2018, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 刘琴英, 刘国红, 王阶平, 车建美, 陈倩倩, 刘波
- LIU Qin-Ying, LIU Guo-Hong, WANG Jie-Ping, CHE Jian-Mei, CHEN Qian-Qian, LIU Bo
- 四川海螺沟冰川土样芽胞杆菌资源分析
- Isolation and identification of Bacillus-like species from glacier soil samples collected from Hailuogou in Sichuan Province
- 微生物学通报, 2018, 45(6): 1237-1249
- Microbiology China, 2018, 45(6): 1237-1249
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170646
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文章历史
- 收稿日期: 2017-08-16
- 接受日期: 2017-12-19
- 网络首发日期(www.cnki.net): 2018-01-05
2. 福建省农业科学院农业生物资源研究所 福建 福州 350003
2. Agricultural BioResources Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou, Fujian 350003, China
芽胞杆菌(Bacillus-like)是一类产生抗逆性芽胞的重要微生物资源，能产生多种功能代谢产物，可用于生物农药、生物肥料、生物饲料、生物降污、生物保鲜、生物修复、益生菌、医药保健等领域，具有重要的研究价值和开发利用前景[1]。冰川占据地球陆地面积10%的生态环境，因其长期的低温、强辐射和寡营养等环境特征，蕴藏着具有独特生理特性和适应环境变化的微生物。随着近年来冰川退缩的加剧，冰川退缩前沿裸露地微生物群落演替特性受到了诸多研究者的关注[2]，常用的技术手段主要是可培养和高通量测序。利用可培养技术，邢婷婷等研究发现青藏高原木孜塔格冰川、玉珠峰冰川及扎当冰川可培养细菌生长温度范围均为0−35 ℃，其中玉珠峰冰川和扎当冰川都含有短芽胞杆菌属种类(Brevibacillus spp.)，后者还获得了芽胞杆菌属种类(Bacillus spp.)[3]；李明源等采用LB和PYGV两种培养基分离慕士塔格峰洋布拉克冰川雪冰及融水中可培养细菌，仅LB培养基获得了芽胞杆菌属，2株菌与蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)亲缘关系很近[4]；Rondón等研究分析Pico Bolivar冰川和冰川融水中可培养细菌的多样性，获得54株菌分别为β-变形菌门、γ-变形菌门、放线菌和拟杆菌[5]；Singh等对北极冰芯中细菌的分类学特性和潜在的生物学特性研究中获得奇异芽胞杆菌(Bacillus barbaricus)[6]。通过高通量测序技术，Liu等调查了中国南北不同气候条件的各3个冰川表面初步的微生物群落结构及细菌的多样性[7]；张淑红等研究了喀拉昆仑南部熊彩岗日地区冰川细菌属水平的群落结构[2]；Seok等分析了斯瓦尔巴德岛冰川土壤微生物的群落结构，获得28个不同的门或类，其中包括细菌、放线菌和厚壁菌门等[8]。本文对四川海螺沟冰川土样芽胞杆菌资源进行分析，以期丰富芽胞杆菌冰川分布的科学数据。
四川海螺沟冰川位于贡嘎山东坡，青藏高原东南缘，海螺沟是贡嘎山东坡最主要冰川河，也是我国最具代表性的季风海洋性山谷冰川之一[9]。本文采用纯培养法调查四川海螺沟冰川土样中的芽胞杆菌资源，采用16S rRNA基因对分离的芽胞杆菌资源进行系统发育分析，检测其生理生化特性，揭示该区域冰川土样中芽胞杆菌多样性，以期了解四川海螺沟冰川芽胞杆菌种群多样性，为开发和发掘海螺沟冰川芽胞杆菌资源提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品采集2016年8月，从四川省泸定县磨西镇海螺沟冰川共采集10份土样，东经101°59′，北纬29°34′，海拔3 029 m，装入无菌袋中带回实验室4 ℃存放。
1.1.2 培养基LB分离培养基(g/L)：酵母浸出物5.0，NaCl 10.0，胰蛋白胨10.0，琼脂15−20，pH 7.0−7.2。pH耐受培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母浸出物5.0，NaCl 10.0，琼脂15−20，用1 mol/L NaOH溶液调节基础培养基的pH，使其最终pH分别为5.7、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。NaCl耐受培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母浸出物5.0，称取NaCl 0、10、30、50、70、100 (使其最终NaCl浓度分别为0、1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、10.0%)，琼脂15−20。温度耐受培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母浸出物5.0，NaCl 10.0，琼脂15−20。以上培养基均1×105 Pa灭菌20 min。
1.1.3 主要试剂和仪器细菌16S rRNA基因通用引物27F (5′-GAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-ACGGCTAC CTTGTTACGACTT-3′)由铂尚生物技术(上海)有限公司合成。10×Buffer、dNTPs、Taq酶，铂尚生物技术(上海)有限公司；100 bp Marker，上海英骏生物技术有限公司；NaCl，西陇科学股份有限公司；Tris/HCl，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；EDTA，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；Tris-saturated Phenol (pH 8.0)，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；API 20E试剂盒、API 50CH试剂盒、NaCl 0.85% (5 mL)，BioMerieux公司；矿物油，北京索莱宝科技有限公司。
凝胶成像仪，美国UVP公司；基因扩增仪，杭州博日科技有限公司；电泳仪，美国Bio-Rad公司；高速台式冷冻离心机，德国艾本德股份公司；电子数显卡尺，桂林广陆数字测控股份有限公司；生化培养箱，施都凯仪器设备(上海)有限公司。
1.2 方法 1.2.1 芽胞杆菌的资源分离通过温度法和稀释涂布法在LB平板上分离冰川土样中芽胞杆菌，称取10 g土壤样本加入90 mL的无菌水中，170 r/min振荡30 min混匀，即配成10−1浓度，并放置到80 ℃的水浴中加热10 min，杀死其他细菌以及营养体细胞。吸取1 mL原液至装有9 mL无菌水的试管，即配成10−2浓度，同法配10−3、10−4浓度。无菌条件下涂布，30 ℃培养48 h，之后4 ℃培养7 d，根据菌落大小、形态、颜色进行初步筛选分离并纯化，并将获得的芽胞杆菌菌落通过平板划线法和稀释涂布平板法进行纯化，获得相应菌落的纯化菌株并保存。
1.2.2 芽胞杆菌的16S rRNA基因鉴定芽胞杆菌基因组DNA提取采用苯酚-氯仿法。PCR扩增采用细菌16S rRNA基因通用引物。PCR反应体系(25μL)：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs (10 mmol/L) 0.5 μL，引物27F和1492R (10 μmol/L)各1 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.3 μL，DNA模板1 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。取2.5 μL PCR产物，点样于1.5%的琼脂糖凝胶中，电泳40 min后用凝胶成像仪观察电泳结果。检测出有条带的菌株PCR产物送至铂尚生物技术有限公司进行测序。将各菌株的16S rRNA基因序列通过EzTaxon-e (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)进行比对分析，下载相近的模式菌株序列，经ClustalX对齐后，通过软件MEGA 6.0 (方法为Neighbour-Joining，Bootstrap值取1 000)构建系统进化树。
1.2.3 耐盐特性测定参照刘冰冰等耐盐特性测定方法，将16S rRNA基因鉴定结果中所挑选的代表菌株分别接种于不同盐浓度的LB培养基上，30 ℃倒置于恒温培养箱中，培养48 h后观察菌株生长情况[10]。
1.2.4 温度特性测定根据16S rRNA基因鉴定结果挑选出代表菌株，参照谢永丽等温度特性测定的方法加以改进[11]，将代表菌株接种于LB培养基上，分别倒置于4、15、20、25、30、45 ℃的恒温培养箱中，培养48 h后观察菌株的生长情况(4 ℃和15 ℃需培养5 d后观察菌株的生长情况)。
1.2.5 pH耐受特性测定参照谢永丽等pH耐受特性测定的方法加以改进[11]，将16S rRNA基因鉴定结果中挑选出的代表菌株分别接种于不同pH梯度的LB培养基上，倒置于30 ℃的恒温培养箱中，培养48 h后观察菌株的生长情况。
1.2.6 生理生化特性测定测定方法按照API 50CH碳水化合物鉴定试剂条的说明书进行，先制备菌悬液，然后将菌悬液加到试剂条上的50个微生化管中，最后用无菌液体石蜡封管静置30 ℃培养，24 h和48 h各观察1次结果。试剂条变为黄色(25号管变为黑色)为阳性反应，变为绿色(25号管除外)为弱阳性反应，不变色为阴性反应，以48 h观察到的结果作为最终结果。参照API 20E的鉴定试剂说明书进行，将菌悬液加入到试条的小管内。在试验Hydrolysis ADH (Arginine digydrolase)、LDC (Lysine decarboxylase)、ODC (Ornithine decarboxylase)、H2S (Hydrogen sulfide)和URE (Urease)小杯内加入矿物油以形成厌氧环境，30 ℃培养18−24 h；参考说明表判读其结果。根据生理生化反应结果统计表，将阳性记“1”，阴性记“0”生成新表格，利用DPS (Data Processing System)软件进行分析，可变类平均法计算菌株间的欧氏距离进行阳性率系统聚类分析[12]。其中指标阳性率平均值为1时，表明菌株多个生理生化指标阳性率为100%，为0时阴性率为100%。
2 结果与分析 2.1 芽胞杆菌资源的分离及鉴定通过稀释涂布法从四川海螺沟冰川土壤中共分离到44株不同菌落形态的菌株，其中，30 ℃条件下培养获得33株(FJAT-46639−FJAT-46671)，在4 ℃下分离到11株(FJAT-46673−FJAT-46683)。它们的菌落较小，分离菌株菌落平均直径大小约为1−2 mm，颜色大多为乳白色，少数为黄色，圆形不透明，表面光滑湿润或粘稠，边缘较整齐，多数隆起，少数为扁平。菌落形态见图 1。
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| 图 1 芽胞杆菌的菌落形态 Figure 1 Morphology of some colonies of Bacillus-like species Note: A: Bacillus megaterium FJAT-46639; B: Paenibacillus provencensis FJAT-46641; C: Lysinibacillus fusiformis FJAT-46642; D: Brevibacillus reuszeri FJAT-46643; E: Bacillus siamensis FJAT-46644; F: Bacillus aryabhattai FJAT-46645; G: Bacillus thuringiensis FJAT-46646; H: Brevibacillus fluminis FJAT-46648; I: Brevibacillus agri FJAT-46651; J: Bacillus weihenstephanensis FJAT-46654; K: Bacillus cytotoxicus FJAT-46655; L: Bacillus nealsonii FJAT-46656; M: Bacillus simplex FJAT-46657; N: Bacillus indicus FJAT-46658; O: Bacillus licheniformis FJAT-46659; P: Brevibacillus brevis FJAT-46662; Q: Paenibacillus amylolyticus FJAT-46664; R: Bacillus psychrosaccharolyticus FJAT-46679; S: Bacillus cecembensis FJAT-46680. |
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16S rRNA基因鉴定结果表明，44株分离菌中仅36株为芽胞杆菌，隶属于4个属的19个种(表 1)，分别为芽胞杆菌属(Bacillus，11种，24株)、类芽胞杆菌(Paenibacillus，2种，3株)、短芽胞杆菌属(Brevibacillus，4种，5株)和赖氨酸芽胞杆菌属(Lysinibacillus，2种，4株)，其中以芽胞杆菌属(Bacillus)为优势属，占总体的67%。本实验分离获得的4个属19种芽胞杆菌中，以芽胞杆菌属(Bacillus)、短芽胞杆菌属(Brevibacillus)和类芽胞杆菌属(Paenibacillus) 3个属分布较广泛。
| 菌株编号 Strain No. |
学名 Scientific name |
相似性 Similarity (%) |
序列号 Accession No. |
| FJAT-46639 | 巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium | 100.0 | MF322893 |
| FJAT-46641 | 普罗旺斯类芽胞杆菌Paenibacillus provencensis | 99.8 | MF322892 |
| FJAT-46642 | 纺锤形赖氨酸芽胞杆菌Lysinibacillus fusiformis | 100.0 | MF322891 |
| FJAT-46643 | 茹氏短芽胞杆菌Brevibacillus reuszeri | 99.8 | MF322890 |
| FJAT-46644 | 暹罗芽胞杆菌Bacillus siamensis | 100.0 | MF322889 |
| FJAT-46645 | 阿氏芽胞杆菌Bacillus aryabhattai | 100.0 | MF322888 |
| FJAT-46646 | 苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis | 99.9 | MF322887 |
| FJAT-46648 | 流水短芽胞杆菌Brevibacillus fluminis | 99.9 | MF322886 |
| FJAT-46651 | 土壤短芽胞杆菌Brevibacillus agri | 99.4 | MF322885 |
| FJAT-46654 | 韦氏芽胞杆菌Bacillus weihenstephanensis | 99.6 | MF322884 |
| FJAT-46655 | 细胞毒素芽胞杆菌Bacillus cytotoxicus | 100.0 | MF322883 |
| FJAT-46656 | 尼氏芽胞杆菌Bacillus nealsonii | 98.9 | MF322882 |
| FJAT-46657 | 简单芽胞杆菌Bacillus simplex | 99.3 | MF322881 |
| FJAT-46658 | 印度芽胞杆菌Bacillus indicus | 100.0 | MF322880 |
| FJAT-46659 | 地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis | 100.0 | MF322879 |
| FJAT-46662 | 短短芽胞杆菌Brevibacillus brevis | 99.0 | MF322878 |
| FJAT-46664 | 解淀粉类芽胞杆菌Paenibacillus amylolyticus | 98.5 | MF322877 |
| FJAT-46679 | 冷解糖芽胞杆菌Bacillus psychrosaccharolyticus | 99.8 | MF322876 |
| FJAT-46680 | 科研中心芽胞杆菌Bacillus cecembensis | 99.5 | MF322875 |
由图 2可知，19种芽胞杆菌菌株可分为4大类群：第Ⅰ类群由11种芽胞杆菌组成，皆为芽胞杆菌属，分别为巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)、阿氏芽胞杆菌(Bacillus aryabhattai)、苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)、暹罗芽胞杆菌(Bacillus siamensis)、韦氏芽胞杆菌(Bacillus weihenstephanensis)、简单芽胞杆菌(Bacillus simplex)、印度芽胞杆菌(Bacillus indicus)、冷解糖芽胞杆菌(Bacillus psychrosaccharolyticus)、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、尼氏芽胞杆菌(Bacillus nealsonii)和细胞毒素芽胞杆菌(Bacillus cytotoxicus)；第Ⅱ类群为赖氨酸芽胞杆菌属，包含纺锤形赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillus fusiformis)和科研中心芽胞杆菌(Bacillus cecembensis)；第Ⅲ类群为短芽胞杆菌属，包含短短芽胞杆菌(Brevibacillus brevis)、茹氏短芽胞杆菌(Brevibacillus reuszeri)、流水短芽胞杆菌(Brevibacillus fluminis)、和土壤短芽胞杆菌(Brevibacillus agri) 4个种；第Ⅳ类群为类芽胞杆菌属(Paenibacillus)，由普罗旺斯类芽胞杆菌(Paenibacillus provencensis)和解淀粉类芽胞杆菌组成，其中包含了一株潜在新种FJAT-46664，它与解淀粉类芽胞杆菌的模式菌16S rRNA基因序列相似性最高，达98.5%，低于种的界限阈值98.65%。
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| 图 2 海螺沟冰川土样中19株芽胞杆菌的系统发育树 Figure 2 Phylogenetic analysis of 19 Bacillus-like species from soil samples in Hailuogou Sichuan Province |
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根据16S rRNA基因序列鉴定结果，从中挑选出19株具有不同16S rRNA基因序列的芽胞杆菌进行pH、温度和NaCl培养特性研究。由表 2可知，菌株FJAT-46639、FJAT-46645和FJAT-46659的耐盐范围最大在0−10%，最适盐浓度为1%−3%，仅有1株菌只在3%盐浓度生长，7株可以在无盐的条件下生长。64%的菌株pH耐受范围在5.7−11.0，仅FJAT-46648株菌的pH耐受范围为5.7−8.0，FJAT-46658和FJAT-46679菌株在pH 7.0及以下不生长，15%的菌株在pH 10.0及以上不生长，而菌株FJAT-46643的pH耐受范围在5.7−10.0，大部分菌株最适pH在7.0。温度特性实验结果表明，约52.6%的菌株能在50 ℃生长，菌株FJAT-46648和FJAT-46651的生长温度范围只在30−45 ℃；只有FJAT-46657、FJAT-46679和FJAT-46680这3株菌能在4 ℃下生长，其余菌株在4 ℃下均不生长。大部分菌株在30 ℃条件下生长较好。
| 菌株编号 Strain No. |
学名 Scientific name |
pH范围(最适pH) pH range (Optimum pH) |
温度范围(最适温度) Temperature range (℃) (Optimum temperature) |
NaCl含量(最适) Content of NaCl (%) (Optimum NaCl) |
| FJAT-46639 | 巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium | 5.7−11.0 (5.7) | 15−50 (45) | 0−10 (1−3) |
| FJAT-46641 | 普罗旺斯类芽胞杆菌Paenibacillus provencensis | 5.7−11.0 (7.0) | 15−50 (30) | 1−3 (1) |
| FJAT-46642 | 纺锤形赖氨酸芽胞杆菌Lysinibacillus fusiformis | 5.7−11.0 (7.0) | 15−50 (30) | 1−5 (1) |
| FJAT-46643 | 茹氏短芽胞杆菌Brevibacillus reuszeri | 5.7−10.0 (7.0) | 30−50 (45) | 1 |
| FJAT-46644 | 暹罗芽胞杆菌Bacillus siamensis | 5.7−9.0 (7.0) | 30−50 (45) | 3−5 |
| FJAT-46645 | 阿氏芽胞杆菌Bacillus aryabhattai | 5.7−11.0 (8.0) | 15−50 (30) | 0−10 (1) |
| FJAT-46646 | 苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis | 5.7−11.0 (7.0) | 15−50 (30) | 1−7 (1) |
| FJAT-46648 | 流水短芽胞杆菌Brevibacillus fluminis | 5.7−8.0 (7.0) | 30−45 (30) | 1 |
| FJAT-46651 | 土壤短芽胞杆菌Brevibacillus agri | 5.7−9.0 (8.0) | 30−45 (45) | 1 |
| FJAT-46654 | 韦氏芽胞杆菌Bacillus weihenstephanensis | 5.7−11.0 (5.7) | 15−30 (15) | 1−5 (1) |
| FJAT-46655 | 细胞毒素芽胞杆菌Bacillus cytotoxicus | 5.7−11.0 (5.7) | 20−30 (30) | 1−3 |
| FJAT-46656 | 尼氏芽胞杆菌Bacillus nealsonii | 5.7−11.0 (8.0) | 15−45 (30) | 1−5 (1−3) |
| FJAT-46657 | 简单芽胞杆菌Bacillus simplex | 5.7−11.0 (8.0) | 4−30 (15) | 1−7 (1) |
| FJAT-46658 | 印度芽胞杆菌Bacillus indicus | 7.0−11.0 (8.0−9.0) | 15−50 (30) | 0−7 (1) |
| FJAT-46659 | 地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis | 5.7−11.0 (7.0) | 20−50 (45) | 0−10 (0−3) |
| FJAT-46662 | 短短芽胞杆菌Brevibacillus brevis | 5.7−9.0 (8.0) | 20−50 (45) | 0−1 |
| FJAT-46664 | 解淀粉类芽胞杆菌Paenibacillus amylolyticus | 5.7−11.0 (8.0) | 15−30 (30) | 0−5 (0−1) |
| FJAT-46679 | 冷解糖芽胞杆菌Bacillus psychrosaccharolyticus | 7.0−11.0 (8.0) | 4−30 (15) | 3 |
| FJAT-46680 | 科研中心芽胞杆菌Bacillus cecembensis | 5.7−11.0 (10.0) | 4−30 (30) | 0−3 (0−1) |
根据生理生化实验结果，采用类平均法和欧氏距离模型进行聚类分析(图 3)。当欧氏距离为5时，可分为3组。第一组为普罗旺斯类芽胞杆菌(Paenibacillus provencensis)、暹罗芽胞杆菌(B. siamensis)、巨大芽胞杆菌(B. megaterium)、阿氏芽胞杆菌(B. aryabhattai)、尼氏芽胞杆菌(B. nealsonii)、地衣芽胞杆菌(B. licheniformis)和解淀粉类芽胞杆菌(Paenibacillus amylolyticus)共7种；第二组包括4种，分别为纺锤形赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillus fusiformis)、短短芽胞杆菌(Brevibacillus brevis)、茹氏短芽胞杆(Brevibacillus reuszeri)和科研中心芽胞杆菌(B. cecembensis)；第三组由苏云金芽胞杆菌(B. thuringiensis)、韦氏芽胞杆菌(B. weihenstephanensis)、简单芽胞杆菌(B. simplex)、印度芽胞杆菌(B. indicus)、冷解糖芽胞杆菌(B. psychrosaccharolyticus)和细胞毒素芽胞杆菌(B. cytotoxicus) 6种组成。
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| 图 3 用可变类平均法得到的树状谱 Figure 3 The dendrogram obtained by the group average method 注：图中数字为欧式距离. Note: The number is Euclidean distance in the picture. |
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根据上述欧氏距离聚类分析的结果，进行了各组芽胞杆菌生理生化指标阳性率的分析(表 3)。从各组到中心距离的值可以得出这3组之间的差距比较大，第3组生理生化指标阳性率值到中心的距离RMSTD=1.362 1，约等于第1组，小于第2组。从表 3可知，第1组和第3组均可以利用葡萄糖，第2组则均无法利用葡萄糖；对甘油的利用程度来看，第1组中能利用甘油的芽胞杆菌最多；第1组的样本均可以水解七叶灵，第3组中有部分菌可以水解七叶灵，而第2组均不能水解七叶灵；仅第1组中的芽胞杆菌能分解半乳糖；这3组中均有菌株能利用明胶，而第2组中的全部都能利用明胶。除此之外，其组内的各菌种之间也是有较大的差距的。第1组中，从均值上看，不是所有的菌株都能利用同一种物质但它们都可以利用核糖、七叶灵、葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉等；而第3组的仅能共同利用葡萄糖。
| 组别样本号 Sample |
第1组7个样本 Seven samples of the first group |
第2组4个样本 Four samples of the second group |
第3组6个样本 Six samples of the third group |
| 甘油Glycerol | 0.86 | 0.00 | 0.17 |
| 赤癣醇Erythritol | 0.14 | 0.00 | 0.00 |
| L-阿拉伯糖L-Arabinose | 1.00 | 0.00 | 0.00 |
| 核糖Ribose | 1.00 | 0.00 | 0.5 |
| D-木糖D-Xylose | 1.00 | 0.00 | 0.17 |
| 半乳糖Galactose | 0.71 | 0.00 | 0.00 |
| 葡萄糖Glucose | 1.00 | 0.00 | 1.00 |
| 果糖Fructose | 1.00 | 0.00 | 0.83 |
| 甘露糖Mannose | 0.57 | 0.00 | 0.50 |
| 山梨糖Sorbose | 0.14 | 0.00 | 0.00 |
| 鼠李糖Rhamnose | 0.14 | 0.00 | 0.00 |
| 肌醇Inositol | 0.29 | 0.00 | 0.33 |
| 甘露醇Mannitol | 0.86 | 0.25 | 0.17 |
| 山梨醇Sorbitol | 0.57 | 0.00 | 0.00 |
| α-甲基-D-葡萄糖甙 α-Methyl-D-mannose glycosides |
0.43 | 0.00 | 0.17 |
| N-乙酰-葡糖胺N-Acetylglucosamine | 0.86 | 0.25 | 0.67 |
| 苦杏仁甙Amygdalin | 1.00 | 0.00 | 0.00 |
| 熊果甙Arbutin | 0.86 | 0.00 | 0.17 |
| 七叶灵Esculin | 1.00 | 0.00 | 0.67 |
| 柳醇Saligenin | 0.86 | 0.00 | 0.50 |
| 纤维二糖Cellobiose | 0.86 | 0.00 | 0.67 |
| 麦芽糖Maltose | 0.86 | 0.00 | 0.83 |
| 乳糖Lactose | 0.43 | 0.00 | 0.00 |
| 蜜二糖D-Melibiose | 0.71 | 0.00 | 0.17 |
| 蔗糖Sucrose | 1.00 | 0.00 | 0.33 |
| 海藻糖Trehalose | 0.86 | 0.00 | 0.83 |
| 松叁糖Melizitose | 0.29 | 0.00 | 0.00 |
| 棉子糖Raffinose | 0.86 | 0.00 | 0.33 |
| 淀粉Starch | 1.00 | 0.00 | 0.50 |
| 肝糖Glycogen | 0.86 | 0.00 | 0.50 |
| 龙胆二糖Gentiobiose | 0.86 | 0.00 | 0.00 |
| D-松二糖D-Turanose | 0.57 | 0.00 | 0.00 |
| 葡萄糖酸盐Gluconate | 0.29 | 0.00 | 0.33 |
| 邻硝基苯-半乳糖苷2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside | 0.71 | 0.25 | 0.33 |
| 精氨酸Arginine | 0.14 | 0.25 | 0.33 |
| 梓檬酸钠Sodium citrate | 0.14 | 0.25 | 0.17 |
| 脲素Carbamide | 0.00 | 0.50 | 0.00 |
| Kohn明胶Gelatin | 0.43 | 0.75 | 1.00 |
| 到中心距离Distance of center | RMSTD=1.345 1 | RMSTD=7.817 3 | RMSTD=1.362 1 |
根据代表芽胞杆菌的生理生化结果阳性统计表，对其进行聚类分析，利用Wilks统计量分析生理生化反应在不同芽胞杆菌间的差异。从表 4可知，有大于30%的菌株在生理生化反应中，其物质阳性率占60%以上，其中最高的为尼氏芽胞杆菌(B. nealsonii) FJAT-46656为81.58%，而茹氏短芽胞杆菌(Brevibacillus reuszeri) FJAT-46643和科研中心芽胞杆菌(B. cecembensis) FJAT-46680的物质阳性率仅占5.26%。
| 变量 Variables |
样本数 Sample |
均值 Average value |
方差 Variance |
标准差 Standard deviation |
Wilks | P value |
| FJAT-46639 | 38 | 0.657 9 | 0.231 2 | 0.480 8 | 0.600 1 | 0 |
| FJAT-46641 | 38 | 0.394 7 | 0.245 4 | 0.495 4 | 0.621 1 | 0 |
| FJAT-46642 | 38 | 0.131 6 | 0.117 4 | 0.342 6 | 0.400 3 | 0 |
| FJAT-46643 | 38 | 0.052 6 | 0.051 2 | 0.226 3 | 0.237 2 | 0 |
| FJAT-46644 | 38 | 0.789 5 | 0.170 7 | 0.413 2 | 0.502 4 | 0 |
| FJAT-46645 | 38 | 0.657 9 | 0.231 2 | 0.480 8 | 0.600 1 | 0 |
| FJAT-46646 | 38 | 0.368 4 | 0.239 0 | 0.488 9 | 0.611 7 | 0 |
| FJAT-46654 | 38 | 0.368 4 | 0.239 0 | 0.488 9 | 0.611 7 | 0 |
| FJAT-46655 | 38 | 0.263 2 | 0.199 1 | 0.446 3 | 0.550 3 | 0 |
| FJAT-46656 | 38 | 0.815 8 | 0.154 3 | 0.392 9 | 0.473 0 | 0 |
| FJAT-46657 | 38 | 0.236 8 | 0.185 6 | 0.430 9 | 0.528 0 | 0 |
| FJAT-46658 | 38 | 0.394 7 | 0.245 4 | 0.495 4 | 0.621 1 | 0 |
| FJAT-46659 | 38 | 0.710 5 | 0.211 2 | 0.459 6 | 0.569 6 | 0 |
| FJAT-46662 | 38 | 0.026 3 | 0.026 3 | 0.162 2 | 0.152 4 | 0 |
| FJAT-46664 | 38 | 0.605 3 | 0.245 4 | 0.495 4 | 0.621 1 | 0 |
| FJAT-46679 | 38 | 0.289 5 | 0.211 2 | 0.459 6 | 0.569 6 | 0 |
| FJAT-46680 | 38 | 0.052 6 | 0.051 2 | 0.226 3 | 0.237 2 | 0 |
冰川冰芯、融水及冻土等低温环境中，可培养细菌主要包括6个系统发育类群：α-变形菌门、β-变形菌门、γ-变形菌门、拟杆菌、高G+C%和低G+C%含量革兰氏阳性菌，至少有30多个属[13-15]。本文研究结果表明，四川海螺沟冰川获得的芽胞杆菌隶属于4个属19个种，芽胞杆菌属(Bacillus) 11个种、类芽胞杆菌属(Paenibacillus) 2个种、短芽胞杆菌属(Brevibacillus) 4个种、赖氨酸芽胞杆菌属(Lysinibacillus) 2个种，其中芽胞杆菌属为优势属。
我国地域辽阔，拥有丰富的冰川类型，包括大陆性冰川、亚大陆冰川和海洋型冰川，而且冰川分布的范围广，资源丰富，从低纬度到高纬度地区都有分布[16-17]。在新疆、青海、甘肃、四川、云南和西藏等地区的冰川环境中潜藏着丰富的芽胞杆菌资源。本文从四川海螺沟冰川土壤样品中获得的19种芽胞杆菌种类，与其他冰川如玉珠峰冰川[3]、祁连山冰川[18]、扎当冰川[3]、慕士塔格峰洋布拉克冰川[4]、喀拉昆仑南部熊彩岗日地区冰川[4]、天山冰芯[19]、东天山地区冰川[20]、卓奥友地区冰川[20]、马兰冰芯[21]、喀纳斯湖区[22]、玉龙雪山冰川[23]、东绒布冰川[24]、西昆仑山[25]及西昆仑崇测冰帽[26]等进行比较分析，其中解淀粉类芽胞杆菌(Paenibacillus amylolyticus)在卓奥友地区冰川[20]、喀纳斯湖区[22]和玉龙雪山冰川[23]中均有报道；在西昆仑崇测冰帽[26]也有发现纺锤形赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillus fusiformis)；韦氏芽胞杆菌(B. weihenstephanensis)也分布在慕士塔格峰洋布拉克冰川[4]；在珠穆朗玛峰地区的东绒布冰川分离到土壤短芽胞杆菌(Brevibacillus agri)[24]；在西昆仑山2个不同海拔位点上分离获得地衣芽胞杆菌(B. licheniformis)和简单芽胞杆菌(B. simplex)[25]，由此可知冰川地区的芽胞杆菌资源具有一定相似性。此外，在四川海螺沟冰川发现的普罗旺斯类芽胞杆菌(Paenibacillus provencensis)、暹罗芽胞杆菌(B. siamensis)、巨大芽胞杆菌(B. megaterium)、阿氏芽胞杆菌(B. aryabhattai)、尼氏芽胞杆菌(B. nealsonii)、短短芽胞杆菌(Brevibacillus brevis)、茹氏短芽胞杆菌(Brevibacillus reuszeri)、科研中心芽胞杆菌(B. cecembensis)、苏云金芽胞杆菌(B. thuringiensis)、印度芽胞杆菌(B. indicus)、冷解糖芽胞杆菌(B. psychrosaccharolyticus)、流水短芽胞杆菌(Brevibacillus fluminis)和细胞毒素芽胞杆菌(B. cytotoxicus)这13株菌在国内其他冰川中鲜见报道，推测是地方特有类群。这是否与其所处冰川的地理格局及气候因素有关，尚需进一步探讨。综上表明四川海螺沟冰川的土壤中分布着独特的芽胞杆菌群落结构和多样性。
四川海螺沟冰川土样中分离的芽胞杆菌具有较广的温度适应性，多数菌株的生长温度范围为15−50 ℃，能在50 ℃下存活的菌株有10株，说明有一半的芽胞杆菌对外界高温具有一定的耐受能力，且有3株菌能在4 ℃下生长。对19株代表芽胞杆菌进行pH耐受特性实验，筛选得到能在pH范围为5.7−11.0生长的芽胞杆菌有12株，占代表芽胞杆菌总数的64%，说明有半数以上的芽胞杆菌有较广的pH耐受范围。从实验结果得出相同属不同种芽胞杆菌的pH耐受性相似，不同属的芽胞杆菌之间的pH耐受性有一定的差异。而芽胞杆菌耐盐特性实验得出，芽胞杆菌的耐盐范围最大在0−10.0%，有的耐盐范围仅在0−1.0%，说明芽胞杆菌之间的耐盐度差异较大。
法国梅里埃(BioMerieux，SA) API微生物鉴定方法简单、快速和结果明显。本研究中选用了鉴定芽胞杆菌的API 50CH和API 20E试剂条检测供试菌株，根据反应结果统计表进行了欧氏距离等方法统计，结果表明四川海螺沟冰川芽胞杆菌具有多样性的生理生化特性，其中不同物质的利用率差异较大，明胶的利用率最高，鼠李糖、山梨醇等的利用率低；同时发现同属不同种菌株的生理生化特征具有一定的差异，如尼氏芽胞杆菌FJAT-46656能利用80%以上的物质，而茹氏短芽胞杆菌FJAT-46643的物质阳性率仅达到5.26%，这可能与芽胞杆菌对环境的适应性及其本身的性质有一定的相关性。
Sun等报道了细菌基因组内的非均匀性引起16S rRNA基因对原核生物多样性过度估计，细菌不同区域的16S rRNA基因的多样性误差可能影响种类的鉴定[27]。文中16S rRNA基因作为芽胞杆菌种类鉴定的依据，仅为种类资源调查的初筛手段，同时比对序列的相似性控制在99.0%以上，对于每一个芽胞杆菌种类的最后确定还进行了相应的全基因组、细胞壁、生理生化特性、脂肪酸组、甚至物质组的实验分析。本文通过16S rRNA基因和生理生化特性实验初步研究了四川海螺沟冰川芽胞杆菌的分布，为后续进一步开发利用这些芽胞杆菌资源提供了理论基础。
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