接合菌在自然界广泛腐生于土壤、动物粪便、动植物残体、水果、花、蘑菇和谷粒，部分类群可寄生或共生于植物和动物，甚至其他真菌(包括其他接合菌)。接合菌类真菌在工业、食品业、医药业和农业生物防治等方面扮演着重要的角色^[1-4]。部分接合菌是不可忽视的有害菌，会导致人和牲畜患接合菌病^[5-7]。根据“生命目录”的记载，目前全世界报道过且现存的接合菌总计1 334种(http://www.catalogueoflife.org/)，我国大约333种(参考郑儒永和刘小勇编著的《壶菌、接合菌、球囊霉》，正在排版中)，而西藏零星报道过的接合菌总计20种，其系统调查研究几乎还是空白，大量潜在的物种需要分离、鉴定、认识和开发^[8]。本研究对采集自西藏各地区代表县的样品进行菌种分离、形态鉴定和分子验证，然后进行生物多样性统计分析，从而了解西藏地区的接合菌物种多样性和生物资源现状，为该地区有害接合菌的控制和有益接合菌的开发利用奠定科学基础。

1 材料与方法 1.1 样品来源

2012-2015年总计采集701个样品，包括土壤、动物粪便、花、叶、果实等。采集自西藏所有7个地区或地级市的19个县：拉萨市(当雄县、墨竹工卡县)、那曲地区(班戈县、比如县、双湖县)、昌都市(八宿县、察雅县、江达县)、山南市(浪卡子县、曲松县)、日喀则市(定结县、亚东县)、阿里地区(措勤县、普兰县)和林芝市(波密县、工布江达县、林芝县、米林县、墨脱县) (表 1)。

1.2 主要试剂和仪器

Goldview Ⅰ型核酸染料，北京索莱宝科技有限公司；2×EsTaq Master Mix、康为世纪(CWBIO)新型植物基因组DNA提取试剂盒，康为世纪生物科技有限公司。

磁力搅拌机，艾卡(广州)仪器设备有限公司；电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；生化培养箱，宁波海曙赛福实验仪器厂；实体显微镜，株式会社尼康(Nikon Corporation)；电泳仪，北京东林昌盛生物科技有限公司；凝胶成像仪，北京君意东方电泳设备有限公司；蔡司正置显微镜，卡尔·蔡司公司(Carl Zeiss AG)；基因扩增仪，杭州柏恒科技有限公司。

1.3 培养基

PDA (g/L)：马铃薯200.00，葡萄糖20.00，琼脂15.00。0.1% PDA (g/L)：马铃薯0.20，葡萄糖0.02，琼脂15.00。MEA (g/L)：麦芽提取物20.00，琼脂15.00。0.1% MEA (g/L)：麦芽提取物0.02，琼脂15.00。

1.4 物种鉴定

1.4.1 菌株分离和形态鉴定

菌株分离采用稀释平板法^[9]。从采集于同一县的所有样品中分别取出5 g，放入大烧杯中人工混匀。从混匀的样品中称取5 g，加入500 mL的无菌蒸馏水，室温下以200 r/min的转速在磁力搅拌机上剧烈搅拌10 min，吸取200 μL悬浮液滴在表面干燥的9 cm平皿PDA、0.1% PDA、MEA、0.1% MEA培养基上，用玻璃珠涂布。倒置于5、25和45 ℃的生化培养箱中进行培养。培养2 d后在实体显微镜下观察，将可见菌落切块转移至相应培养基的6 cm平皿中于相应温度进一步培养。菌落成熟后，挑取菌丝制作玻片，在正置显微镜下进行形态观察，综合菌落、孢囊梗、囊托、孢子囊、囊轴以及孢囊孢子等形态特征数据，依据接合菌权威专著进行初步的形态学分类鉴定^[10-13]。

1.4.2 菌种纯化方法

对形态鉴定为接合菌的菌株采用单孢法进行纯化。挑取孢子囊，放入含1 mL无菌水的试管中，剧烈振荡使孢囊壁消解或破裂释放出孢囊孢子，振荡混匀制成孢子悬浮液。吸取100 μL孢子悬浮液，移入新的含900 μL无菌水的试管中稀释。连续稀释到10^-3-10^-6倍，各吸取100 μL的孢子悬浮液，滴入含有抗生素(50 μg/mL氨苯青霉素，50 μg/mL硫酸链霉素)的PDA培养皿中，用3 mm玻璃珠旋转涂布均匀，室温倒置培养12 h，选取各个单菌落之间能够有效分离的稀释倍数，即合适稀释倍数进行正式分离培养。本研究的合适稀释倍数为10^-5倍，正式培养12 h后，每隔3 h在体视显微镜下观察培养皿中孢子萌发情况，寻找萌发的单个孢子并标记位置。切取单孢菌落的培养块，转至PDA冷冻管中继续培养成熟，加10%无菌甘油于4 ℃保藏备用。

1.4.3 菌体DNA提取

采用康为世纪(CWBIO)新型植物基因组DNA提取试剂盒，参考其产品使用说明提取细胞总DNA。菌体接种于MEA固体培养基上，室温下培养7–10 d后，用刀片轻轻刮取培养基表面的菌丝，置于灭菌的离心管中，加入少量的石英砂研磨。研磨后加入Buffer LP1 400 μL和RNase A 6 μL振荡1 min，室温下放置10 min充分裂解。加入Buffer LP2 130 μL，振荡1 min混匀。12 000 r/min离心5 min，将上清液转移至新的离心管中。再加入Buffer LP3 750 μL，充分混匀。将上述所得悬浮液全部加入到已装有收集管的吸附柱中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12 000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。向吸附柱中加入Buffer GW 500 μL，12 000 r/min离心1 min进行清洗，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。重复清洗步骤一次。12 000 r/min离心2 min，倒掉收集管中的废液。吸附柱在室温下放置10 min以彻底晾干。将吸附柱放于一个新的离心管中，向吸附膜中间部位滴加Buffer GE或无菌水100 μL，室温下放置5 min，12 000 r/min离心1 min，收集DNA溶液，于-20 ℃保存备用。

1.4.4 核糖体DNA的PCR扩增及测序

通用引物对采用NS5 (5'-AACTTAAAGGAAT TGACGGAAG-3')和LR5 (5'-TCCTGAGGGAAACT TCG-3')^[14]，该引物对扩增的DNA片段包括核糖体DNA小亚基(SSU rDNA)的3'端部分序列、内转录间隔区(ITS rDNA)全部序列以及大亚基(LSU rDNA) 5'端部分序列。25 μL的PCR反应体系：2×Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(5 μmol/L)各1 μL，稀释10倍的DNA模板3 μL，无菌水7.5 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，33个循环；72 ℃ 10 min。

取3 μL的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液为1×TAE，电泳后在凝胶成像紫外光下检测。电泳检测合格的PCR产物样品由上海美吉生物医药科技有限公司北京分公司和北京六合华大科技股份有限公司进行测序。为了双向测序能够有较多的重叠区域，测序引物除NS5和LR5之外，在区间内增加两个引物，分别为ITS4 (5'-TTCT CCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5 (5'-GGAAGTAA AAGTCGTAACAAGG-3')^[14]。

1.4.5 分子鉴定和系统发育分析

利用软件Geneious 8.1 (http://www.geneious.com)对测序结果进行自动拼接和人工校正^[15]，然后在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行BLAST比对，以序列覆盖度90%和相似性97%作为参考阈值。以草酸青霉(Penicillium oxalicum)为外群，使用PAUP 4.0b10软件采用邻接法(Neighbour-Joining method)构建系统发育树^[16-17]，最后用自举法(Bootstrap)重复1 000次对系统发育树上的分支进行统计学检验。

1.5 多样性分析

依据接合菌各菌株的形态和分子鉴定结果，以县为单位，按菌株数、物种数和属数从多到少进行统计，最后综合以上数据，通过香农(Shannon)多样性指数(H')、辛普森(Simpson's)多样性指数(D)和均匀度指数(E)分析西藏地区接合菌生物多样性^[18]。

P_i表示第i种的多度比例，N_i表示第i种的菌株数量，N表示菌株数的总和，S为群落中的总物种数。

1.6 优势属种和稀有属种分析

优势属种和稀有属种分析主要按照吴雪梅^[19]的标准进行，属内物种数量占所有属整体物种数量的百分比≥10%的为优势属，1%–10%为常见属，≤1%为稀有属；物种内菌株数量占所有物种整体菌株数量的百分比≥10%的为优势种，1%–10%为常见种，≤1%为稀有种。

2 结果与分析 2.1 西藏接合菌物种鉴定

研究共获得871株接合菌，基于形态观察进行初步鉴定，选取了各属种代表性菌种共367株测定SSU、ITS、LSU rDNA序列，于GenBank中进行BLAST相似性搜索。形态和分子结合鉴定出10属：犁头霉属(Absidia)、放射毛霉属(Actinomucor)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、被孢霉属(Mortierella)、毛霉属(Mucor)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、共头霉属(Syncephalastrum)、伞形霉属(Umbelopsis)、接霉属(Zygorhynchus)。

在物种等级上鉴定出26种，其中5个种曾经在西藏有过报道，21个物种是西藏新记录。西藏有报道过的5个物种分别是：雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、总状毛霉(M. racemosus)、多变根毛霉(Rhizomucor variabilis)和葡酒色伞形霉(Umbelopsis vinacea)。西藏新记录的21个种分别是：灰绿犁头霉(Absidia glauca)、绮丽小克银汉霉(Cunninghamella elegans)、高山被孢霉(Mortierella alpina)、类变形被孢霉(M. amoeboidea)、长形被孢霉(M. elongata)、球孢高山被孢霉(M. globalpina)、无色被孢霉(M. hyalina)、英杜被孢霉(M. indohii)、詹金氏被孢霉(M. jenkinii)、沃尔夫被孢霉(M. wolfii)、灰褐毛霉(Mucor brunneogriseus)、易脆毛霉(M. fragilis)、暗色毛霉(M. fuscus)、冻土毛霉(M. hiemalis)、铅色毛霉(M. plumbeus)、刺状毛霉(M. spinosus)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、匍枝根霉(R. stolonifer)、总状共头霉(Syncephalastrum racemosum)、长白山伞形霉(Umbelopsis changbaiensis)和莫氏接霉(Zygorhynchus moelleri)。

在21个西藏新记录中有4个种在中国属首次记载，即中国新记录，分别是：类变形被孢霉(Mortierella amoeboidea)、球孢高山被孢霉(M. globalpina)、灰褐毛霉(Mucor brunneogriseus)和暗色毛霉(M. fuscus)。

2.2 各县接合菌多样性指数

各县之间的接合菌组成存在差异，将分离纯化所获得的871株接合菌以县为单位，按菌株数从多到少进行统计(表 2)。排在前4位的分别是八宿县(119株)、林芝县(116株)、波密县(110株)和当雄县(110株)。排在最后4位的分别是江达县(4株)、比如县(4株)、班戈县(2株)和定结县(2株)。

在物种水平上从多到少依次为(图 1)：波密县、八宿县、当雄县、墨脱县、林芝县、工布江达县、米林县、浪卡子县、墨竹工卡县、措勤县、曲松县、亚东县、普兰县、双湖县、江达县、比如县、定结县、班戈县、察雅县。

与物种排序相比，在属水平上次序稍有不同(图 1)，比如工布江达县(6属)由物种水平的并列第5位上升到属水平的并列第1位，米林县(5属)由物种水平的并列第5位上升到属水平的并列第2位，普兰县(4属)由物种水平的并列第7位上升到属水平的并列第3位。

综合以上菌株、物种和属级数据，西藏地区各代表县的接合菌多样性香农指数、辛普森指数以及均匀度指数见表 3。多样性指数排在前4位的分别是波密县、米林县、当雄县和八宿县。由于班戈县、察雅县和定结县获得的菌种单一，菌株数量少，因此无法计算其多样性指数。

2.3 优势属与常见属

西藏接合菌优势属(表 4)包括被孢霉属(Mortierella，30.8%)与毛霉属(Mucor，30.8%)，两属物种累计占总种数的61.6%；其余为常见属，包括根霉属(Rhizopus，7.8%)、伞形霉属(Umbelopsis，7.8%)、犁头霉属(Absidia，3.8%)、放射毛霉属(Actinomucor，3.8%)、小克银汉霉属(Cunninghamella，3.8%)、根毛霉属(Rhizomucor，3.8%)、共头霉属(Syncephalastrum，3.8%)和接霉属(Zygorhynchus，3.8%)。

2.4 优势种、常见种与稀有种

西藏接合菌(表 5)的优势种3个，包括匍枝根霉、高山被孢霉及冻土毛霉，分布于33个县，其小计菌株数占西藏所有菌株数的百分比为55.30%。常见种9个，包括总状毛霉、无色被孢霉、易脆毛霉、卷枝毛霉、少根毛霉、美丽放射毛霉、暗色毛霉、铅色毛霉及长形被孢霉，分布于45个县，其小计菌株数占西藏所有菌株数的百分比为42.51%。稀有种包括14个，分别是詹金氏被孢霉、莫氏接霉、葡酒色伞形霉、总状共头霉、刺状毛霉、多变根毛霉、灰褐毛霉、灰绿犁头霉、类变形被孢霉、绮丽小克银汉霉、球孢高山被孢霉、沃尔夫被孢霉、英杜被孢霉及长白山伞形霉，分布于16个县，其小计菌株数占西藏所有菌株数的百分比为2.19%。

3 讨论与结论 3.1 西藏接合菌物种多样性分析

西藏远离海洋，地域辽阔，海拔差异大，地形复杂，植被多样，孕育着丰富的自然资源，包括种类繁多的真菌资源^[8]。物种多样性是群落的重要特征，反映群落的丰富程度，同时也是群落环境演变、种群入侵与扩散、竞争作用等生态过程共同作用的结果。本次西藏19个代表县接合菌多样性初步分析结果表明，受海拔、气候和植被等因素的影响，各县之间接合菌物种丰度截然不同(表 2)。其中，波密县物种丰度最高，可能与海拔低、受印度洋暖流影响而形成典型的高原温暖半湿润气候和丰富的植物资源等因素有关；但同样受印度洋暖流影响且海拔更低的墨脱县的物种丰度却不高，可能是与分离源数量较少有关，今后需要增加采集样品的数量；定结县海拔较高，达4 500 m，属于半干旱气候，植物资源单调可能影响接合菌物种丰度，在本研究中是物种丰度最少的地区。

在本次研究中，波密县的香农多样性指数和辛普森多样性指数最高(2.181、0.847)，其次是米林县(1.667、0.797)，说明波密县和米林县的物种多样性高，不止一个居群。而班戈县、察雅县和定结县的香农多样性指数与辛普森指数均为零，说明这3个县的群落中只有一个物种一个居群存在。多样性指数高的波密县和米林县都属于藏东南植被茂盛的地区，而多样性指数为零的班戈县、察雅县和定结县均属于藏西北高海拔植被较为单一的地区，这一研究结果符合已经报道过的西藏生物多样性由东向西随降雨量和气温的变化而降低、沿藏东南到藏西北海拔梯度随草地寒旱程度的逐步加剧生物物种丰度总体上趋于显著下降的基本趋势^[20-21]。

均匀度代表一个群落或生境中全部物种个体的分配状况，从群落演替的方面来说，均匀度指数越高，群落越稳定。在本次研究中，普兰县的均匀度指数最高，为0.995，初步说明普兰县的生物群落稳定性最高；其次是江达县和米林县，分别为0.946、0.931；均匀度指数最低的是亚东县，仅为0.289，说明亚东县的生物群落稳定性较低。由于本次只是初步探索性研究，取样的随机性较大，得出的结论也仅仅是初步的，还需要更为严谨地取样策略和深入全面的研究才能得到关于西藏各地区生物群落稳定性的相关结论。

3.2 稀有类群

通过对所得西藏接合菌各物种内的菌株数量及其分布地区的统计分析，明确了3个优势种、9个常见种和14个稀有种(表 5)。多数稀有种都是只在1个县仅发现1株，分布范围和生存数量都极其有限，在西藏脆弱的自然环境中很容易陷入濒危或灭绝，从这个角度考虑，应对全球气候变化和过度放牧、保护已经相当脆弱的西藏生态环境是件十分紧迫和重要的任务^[22-23]。稀有物种占比超过50% (14/26)这一事实也提示我们，应该加大对西藏生物资源的调查、保藏和保护力度，在本研究的基础上应该加大后续全面的普查工作，争取发现更多的稀有物种，保藏稀有物种的更多的菌株。

本研究分离到了西藏已报道过的多变根毛霉(Rhizomucor variabilis)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、总状毛霉(Mucor racemosus)^[24]和葡酒色伞形霉(Umbelopsis vinacea)^[25]，但卵孢两型毛霉(Ambomucor ovalisporus)^[7]、矮伞形霉(Umbelopsis nana)^[26]、灰色小克银汉霉(Cunninghemella bertholletiae)^[27]等种则没有被分离到。本次未分离到的3个种，很有可能不是广泛分布，推测也属于稀有物种。

致谢: 感谢中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室郭良栋课题组的郑勇副研究员在数据分析方面给予的帮助，感谢密歇根大学William Davis博士对英文内容的修订。