较好促生能力的菌株,同时测定其抗性能力(重金属、酸碱、盐及抗生素),并基于16S rRNA基因序列及表型分析鉴定其种属。以期得到一批优势的土著植物促生菌,为进一步利用微生物-植物联合修复鄱阳湖-乐安河流域湿地重金属污染提供一批微生物资源。

1 材料与方法 1.1 培养基、主要试剂和仪器

NA (Nutrient agar)培养基[11]、CAS (Chromea zroul S)固体培养基[12]、PKO (Pikovaskaia’s)固体培养基[13]

DNA标准分子量Marker、Taq酶、PCR扩增引物,大连TaKaRa公司;其余试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。恒温培养箱振荡器购自上海智城分析仪器制造公司;PCR扩增仪购自美国Applied Biosystems;分光光度计购自上海元析仪器有限公司。

1.2 供试菌株的筛选

1.2.1 样地介绍

样品采集于江西省戴村(28°92'N,117°48'E),该地区位于乐安河(德兴段)流域,该河常年受到上游德兴铜矿酸矿废水排放等污染,流经下游村庄及大量农田。本实验选取使用乐安河水进行灌溉的表层农田土壤,沿着乐安河流域戴村地区上游至下游采集了9个土壤样品和5个水样。将样品在24 h内带回实验室进行处理。基于前期研究数据,采样区域所受到的重金属污染主要有Cu (319.50-2 435.39 mg/kg)、Zn (673.72-650.17 mg/kg)和Pb (305.89-1 110.72 mg/kg),因此后续研究选用这3种重金属筛选菌株。

1.2.2 菌株筛选

将采集的10 g土样置于100 mL灭菌生理盐水的锥形瓶中,在28 ℃、180 r/min振荡30 min,使细菌从土壤样品上充分洗脱下来,静置20 min。使用CuSO4、ZnSO4、PbNO3分别配制Cu、Zn、Pb重金属母盐溶液,无菌操作台下过0.22 μm微孔滤膜过滤除菌,吸取1 mL土壤上清液加入到含有3种重金属(Cu 10 mg/L、Zn 100 mg/L、Pb 200 mg/L)的SMS (Sucrose-minimal salts)液体培养基中[14],28 ℃、180 r/min培养72 h。再取培养液涂布到含有3种重金属浓度Cu 10 mg/L、Zn 100 mg/L、Pb 200 mg/L的SMS固体平板上,待长出菌落后,逐步提高3种重金属浓度至Cu 50 mg/L、Zn 400 mg/L、Pb 800 mg/L,依次接种到重金属浓度更高的固体平板上培养,挑选耐重金属能力最强的单菌落在平板上划线转接3次以上进行菌种纯化,并于15%甘油中-80 ℃保存,以便进行后续实验。

1.3 促生特性测定

1.3.1 产IAA能力测定

采用Salkowski比色法[15]测定IAA含量,分别配制含色氨酸溶液为0、100、250、500 µg/mL的NA液体培养基。接种待测菌株于不同处理中,置于28 ℃培养至OD600为0.6,5 500×g离心10 min,取0.5 mL上清液加入2 mL Salkowski显色剂,室温静置20 min,在540 nm波长条件下测定其OD值。通过IAA浓度与OD540的标准关系曲线计算相应的IAA浓度,每组实验重复3次。

1.3.2 溶磷能力测定

将菌株点接于PKO固体培养基上,每个平板4个重复,于28 ℃培养箱中培养3-5 d。观察PKO培养基上透明圈的出现和大小。若无溶磷圈的产生则该菌株无溶磷能力;若产生溶磷圈则测定溶磷直径(D)、菌落直径(d),根据D/d的比值大小判断菌株溶磷能力[16]

1.3.3 产铁载体能力测定

将菌株点接至CAS平板上,每个平板4个重复,28 ℃培养3-5 d。观察蓝色CAS培养基上橙黄色晕圈的出现和大小。若无橙黄色晕圈的产生则该菌株无产铁载体能力;若产生橙黄色晕圈则测定晕圈直径(D)、菌落直径(d),根据D/d的比值大小判断菌株溶磷能力。

1.3.4 产ACC脱氨酶能力测定

参照Honma等[17]的方法测定ACC脱氨酶活性,用蒸馏水作为空白对照,测定OD540值。采用Bradford比色法测定酶蛋白浓度[18]。以每分钟形成1 μmol α-丁酮酸的活性作为ACC脱氨酶的单位活性。分别选用被广泛报道的植物促生菌Pseudomnas putida UW4[19-20]与非植物促生菌P. fluorescens 17400[21]作为阳性与阴性对照。

1.4 菌株16S rRNA基因序列分析

采用CTAB法[22]提取菌体基因组DNA,PCR扩增菌株16S rRNA基因。选用通用引物27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R (5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')[23]。PCR反应体系(50 μL):DNA 2 μL,10×Buffer 5 μL,MgCl2 (25 mmol/L) 3 μL,dNTPs (10 mmol/L) 1 μL,引物27F和1492R (10 μmol/L)各1 μL,Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL。PCR反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,35个循环;72 ℃ 5 min。将PCR产物送交生工生物工程(上海)股份有限公司测序,将所得基因序列提交GenBank数据库比对并获得序列号(表 1)。

表 1 菌株GenBank登录号 Table 1 GenBank accession numbers of strains
菌株编号
Strain code
登录号
Accession No.
S4-3 KY357351
S6-4 KY357348
S6-9 KY357356
S6-12 KY357355
S6-13 KY357350
S8-1 KY357352
S9-7 KY357353
S9-15 KY357354
W1-18 KY357349
W4-18 KY357347
1.5 菌株的抗性能力测定

1.5.1 重金属抗性测定

将通过高压蒸汽灭菌的SLP (Sucrose-minimal salts lowphosphate)[24]培养基和在无菌操作台下过0.22 μm微孔滤膜过滤除菌的重金属盐母液混匀,倒平板。配制重金属浓度范围为Cu 10-200 mg/L,Zn 1 000-6 000 mg/L,Pb 300-800 mg/L。以不添加任何重金属的SLP培养基为对照。吸取5 µL菌液点接于不同处理的培养基中,28 ℃恒温培养,观察是否有菌落生成并记录重金属对菌株的最小抑制浓度(Minimum inhibition concentration, MIC)。

1.5.2 抗生素抗性测定

将菌株分别接种到添加了四环素、链霉素、氨苄青霉素、氯霉素和萘啶酮酸(0.22 μm微孔滤膜过滤除菌)的NA液体培养基中,抗生素浓度范围为10-1 000 mg/L,置于28 ℃恒温培养,观察生长状况并记录抗生素对菌株的MIC。

1.5.3 耐盐能力测定

分别配制含NaCl浓度1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%的NA液体培养基,将菌株接种在不同浓度NaCl的NA培养基上,置于28 ℃恒温培养观察生长状况并记录数据。

1.5.4 耐酸碱能力测定

设置pH分别为4.0、5.5、7.2、9.0、11.0的NA液体培养基,用1 mol/L的HCl或NaOH调至设定值,经过高温灭菌后再次调节pH至设定值。将活化好的菌株接种至不同pH的NA液体培养基中,28 ℃恒温培养观察生长状况并记录数据。

1.6 数据处理

使用Microsoft excel 2010和SPSS 20统计软件进行数据处理,差异性分析采用Duncan-test法进行运算。采用NTSYS-pc 2.1对菌株抗性进行分析,用非加权配对算术平均法(Unweighted pair group mean average,UPGMA)生成聚类分析图。使用MEGA 7按照Neighbor-Joining法将分离菌株和参比菌株构建基于16S rRNA基因的系统发育树。使用DNAMAN对测序序列与参比序列进行序列相似性比较。使用Canoco 5对菌株促生特性和抗性进行主成分分析。

2 结果与分析 2.1 菌株筛选

在第1次分离浓度(Cu 10 mg/L,Pb 200 mg/L,Zn 100 mg/L)下,从所有样品中分离出210株耐受菌株,逐步提高重金属浓度至第3次分离浓度(Cu 50 mg/L、Pb 800 mg/L、Zn 400 mg/L)下有22株菌能够生长。其中水体样品分离到4个菌株,土壤样品分离到18个菌株。

2.2 促生特性测定

将分离得到的22株菌进一步进行促植物生长特性的测定,其中有10株菌表现出较好的促植物生长特性(表 2),选择这10株菌进行后续研究。

表 2 10株菌的植物促生特性 Table 2 Plant growth promoting characteristics of 10 selected isolates
菌株编号
Strain code
IAA产量
IAA production (μg/mL)
溶磷
Phosphate-solubilizing
铁载体
Siderophores
ACC脱氨酶
ACC Deaminase
0 μg/mL
Try
100 μg/mL
Try
250 μg/mL
Try
500 μg/mL
Try
S4-3 1.61±0.07b 9.44±1.37a 19.05±2.57bc 42.92±6.90ab - - -
S6-4 1.50±0.28b 3.56±1.00c 15.77±1.65c 38.09±2.75b 1.45±0.02b - 0.63±0.03c
S6-9 0.71±0.07c 9.56±2.81a 38.36±4.17a 45.50±0.60a 1.55±0.14b - 0.66±0.01c
S6-12 1.82±0.23b 11.38±0.48a 24.30±2.02b 40.67±2.95ab - - 0.68±0.01c
S6-13 0.95±0.12c 5.89±1.68b 21.18±5.66bc 39.38±8.49ab 1.40±0.05b - 0.59±0.02c
S8-1 0.97±0.29c 2.12±0.10cd 3.27±0.32d 12.09±2.05d - 1.71±0.04 1.11±0.02b
S9-7 0.89±0.20c 3.20±0.86c 17.58±4.84c 27.89±2.47c - 1.69±0.03 0.26±0.02d
S9-15 - - - - - 1.48±0.09 1.10±0.03b
W1-18 0.79±0.46c 1.39±0.17cd 2.86±0.78d 6.92±1.79d - - 2.27±0.22a
W4-18 0.58±0.07c 1.77±0.73cd 2.94±0.16d 6.92±1.79d 1.99±0.34a - 0.62±0.13c
UW4 1.49±0.07b 1.95±0.17cd 2.95±0.15d 5.02±0.46e - - 2.35±0.02a
17400 2.54±0.31a 3.13±0.04c 4.53±0.41d 6.33±0.46d - - -
注:-:菌株无该能力;Try:色氨酸.
Note: -: Strains do not have this ability; Try: Tryptophane.

2.2.1 产IAA能力

分别在不同色氨酸浓度测定菌株IAA的产量。10株菌中9株菌具有产生IAA的能力,且随着色氨酸浓度的增加IAA产量都呈现升高趋势,其中S9-15不产生IAA。菌株S4-3、S6-9、S6-12在不同色氨酸浓度下IAA的产量均较高,在500 μg/mL的色氨酸浓度下IAA产量均大于40 μg/mL;菌株S8-1、W1-18、W4-18在不同色氨酸浓度下产IAA能力相对较弱,在500 μg/mL的色氨酸浓度下W1-18产IAA能力最弱(表 2)。

2.2.2 溶磷能力

10株菌中只有4株菌具有溶磷能力,分别为S6-4、S6-9、S6-13、W4-18。这4株菌的溶磷能力相差不大,D/d的比值范围均在1-2之间(表 2)。

2.2.3 产铁载体能力

10株菌中只有3株菌具有产铁载体的能力,分别为S8-1、S9-7、S9-15,其D/d比值为1.71、1.69、1.48 (表 2)。

2.2.4 ACC脱氨酶活性

10株菌中有9株菌表现出ACC脱氨酶的活性,只有S4-3没有表现出ACC脱氨酶的活性(表 2)。与阳性菌株UW4比较,菌株ACC脱氨酶活性较低,只有W1-18与UW4酶活力表现相当。

2.3 16S rRNA基因序列分析

对10株具有较好植物促生特性的菌株进行16S rRNA基因片段扩增,将PCR产物测序,并提交GenBank与序列相似性较高的模式菌株进行序列比对,构建系统发育树(图 1)。结果显示,10株菌分布于5个属,4株为劳尔氏菌属(Ralstonia sp.)、3株为伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)、1株为嗜铜菌属(Cupriavidus sp.)、1株寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)和1株新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium sp.)中。菌株S6-4、S6-9、S6-13、W1-18同属于Ralstonia sp.,其中S6-4与R. pickettii ATCC 27511T在同一个分支,其相似性为99.78%,菌株S6-9、S6-13、W1-18与R. mannitolilytica CSIB3-10 KU305707T属于一个分支,3株菌与参比菌株的相似性均大于99.7%。菌株S8-1与B. cepacia ATCC 25416T的相似性为99.93%,S9-7和S9-15与B. seminalis R-24196T相似性均大于99.6%。菌株S6-12、S4-3、W4-18与其所在分支中参比菌株C. necator N-1TS. maltophilia McS10TN. capsulatum D16147T的相似性分别为99.69%、99.93%、99.10%。

图 1 基于16S rRNA基因的系统发育树 Figure 1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene
2.4 抗性分析

2.4.1 重金属抗性

筛选的菌株对Cu、Zn、Pb均有一定耐受性。其中W4-18对Cu的耐受能力最强,可耐受Cu浓度为200 mg/L。菌株S8-1、S9-7、S9-15对Zn和Pb均表现出最强的耐受能力,分别可以耐受Zn的浓度为800 mg/L,耐受Pb的浓度为6 000 mg/L (表 3)。

表 3 分离菌株的重金属、抗生素、酸碱和盐耐受的最小抑制浓度(MIC) Table 3 Minimum inhibition concentration (MIC) of heavy metals, antibiotics, acid/alkali resistance and salt tolerance of the isolated strains
菌株编号
Strain code
重金属最小抑制浓度
MIC of heavy metals (mg/L)
抗生素最小抑制浓度
MIC of antibiotic (mg/L)
pH NaCl inhibit concentration (%)
Cu Zn Pb 四环素
Tc
氨苄青霉素
Amp
氯霉素
Cm
链霉素
Str
萘啶酮酸
Nal
S4-3 75 1 200 400 - 800 - > 1 000 - 5.5-9.0 3.0
S6-4 75 2 400 500 - 800 50 800 - 5.5-7.2 2.0
S6-9 100 2 800 500 - 1 000 50 1 000 - 5.5-7.2 2.0
S6-12 30 2 000 500 - - - 300 - 5.5-7.2 3.0
S6-13 100 2 400 500 50 800 - 500 - 5.5-7.2 3.0
S8-1 75 > 6 000 800 50 > 1 000 - > 1 000 - 4.0-7.2 2.5
S9-7 150 > 6 000 800 50 > 1 000 - > 1 000 - 4.0-7.2 1.5
S9-15 150 > 6 000 800 50 > 1 000 - > 1 000 50 4.0-9.0 3.0
W1-18 100 1 200 400 - 800 50 300 100 5.5-7.2 3.0
W4-18 200 1 800 600 - 800 50 - - 5.5-9.0 4.0
注:-:菌株不能正常生长;> :菌株在更高浓度下仍能生长.
Note: -: The strains are unable to grow well; > : The strains are able to grow at a higher concentration than that used.

2.4.2 抗生素抗性

菌株对不同抗生素的耐受能力差异较大,普遍对氨苄青霉素和链霉素具有较强的抗性,而对四环素、氯霉素和萘啶酮酸的抗性较弱。在氨苄青霉素和链霉素抗性测定中,9株菌均表现出抗性,其中S8-1、S9-7、S9-15对这2种抗生素能耐受最高浓度1 000 mg/L (表 3)。在四环素、氯霉素、萘啶酮酸处理下,分别有4、3、2株菌能存活,且MIC值也较低。

2.4.3 耐酸碱能力

将菌株接种在pH 4.0-11.0的培养基中,在pH 5.5-7.2的培养基中菌株均能正常生长,在pH 4.0时菌株S8-1、S9-7、S9-1能够生长。在pH 9.0时菌株S4-3和S9-15能够生长,而在pH 11.0时,所测定菌株均不能正常生长(表 3)。由此可知,10株菌普遍能在偏酸的环境下生长。

2.4.4 耐盐能力

将菌株接种至盐浓度1%-5%的培养基下观察,6株菌能在3%盐浓度下生长,而在4%的盐浓度下只有菌株W4-18能生长(表 3)。

2.5 菌株抗性聚类分析

使用NTSYS-2.0对菌株抗性数据进行分析,得到10株菌聚类树状图。以相似系数0.76为阈值,可以将10株菌分为4个类群,其中Ralstonia sp. S6-4、S6-9、S6-13、W1-18和Cupriavidus sp. S6-12组成分支1;Burkholderia sp. S8-1、S9-7、S9-15构成分支2;Stenotrophomonas sp. S4-3与Novosphingobium sp. W4-18分别形成独立的分支(图 2)。除菌株S6-12之外,各菌株基于抗性特征的聚类情况与其系统发育地位均表现一致(图 1)。

图 2 基于10株菌抗性UPGMA聚类树图 Figure 2 UPGMA clustering tree based on the resistant characteristics of the 10 selected strains
2.6 菌株抗性主成分分析(Principal components analysis,PCA)

PCA图 3中可知一二轴的解释率分别为36.08%和27.11%,10株菌分为5类。其中Ralstonia sp. S6-4、S6-9、S6-13、W1-18聚在一起,Burkholderia sp. S8-1、S9-7、S9-15聚为一类。Stenotrophomonas sp. S4-3、Cupriavidus sp. S6-12和Novosphingobium sp. W4-18则单独聚为一类。这一结果与各菌株在系统发育树上的聚类情况完全吻合(图 3)。另外可知,Burkholderia sp. S8-1、S9-7、S9-15受Pb、Te、Zn的影响较大,而Ralstonia sp. S6-4、S6-9、S6-13与W1-18则受Str影响较大。

图 3 基于菌株抗性主成分分析 Figure 3 Principal component analyses of resistant characteristics of the 10 selected strains 注:pH+:pH 9.0时菌株生长状况;pH-:pH 4.0时菌株生长状况. Note: pH+: The growth of strains at pH 9.0; pH-: The growth of strains at pH 4.0.
3 讨论与结论

重金属可以通过多种方式对微生物产生毒性作用,影响其体内的各种代谢活动[25]。为适应重金属污染的环境,部分微生物在长期的进化过程中形成一系列解毒机制,逐渐具备了对有毒重金属的耐受性或抗性[26]。例如,胞外金属离子内流、胞内的隔离作用和解毒作用以及促进金属离子外流和对胞内金属的转化作用等[27]。通常情况下,从受重金属污染的环境中更容易分离筛选到能够耐受重金属的菌株[28-29]。本研究从常年受重金属污染的鄱阳湖-乐安河流域湿地中分离得到22株对Cu、Zn、Pb 3种重金属具有复合抗性的菌株。Jiang等[24]筛选出一株对Pb和Cd表现出较高抗性的菌株Burkholderia sp. J62,其在Pb (1 000 mg/L)、Cd (2 000 mg/L)、Cu (100 mg/L)和Zn (400 mg/L)的SLP培养基中生长良好。与之比较,本研究中菌株的Pb2+ (400-800 mg/L)抗性略小;但均表现出更高的Cu2+和Zn2+抗性。

重金属污染环境中分离筛选的抗性菌株大都能表现出良好的促植物生长特性,例如具有ACC脱氨酶、溶磷作用、产生IAA、铁载体等[30]。王璐等[31]从铜矿废弃地分离出2株Cu耐受性菌株,均表现出ACC脱氨酶活性、溶磷和IAA等促生特性。Navarro-Torre等[32]从重金属高污染地区分离出48株细菌,其中大部分菌株能表现出多种重金属抗性,所有菌株均具有促植物生长特性。本研究的10株菌中9株菌具有产IAA和ACC脱氨酶的能力;7株菌有3种促生特性,表明这些菌株可能具有较好的促植物生长或提高植物胁迫的潜力。这些研究表明,常年受到重金属污染的环境可能存在大量的同时具有重金属耐受性和促植物生长特性的土著优势菌株,是一个潜在的可用于重金属污染修复的微生物资源库。

通过系统发育树可知,10株菌中有4株为劳尔氏菌属(Ralstonia sp.)、3株伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.),这两个属占鉴定菌株的大多数(70%)。有研究报道,这两类菌在不同重金属污染下分布较为普遍,且能表现出不同的促植物生长特性[33]。如Jiang等[24]从重金属污染的土壤中筛选获得一株伯克霍尔德氏菌Burkholderia sp. J62,具备溶磷、产铁载体和IAA等促生特性。接种该菌到玉米和番茄与对照相比,能显著增加植物生物量。本研究鉴定出的3株菌分别为嗜铜菌属(Cupriavidus sp.)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium sp.)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)。有研究表明,陈雯等[34]从胡杨林根际土壤中分离出菌株Cupriavidus sp. N8,该菌株对3种重金属(Cu、Ni、Pb)表现出复合抗性,且在Cu和Zn的胁迫下,接种该菌的竹柳生物量比对照组显著增加。Pereira等[35]的研究中新鞘氨醇杆菌属Novosphingobium sp. 1A8是分离的耐受3种重金属(Cd、Zn、As)的菌种中复合抗性最高的革兰氏阴性菌之一;寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)在废水处理、污染水体修复及降解有机农药等方面也均表现出实际应用的潜力[36]

本研究中具有3种重金属抗性的菌株普遍能表现出对其他胁迫条件的耐受能力,例如抗生素、酸碱、盐。这一结果表明,重金属胁迫条件能够诱导菌株中协同调控机制的运行[37]。例如,重金属离子能够协同调控抗生素抗性基因,进而降低菌株对抗生素的敏感度。de la Iglesia等[38]研究认为,抗生素抗性基因的丰度与抗生素以及As、Cu等重金属污染程度显著相关,表明As、Cu等重金属和抗生素的复合污染可以增加环境中抗性基因的丰度。陈光村[39]的研究表明,外界压力(高温、低pH和一定的渗透压下)显著增加生物膜分泌更多的胞外物质,与游离态P. putida CZ1相比,其生物膜存在下对Cu、Zn的抗性分别增加2倍和8倍。

基于菌株抗性特征(重金属、抗生素、pH及盐)结果进行聚类及PCA分析,发现通过这些表型特征能将大部分菌株很好地区分开,且与各菌株相对应的系统发育地位高度一致。数值分类是一种被广泛应用的细菌分类方法,其根据细菌生理生化指标的相似性来判断细菌种属间的亲缘性。本研究结果表明,对于重金属抗性菌株,利用其不同抗性指标进行数值分类或许也是一个很好的鉴定方法。本研究中,劳尔氏菌属(Ralstonia sp.)和伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)与其他种属菌株表现出的抗性差异主要体现在对Zn、Pb、四环素、氨苄青霉素和链霉素的抗性上。因此,借助抗性指标对细菌进行分类鉴定,能够在生理生化水平上为菌株鉴定提供更多信息。然而,基于生理生化指标鉴定菌株的结果有时与分子遗传学手段鉴定结果不一致。例如,基因水平转移(Horizontal gene transfer,HGT)会导致某些基因引入新的宿主,赋予其新的表型和生物功能[40]。随着现代分子生物学技术的发展,16S rRNA基因测序具有快速、简便、灵敏等优点受到广泛使用,但其理论程度较高,影响因素也较多,对操作者要求很高[41]。因此在对菌株种属鉴定时,应采用多种方法相结合的方式,互相弥补、互相印证。

本研究通过从重金属污染土壤和水体中筛选出了一批具有Cu、Zn、Pb复合抗性和多种促植物生长特性的菌株。在实际利用植物-微生物联合修复重金属污染土壤时,PGPB对植物生长的实际应用效果是检验该菌促植物生长的重要标准,对构建植物-微生物联合体起着至关重要的作用[42]。因此,在后续研究拟将进行植物盆栽实验观察菌株的实际促植物生长效果。另外,选取不同植物进行菌株促植物生长实验,以期得到最好的植物-微生物联合体,提高对重金属污染土壤的修复效率。

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