微生物学通报  2018, Vol. 45 Issue (6): 1219−1227

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刘丽, 张科, 李冰洁, 陈秋, 郑新华, 王福安, 周云霞
LIU Li, ZHANG Ke, LI Bing-Jie, LI Ming-Can, CHEN Qiu, ZHENG Xin-Hua, WANG Fu-An
河南鲁山五大温泉水细菌多样性分析
Bacterial diversity analysis of Five Hot Spring in Henan Lushan
微生物学通报, 2018, 45(6): 1219-1227
Microbiology China, 2018, 45(6): 1219-1227
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170690

文章历史

收稿日期: 2017-09-03
接受日期: 2018-01-25
网络首发日期(www.cnki.net): 2018-02-14
河南鲁山五大温泉水细菌多样性分析
刘丽 , 张科 , 李冰洁 , 陈秋 , 郑新华 , 王福安 , 周云霞     
平顶山学院    河南 平顶山    467000
摘要【背景】 位于河南中部的平顶山市含有丰富的温泉资源,对温泉水中的微生物多样性和群落结构进行研究有助于更好地开发利用温泉资源。【目的】 探究河南鲁山五大温泉水中(上汤、中汤、下汤、温汤和神汤)细菌多样性。【方法】 采用Illumina HiSeq2500 PE250技术对鲁山五大温泉水细菌的16S rRNA基因V3−V4变异区序列进行测序,应用UPARSE、Mothur、Silva、MUSCLE和QIIME等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元(Operational taxonomic unit,OTU)数量,最后分析五大温泉水中细菌的丰度和多样性。【结果】 上汤、中汤、下汤、温汤和神汤分别获得56 017、68 319、65 247、59 340、68 825条有效Tags,聚类为670、287、337、598、381个OTU。细菌分类分析表明,五大温泉水的细菌超过40个门,变形菌门(Proteobacteria)占84.12%,是优势菌;在属分类阶元上,五大温泉水的细菌超过239个属,上汤的优势菌是不动杆菌属(Acinetobacter),中汤的优势菌是Tepidimonas,下汤的优势菌是Vogesella和不动杆菌属(Acinetobacter),温汤的优势菌是Sphingopyxis和新鞘脂菌属(Novosphingobium),神汤的优势菌是Aquabacterium【结论】 鲁山五大温泉水中含有丰富的微生物资源,为后续五大温泉水中的微生物资源开发奠定了基础。
关键词五大温泉     细菌多样性     16S rRNA基因     HiSeq2500 PE250    
Bacterial diversity analysis of Five Hot Spring in Henan Lushan
LIU Li, ZHANG Ke, LI Bing-Jie, LI Ming-Can, CHEN Qiu, ZHENG Xin-Hua, WANG Fu-An     
Pingdingshan University, Pingdingshan, Henan 467000, China
Received: September 03, 2017; Accepted: January 25, 2018; Published online (www.cnki.net): February 14, 2018
Foundation item: Key Scientific Research Project of Colleges and Universities in Henan Province (16B180004);Key Grant of Science and Technology Department of Henan Province (172102310211, 172102310529); Training Program of the National Natural Science Foundation of Pingdingsh University (PXY-PYJJ2016004); Scientific Research Start-up Foundation for the High-level Talent of Pingdingshan University (PXY-BSQD-2015006); Key Discipline of Pathogenic Biology from Pingdingshan University; The Central Financial Support Project (ZXPT2015001)
*Corresponding author: ZHANG Ke, E-mail: kekely555@126.com.
Abstract: [Background] Pingdingshan is rich in hot spring resources. The study of microbial diversity and community structure in the spring water will help us to better exploit these resources. [Objectives] The bacterial diversity of Five Hot Spring (SHANGT, ZHONGT, XIAT, WENT and SHENT) in Henan Lushan was investigated and analyzed. [Methods] The bacterial 16S rRNA V3−V4 genes were sequenced by Illumina HiSeq2500 PE250 technology. The OTUs was sorted and counted using UPARSE, Mothur, Silva, MUSCLE and QIIME software. Finally, the bacterial abundance and diversity in Five Hot Spring was analyzed. [Results] It was obtained 56 017, 68 319, 65 247, 59 340, 68 825 effective tags, and acquired 670, 287, 337, 598, 381 OTUs from the SHANGT, ZHONGT, XIAT WENT, and SHENT respectively. The analysis of bacterial classification showed that the bacteria from Five Hot Springs could be classified as more than 40 phyla. Proteobacteria accounted for 84.12% was the dominant bacteria. In the genera level, bacteria from Five Hot Springs could be classified into more than 239 genera. The dominant bacteria of Five Hot Springs (SHANGT, ZHONGT, XIAT, WENT and SHENT) respectively is Acinetobacter, Tepidimonas, Vogesella and Acinetobacter, Sphingopyxis and Novosphingobium, Aquabacterium. [Conclusion] Five Hot Springs in Lushan are rich in microbial resources and may have the potential for the development of such resources.
Key words: Five Hot Spring     Bacterial diversity     16S rRNA gene     HiSeq2500 PE250    

自20世纪50年代以来,人们一直对生长在嗜热(> 55 ℃)和超嗜热(> 80℃)的温泉微生物有着巨大的兴趣,原因是从这些温泉微生物中获取的酶作为生物催化剂在工业以及生物制剂等领域的应用中具有极高的价值[1]。另外,人们也一直在不同的环境条件下,尤其是在极端环境微生物中寻找新的化合物用于药物的研发[2],而温泉、海洋则是地球上生物多样性最大的蓄水池,对于研发新的天然产物具有巨大的潜力[3]。尽管如此,地球上仅有约1%−10%的原核生物被人们研究[4]

在我国中部河南平顶山市鲁山县城西10 km,位于外方山和伏牛山之间的沙河河谷两侧,在长约30 km地域内,分布着鲁山五大温泉,分别是:上汤、中汤、下汤、温汤和神汤(也称碱汤)。上汤海拔275 m,中汤及温汤海拔220 m,下汤海拔179 m,神汤海拔148 m。鲁山五大温泉矿化度在0.46−0.72 g/L之间,氟含量在13.60−17.78 mg/L之间,偏硅酸含量在74.8−97.0 mg/L之间,水温在27−63℃之间,pH 8.0−9.1,属于弱碱性医疗热矿水,具有极佳的医疗效果。早在北魏时期,地理学家郦道元在他的《水经注·滍水》篇中称鲁山温泉“可以疗万疾”[5]。虽然鲁山五大温泉旅游、医疗等资源开发历史悠久,但是关于其微生物的研究却很少,而鲁山五大温水的微生物多样性和群落结构的研究至今未见报道。

在本研究中,我们采用高通量测序平台Illumina HiSeq2500 PE250,使用16S rRNA基因扩增测序技术对鲁山五大温泉水中细菌的16S rRNA基因V3−V4区域进行了测序,分析了鲁山五大温泉水的细菌多样性和群落结构,发现鲁山五大温泉水的微生物资源十分丰富。本研究首次对鲁山五大温泉水的微生物开展多样性研究,为将来开发和利用温泉微生物资源提供了基础资料。

1 材料与方法 1.1 样品采集和处理

样品采集于河南平顶山鲁山五大温泉区:上汤(Shangtang,SHANGT)、中汤(Zhongtang,ZHONGT)、下汤(Xiatang,XIAT)、温汤(Wentang,WENT)、神汤(Shentang,SHENT)。用干净的塑料桶收集温泉水各10 L,现场测定温度并对样品所处的经纬度进行GPS定位。然后用0.22μm的滤膜过滤温泉水,在滤膜上富集温泉水中的微生物,−80 ℃保存滤膜,备用。

1.2 基因组DNA的提取

采用CTAB法提取滤膜上富集的微生物的总DNA,然后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度,使用无菌水稀释样品至1 ng/μL。

1.3 16S rRNA基因扩增与测序

以稀释后的基因组DNA为模板,根据细菌的16S rRNA基因V3−V4区序列,选择测序引物为341F (5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R (5′-GGAC TACNNGGGTATCTAAT-3′),使用带Barcode的特异引物,New England Biolabs公司的Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶对测序区域进行PCR扩增。扩增产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测,合格后使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit进行文库构建,构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量鉴定合格后,使用HiSeq2500 PE250测序平台进行测序。

1.4 基因组数据分析

对测序后得到的原始数据(Raw data)数据进行拼接(FLASH V1.2.7)[6]、质控[7]和嵌合体过滤[8]等,得到最终的有效数据(Effective tags)。

1.5 OTU聚类和物种注释

利用UPARSE软件(V7.0.1001)对Effective tags进行聚类(Identity≥97%),将序列聚类成为OTU,同时选取OTU的代表性序列(OTU中出现频数最高的序列作为OTU的代表序列)。然后,使用Mothur与Silva的SSUrRNA数据库对OTU代表序列进行物种注释分析(阈值为0.8−1.0),获得各个分类水平的分类学信息:界(Kingdom)、门(Phylum)、纲(Class)、Order (目)、Family (科)、Genus (属)、Species (种),在各分类水平统计各样本的群落组成。最后,使用MUSCLE软件(Version 3.8.31)进行快速多序列比对,得到所有OTU代表序列的系统发生关系。

1.6 样品复杂度分析

使用QIIME软件(Version 1.7.0)计算Observed- species、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Goods- coverage和PD_whole_tree指数,使用R软件(Version 2.15.3)绘制稀释度曲线、Rank曲线、物种累积曲线,并使用R软件进行Alpha多样性指数组间差异分析。

1.7 多样品比较分析(Beta diversity)

根据所有样品的物种注释结果和OTU的丰度信息,将相同分类的OTU信息合并处理得到物种丰度信息表(Profiling table)。同时利用OTU之间的系统发生关系,进一步计算UniFrac距离(Unweighted UniFrac)[9-10]。UniFrac距离是一种利用各样品中微生物序列间的进化信息计算样品间距离,2个以上的样品,则得到一个距离矩阵。然后,利用OTU的丰度信息对UniFrac距离进一步构建Weighted UniFrac距离[11]。以Weighted UniFrac和Unweighted UniFrac距离来绘制距离矩阵热图进行多样品的比较分析。

2 结果与分析 2.1 样品的水质参数

鲁山温泉水化学类型为HCO3·SO4-Na型或SO4·HCO3-Na型[5],pH 8.0−9.1,属于弱碱性医疗热矿水,五大温泉水采样信息见表 1

表 1 五大温泉水样信息 Table 1 The water information for Five Hot Spring
温泉
Spring
位置
Position
经度
Longitude
纬度
Latitude
体积
Volume (L)
水温
Temperature (℃)
上汤
SHANGT
大佛温泉山庄
Buddha hot spring villa
112.461 33.755 10 51
中汤
ZHONGT
赵庄中心卫生院
The central hospital of Zhaozhuang
112.568 33.746 10 58
下汤
XIAT
皇姑浴温泉国际酒店
Huanggu bath spa international hotel
112.637 33.724 10 44
温汤
WENT
赵村乡温汤庙村
Zhao village Wentang Temple Village
112.562 33.741 10 44.5
神汤
SHENT
让河乡新孟庄
Xinmengzhuang, Ranghe township
112.794 33.719 10 47
2.2 序列拼接与组装

鲁山五大温泉水细菌的16S rRNA基因序列文库共获得460 190条Reads,拼接后得到317 748条有效的Tags,在97%相似度下可将其聚类为用于物种分析的2 273个OTU。其中,鲁山五大温泉中上汤共有56 017条Reads,聚类为670个OTU;中汤共有68 319条Reads,聚类为287个OTU;下汤共有65 247条Reads,聚类为337个OTU;温汤共有59 340条Reads,聚类为598个OTU;神汤共有68 825条Reads,聚类为381个OTU (图 1)。

图 1 各样本的OTUs聚类和注释情况 Figure 1 OTUs clustering and annotation from different samples
2.3 鲁山五大温泉水细菌物种及其丰度

在门分类阶元水平,五大温泉水细菌的16S rRNA基因序列共注释到了变形菌门(Proteobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、奇古菌门(Thaumarchaeota)等超过40个门,其中,变形菌门在五大温泉中所占比例最高,是优势菌。但不同温泉样本中优势菌门的相对丰度有所不同,上汤中所占比例为60%,在中汤中占94%,在温汤中占75%,在下汤中高达99%,在神汤中占93%。在门的分类阶元上,上汤和温汤的多样性最丰富,其次是中汤、神汤,多样性最差的是下汤(图 2)。此外,上汤和温汤、中汤和神汤在微生物不同的门上的分布较为相似。

图 2 各样本在门水平的分布 Figure 2 The distribution of Phylum from different samples

在属分类阶元水平,鲁山五大温泉菌落构成不同,且不同菌属所占的比例也不同。上汤在属水平上的主要微生物是FontimonasSchlegelellaCandidatus-NitrosocaldusCaldimonas、假单胞菌属(Pseudomonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、Bacillus、葡萄球菌属(Staphylococcus)、柯克斯体属(Coxiella)等;中汤在属水平上主要的微生物是Tepidimonas、嗜氢菌属(Hydrogenophilus)、栖热菌属(ThermusHydrogenobacter)等;下汤在属水平上主要的微生物是LimnobacterPerlucidibacaGulbenkianiaVogesella、噬氢菌属(Hydrogenophaga)等;温汤在属水平上主要的微生物是新鞘脂菌属(Novosphingobium)、根瘤菌属(Rhizobium)、PseudorhodoferaxSphingopyxis等;神汤在属水平上主要的微生物是AquabacteriumComamons。在属分类阶元上,上汤和温汤的多样性最丰富,其次是中汤和下汤,神汤的多样性最差(图 3)。

图 3 各样本在属水平的分布 Figure 3 The distribution of general from different samples

在鲁山五大温泉中发现前十的属有:Aquabacterium (21.57%)、Tepidimonas (17.76%)、Vogesella (5.89%)、不动杆菌属(Acinetobacter) (8.23%)、Sphingopyxis (2.36%)、新鞘脂菌属(Novosphingobium) (2.29%)、Perlucidibaca (2.36%)、Pseudorhodoferax (1.70%)、亚硝化暖菌属(Candidatus_Nitrosocaldus) (1.68%)、噬氢菌属(Hydrogenophaga) (1.49%)。

2.4 鲁山五大温泉水细菌多样性分析

物种稀释度曲线和物种Rank曲线是展示样品物种多样性的重要形式。物种稀释度曲线可以展示物种的丰富度,由图 4A可知,上汤物种的丰富度最高,其次是温汤、神汤和下汤,中汤物种丰富度最低。物种Rank曲线展示了物种的均匀度,由图 4B可知,均匀度最高的是上汤,最低的是中汤。

图 4 α-多样性分析 Figure 4 α-diversity comparison 注:A:稀释曲线;B:Rank Abundance曲线.
Note: A: Rarefaction curve; B: Rank abundance curve.

Beta多样性研究中,选用Weighted UniFrac距离和Unweighted UniFrac距离2个指标来衡量2个样品间的相异系数,其值越小,表示这2个样品在物种多样性方面存在的差异越小。由图 5可知,中汤和神汤在物种多样性方面最相近,相差最远的是上汤和神汤。

图 5 Beta多样性指数热图 Figure 5 Beta diversity index heat map
3 讨论 3.1 上汤和温汤细菌多样性

上汤和温汤的物种丰富度和均匀度在五大温泉中相对较高,其中上汤的物种多样性最高且分布均匀,这可能与上汤较低的经度(112.461)以及适宜的温度(51 ℃)有关。在属分类阶元上,上汤的优势菌是不动杆菌属(Acinetobacter),此菌属在自然界分布广泛,主要存在于水体和土壤中,革兰氏阴性,好氧,过氧化氢酶阳性,可耐受的pH范围是3.0−9.0 (最适为6.0−7.0)。Acinetobacter是重要的石油烃降解者,在降低石油烃生物毒性等方面有重要作用,因此可用于石油烃的修复工程[12]。温汤的优势菌属是Sphingopyxis和新鞘脂菌属(Novosphingobium),在温汤中含量分别为11%和10%,Sphingopyxis在其他几个温泉中含量极低(≤0.3%),这可能与温汤独特的微环境有关。Sphingopyxis属于α-变形杆菌,大多数与有机物的降解有关,是环境中一类重要的降解菌,可用来研制微生物修复剂并应用于生物修复[13]Novosphingobium是革兰氏阴性的杆状细菌,具有浅黄色素,有运动型和非运动型。可从深海海山、温泉[14-15]、荷花池、养鱼池、森林土壤[16-18]以及被石油污染的土壤中[19]分离得来,从耐盐的水稻根际分离得来的Novosphingobium具有促进植物生长的作用[20]Novosphingobium可用来合成银纳米材料AgNPs,与抗生素联合使用可以增强其抗绿脓杆菌、大肠杆菌、肠道沙门菌以及副溶血弧菌的活性,可作为一种新型环保的抗菌剂[21]

3.2 中汤、神汤和下汤细菌多样性

中汤和神汤在物种多样性方面最为相近,但由于两温泉的地理位置以及微环境有所不同,在属的分类阶元上二者的优势菌群有所不同。在中汤中Tepidimonas的含量高达79%,为优势菌。Tepidimonas属于β-变形杆菌,大部分来自温泉并且轻度嗜热[22-23],在意大利、印度、台湾、葡萄牙的温泉中也分离出来过[24-27]。革兰氏阴性杆菌,无色素,最适生长温度为50−55 ℃,最适pH为7.5−8.5,严格好氧,兼性化能异养。因Tepidimonas能氧化还原硫化物形成硫酸盐,鲁山温泉水化学类型为HCO3·SO4-Na型或SO4·HCO3-Na型[5],而Tepidimonas在中汤中含量明显高于鲁山其他温泉也体现了中汤中硫酸根浓度高于鲁山其他温泉。Aquabacterium在神汤中含量高达85%,为优势菌。该属细菌也属于β-变形杆菌,革兰氏阴性无孢子短杆菌,氧化酶阳性,过氧化氢酶阴性。在温泉水[28-29]和饮用水[30]中均可分离到此属细菌,另外在被石油污染的土壤[31]中也曾被分离出来,因此Aquabacterium可用于石油污染的微生物修复工程。

下汤的优势菌群为VogesellaAcinetobacter,分别占29%和25%,Vogesella在其他几个温泉中含量极低(≤0.2%),这可能与下汤的地理位置以及独特的微环境有关。Vogesella为革兰氏阴性的短杆状细菌,无色素,可从温泉水[32]、河水[33-34]、湖水[35]、池塘[36]中分离得来,在碱性土壤[37]中也可分离到此类细菌。

3.3 鲁山五大温泉水的细菌多样性

本研究采用Illumina HiSeq2500 PE250扩增子测序技术对河南鲁山五大温泉水细菌的群落组成进行分析,一共注释鉴定获得40个门239个属。在鉴定的40个门中,变形菌门在五大温泉中的所占比例最多,是优势菌。已有研究表明,变形菌门作为优势群落存在于厦门近海温泉的沉积物[38]和云南洱源牛街温泉中[39];Ruckmani等[40]在研究印度高止山脉西部温泉水细菌构成时,显示优势菌为蓝藻门,其次是变形菌门。Bohorquez等[41]在研究哥伦比亚安第斯山脉的酸性温泉时发现变形菌门、硬壁菌门等是主要微生物群落。总之,世界各地的温泉含有丰富的微生物,优势细菌群主要是以蓝藻门、变形菌门和产水菌门为主[42]

鲁山五大温泉水细菌的种类与结构存在一定的差异。我们研究发现上汤和温汤的物种丰富度和均匀度均高于神汤、中汤和下汤,而中汤的物种丰富度和均匀度是最低的,这可能与上汤(51℃)和中汤(58 ℃)的温度有关,上汤的温度最有利于大部分嗜热菌的生长。另外中汤和温汤的地理位置相差不大,但是微生物分布却相差极大,这可能与两温泉的温度有极大关系。张丽娜等[43]在研究河北承德地区2个不同温度的温泉水细菌多样性时,发现温度是影响温泉水细菌多样性的重要因素。而在鲁山五大温泉中,上汤水温51 ℃,中汤58 ℃,下汤44 ℃,温汤44.5 ℃,神汤47 ℃,说明温度可能是影响鲁山五大温泉水细菌多样性的因素之一。

研究发现原核生物基因组中16S rRNA基因存在异质性,因此基于16S rRNA基因的菌群多样性分析会引起一定程度的高估[44]。因此本研究中对于鲁山五大温泉水细菌多样性的初步分析可能会存在一定程度的高估,因此还需结合其他技术进一步深入研究,从而能更加清楚地理解温泉生态系统中微生物的群落特征和优势菌群所发挥的作用。

4 结论

温泉水中含有丰富的微生物资源,具有很高的科研与应用价值。我们首次采用高通量测序分析了河南鲁山的上汤、中汤、下汤、温汤和神汤五大温泉水的细菌多样性和群落结构,发现河南鲁山五大温泉含有丰富的微生物资源,特别是Aquabacterium(21.57%)、Tepidimonas (17.76%)、Vogesella (5.89%)、不动杆菌属(Acinetobacter) (8.23%)、Sphingopyxis (2.36%)的微生物。其中不动杆菌属(Acinetobacter)、SphingopyxisAquabacterium可用于微生物修复工程,新鞘脂菌属(Novosphingobium)作为新型的抗菌剂在临床上具有较高的应用价值。本研究为该地区嗜热微生物的开发以及温泉生态系统的进一步深入研究提供可靠的依据。

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