淀粉是自然界储量最丰富的碳水化合物之一，不仅是人和动物的主要营养来源，也是重要的工业原料。工业生产中，首先需要将淀粉进行酶解变成单糖或寡糖。根据用于酶解的淀粉底物是否经过糊化(蒸煮或高温喷射)，一般可将酶解过程分为常规酶解(对应常规发酵)和生料酶解(对应生料发酵)两类^[1]。

常规酶解过程中，淀粉首先需要经过高温蒸煮(95−115 ℃，甚至更高温度)进行糊化和液化，该过程需要消耗大量的能源^[2]。生料酶解(生料发酵)无需淀粉喷射液化工序，因此可以降低能源消耗、节省投资和运行成本，在酒精发酵、白酒、黄酒和食醋的生料酿造工业中具有广阔的应用前景^[3-5]。

生淀粉酶可以水解生淀粉颗粒，是生料酶解(生料发酵)的关键酶制剂，近年来备受国内外学者的关注。目前，其主要来源有两类。第一类生淀粉酶来源于真菌，如Aspergillus niger、Rhizopus oryzae、Aspergillus kawachi等^[3-6]，该类生淀粉酶是由真菌α-淀粉酶和真菌糖化酶复配而成的复合酶，最适pH一般为4.5−5.0左右^[7]。第二类生淀粉酶来源于细菌，如Bacillus cirulans、Paenibacillus polymyxa。研究发现，上述细菌可以产生某些特殊的淀粉酶，这类淀粉酶在无其他酶协助的情况下可以水解生淀粉颗粒，在淀粉颗粒上形成孔洞生成多孔淀粉和还原糖^[8-10]。

本论文从土壤样品中分离筛选到多株对生淀粉具有降解能力的微生物，对其中产酶较高的菌株GEL-09进行了鉴定，并命名为Bacillus sp. GEL-09。此外，对其培养基成分、发酵条件进行了优化，并对该酶的酶学性质进行探究。目前尚无该菌株产生淀粉酶的相关报道，本论文的研究结果进一步拓宽了细菌生淀粉酶的菌株来源，可为生淀粉酶的研究和应用提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 样品采集

分离菌种的土样采自广西南宁市武鸣区、邕宁区木薯田10 cm−20 cm浅层土壤，共16份土壤样品。

1.1.2 主要试剂和仪器

NaCl、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、酵母粉、蛋白胨、玉米浆、牛肉膏、葡萄糖、麦芽糖、果糖、甘油、蔗糖、可溶性淀粉、琼脂粉等试剂购自国药集团化学试剂有限公司；木薯淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉等购自超市；16S rRNA基因扩增引物由上海捷瑞生物技术有限公司合成；PrimeStar DNA聚合酶、pMD18-T载体等购自大连TaKaRa公司；基因组抽提试剂盒、胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒等购自北京天根生化科技有限公司；其他试剂为国产分析纯。

安捷伦1200 HPLC色谱仪、安捷伦1200系列示差检测器，安捷伦科技(中国)有限公司；Thermo APS-2 HYPERSIL (4.6 mm×250 mm)色谱柱，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2 培养基

LB培养基(g/L)：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，琼脂15.0，pH 7.0，0.1 MPa灭菌20 min。

富集培养基(g/L)：葡萄糖20.0，胰蛋白胨20.0，可溶性淀粉5.0，NaCl 10.0，pH 7.0，0.1 MPa灭菌20 min。

平板筛选培养基(g/L)：牛肉膏0.5，酵母粉10.0，KH₂PO₄ 20.0，MgSO₄·7H₂O 0.5，琼脂15.0，pH 7.0，0.1 MPa灭菌30 min；其中木薯淀粉需经过160℃干热灭菌2 h，在灭菌后的其他组分冷却至45 ℃时采用无菌操作加入灭菌的培养基中(终浓度20.0 g/L)，快速振荡混匀倒平板，冷却凝固后备用。

种子培养基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，pH 7.0，0.1 MPa灭菌20 min。

发酵培养基(g/L)：蛋白胨20.0，K₂HPO₄ 2.0，MgSO₄ 0.5，木薯生淀粉10.0。其中木薯生淀粉先干热灭菌，再在无菌条件下加入培养基中。发酵条件为30 ℃、200 r/min。

1.3 菌株的分离筛选

称取2 g土样放入250 mL锥形瓶，加入20 mL无菌生理盐水。置于磁力搅拌器上搅拌约30 min，取悬浊液80 ℃热处理15 min杀死营养体细胞，然后在37 ℃、200 r/min富集培养24 h。取富集培养菌液进行梯度稀释(10³、10⁴、10⁵和10⁶)，取稀释液50 μL涂布在以木薯淀粉为唯一碳源的平板筛选培养基上，30 ℃培养2 d。观察菌落生长情况，滴加0.05%稀碘液测定菌落周围的透明圈直径(D)和菌落直径(d)，并计算其比值。选取比值大的菌落作为初筛菌株，接种到发酵培养基中进行培养，30 ℃、200 r/min振荡培养3 d。培养液经过12 000 r/min离心5 min收集上清液，测定发酵上清液中的生淀粉酶活力，从中选取酶活高的菌株划线到斜面培养基中培养并保藏，用于后续鉴定^[11]。

1.4 16S rRNA基因序列分析

将酶活力最高的菌株重新接种LB培养基中，37 ℃、200 r/min培养过夜，提取该菌的总DNA作为PCR模板。采用细菌16S rRNA基因通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。PCR反应体系：5×PS Buffer 10.0 μL，基因组DNA (50 ng/μL) 1.0 μL，27F和1429R (20.0 μmol/L)各0.5 μL，dNTPs混合物(2.5 mmol/L) 4.0 μL，PrimeSTAR^® HS DNA聚合酶(2.5 U/μL) 0.5 μL，ddH₂O补足50.0 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经过纯化、加A、胶回收后，连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌JM109。挑取转化子培养后提取质粒，经琼脂糖凝胶电泳检测后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果提交GenBank数据库进行核苷酸序列同源比对。用ClustalW 2.0软件进行多重序列比对分析，然后用MEGA 7.0软件(Neighbor-Joining法)构建系统发育树^[12]。

1.5 生淀粉酶活力测定方法

准确吸取2 mL 2%木薯淀粉悬浮液置于20 mL比色管中；加2 mL 50 mmol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液摇匀，于50 ℃恒温水浴摇床中预热5 min；然后加入1 mL适当稀释的发酵上清液(稀释后酶活力约为4–5 U/mL)，立即摇匀并计时；于50 ℃、160 r/min反应1 h，加入0.5 mL 4% (质量体积比) NaOH终止反应，最后取1.5 mL反应液于5 000 r/min离心5 min。取1 mL上清液，立即加入0.8 mL DNS溶液摇匀。沸水浴中煮沸5 min，立即在冰水中冷却。同样条件下用缓冲液代替酶液作为空白。上述反应体系加蒸馏水补足体积至13 mL，混匀后用1 cm比色皿在540 nm波长下测吸光度(OD₅₄₀)。

酶活力(U)定义为：在上述分析测定条件下，1 min水解生淀粉产生1 μg还原糖(以麦芽糖计)所需的酶量定义为一个酶活力单位^[13]。

1.6 糊化淀粉酶活力的测定方法

除反应底物替换为糊化的淀粉外，其余与生淀粉酶活力的测定方法相同。

1.7 生淀粉降解能力(Raw starch digestion ability，RDA)计算

RDA=B/A×100%

其中，B为降解生淀粉酶活，A为降解糊化淀粉酶活。

1.8 生淀粉酶的分离纯化及蛋白含量测定

发酵液于4 ℃、10 000 r/min离心20 min收集发酵上清液。采用70%的(NH₄)₂SO₄进行盐析，4 ℃、50 r/min缓慢搅拌过夜，然后4 ℃、10 000 r/min离心20 min收集沉淀。沉淀复溶后，在pH 7.0 0.02 mol/L Na₂HPO₄和0.01 mol/L柠檬酸缓冲液中透析过夜。样品离心并用0.4 μm膜过滤后用于色谱纯化。利用AKTA prime蛋白纯化系统，以DEAE阴离子交换色谱柱为分离柱进行纯化，280 nm紫外在线监测收集目的组分，分部收集含生淀粉酶活性的洗脱液。蛋白含量采用Bradford方法测定，以牛血清蛋白为标样制作标准曲线。

1.9 发酵条件优化

如无特别说明，以筛选液体发酵培养基作为初始发酵培养基，250 mL三角瓶装液量为50 mL，接种量为2.5% (体积比)，30 ℃、200 r/min培养48 h后测定酶活力。

分别对碳源种类(木薯淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、葡萄糖、麦芽糖、果糖、甘油、蔗糖)及浓度(0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%)进行优化；对氮源种类[NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、酵母粉、蛋白胨、玉米浆、牛肉膏、豆饼粉]及浓度(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0 %和6.0%)进行优化；初始pH (5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5)^[14]和发酵温度(20、25、30、33、35、37和40 ℃)等条件进行优化^[15]。前一个优化结果用于后续优化实验。所有实验均做3个平行。

在上述优化的基础上每隔12 h取样，总发酵时间120 h，对所取样品分别测定菌体浓度(OD₆₀₀)和发酵上清液中的生淀粉酶活力，并绘制菌株生长曲线和产酶曲线。

1.10 生淀粉酶酶学性质分析

1.10.1 最适pH及pH稳定性

配制不同pH值(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的缓冲液代替1.5酶活力测定方法中的pH 7.0磷酸盐缓冲液，分别在50 ℃下测定酶活力，考察酶的最适作用pH。所用的缓冲体系分别为醋酸缓冲体系(pH 3.0−5.0)和磷酸盐缓冲体系(pH 5.0–8.0)。以最高酶活为100%，其余酶活为相对酶活^[16]。

1.10.2 最适温度及温度稳定性

以木薯生淀粉为底物，50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)在不同温度下(40、45、50、55和60 ℃)测定生淀粉酶酶活力以确定最适反应温度。以最高酶活为100%，其余酶活为相对酶活^[17]。

1.10.3 不同来源淀粉酶对生淀粉水解能力对比

考察菌株GEL-09所产酶与其他来源淀粉水解酶对生淀粉水解能力的异同。其他几种淀粉水解酶为α-淀粉酶(来源于地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis)、生麦芽糖淀粉酶(来源于嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillus stearothermophilus)和β-淀粉酶(来源于甘薯Dioscorea esculenta)。根据1.5和1.6测定几种酶水解生淀粉和糊化淀粉底物的酶活力，计算其生淀粉降解能力。

2 结果与分析 2.1 菌株筛选及鉴定

2.1.1 菌株筛选

初筛得到水解圈较明显的58个菌落，点种到筛选平板，经碘液染色挑取其中7个透明圈明显的菌落。接种到液体发酵培养基中，培养3 d后离心收集上清液，测定生淀粉酶活力，从中筛选出酶活力最高(153.3 U/mL)的菌株，命名为GEL-09。进一步测定其RDA值，结果显示粗酶的RDA值为36.7%。

2.1.2 菌株鉴定

平板筛选培养基上的菌落边缘光滑，凸起，呈乳白色，表面湿润，呈白蜡状，易挑起，不起皱，培养时间长菌落会带有黄色。显微观察菌体为长杆状，可见椭圆形芽胞，革兰氏染色呈阳性(图 1)。

以该菌株基因组为模板，通过PCR获得其16S rRNA基因片段，测序后提交NCBI数据库进行BLAST同源比对，分析发现该菌株与阿氏芽胞杆菌Bacillus aryabhattai B8W22的16S rRNA基因一致性为99.8%。如图 2所示，基于16S rRNA基因序列所构建的系统发育进化树也呈现出稳定的亲缘关系。结合菌株的形态特征、16S rRNA基因序列比对及系统发育树分析，表明该菌株属于芽胞杆菌目(Bacillales)芽胞杆菌科(Bacillaceae)芽胞杆菌属(Bacillus)。将菌株GEL-09初步鉴定为芽胞杆菌Bacillus sp. GEL-09 (GenBank登录号为MG654640)。

2.2 发酵条件优化

2.2.1 碳源对菌体生长及产酶的影响

碳源优化结果如图 3A所示，不同种类淀粉为碳源时菌体浓度较低，但是产酶活力较高；单糖、二糖、甘油为碳源时，虽然产酶效果较差，但是菌体生长好于多糖(淀粉)为碳源时的生长情况。以葡萄糖为碳源时菌体浓度最高，但是产酶水平最低。麦芽糖为碳源时酶活力高于单糖(葡萄糖、果糖)；玉米淀粉为碳源时产酶水平最高，是葡萄糖为碳源时酶活力的3.3倍。不同碳源对菌株GEL-09的生淀粉酶产量影响规律为：多糖 > 寡糖 > 单糖。可见，聚合度较高的糖更有利于诱导生淀粉酶的生成。

在不同碳源优化的基础上，进一步研究了不同浓度玉米淀粉对菌株GEL-09产酶的影响。如图 3B所示，在低浓度时(0.5%−3.0%)，随着玉米淀粉浓度的增加生淀粉酶活力逐步增加；当浓度达到3.0%时，生淀粉酶活力达到最高。进一步增加玉米淀粉浓度菌株的产酶量缓慢降低，这可能是因为过高浓度的玉米淀粉导致培养基黏度增大，传质效率降低，尤其是氧气的传递，因而不利于生淀粉酶生成。因此，玉米淀粉的最佳浓度为3.0%。

2.2.2 氮源对菌体生长及产酶的影响

分别选择不同种类的无机氮源[NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、NaNO₃]和有机氮源(酵母粉、蛋白胨、玉米浆、牛肉膏、豆饼粉)用于菌株GEL-09的发酵产酶。如图 4A所示，无机氮源为唯一氮源时，菌体生长及产酶水平明显低于用有机氮源时的结果。以牛肉膏为氮源时，菌体浓度和酶活力分别是以NaNO₃为氮源时的8.2倍和7.1倍。其原因可能是有机氮源营养更加丰富，更加有利于菌株GEL-09的生长和产酶。

此外，当分别以酵母粉和牛肉膏为为唯一氮源时最有利于菌体生长和产酶。因此，将二者以1:1的比例混合成为复合氮源，用于后续氮源浓度优化实验。如图 4B所示，与碳源浓度优化时的规律类似，在低浓度时(1.0%−4.0%)随着复合氮源浓度的增加产酶水平逐渐增加；当浓度超过4.0%时，生淀粉酶活力逐渐下降。因此，复合氮源的最佳浓度为4.0%。

2.2.3 初始pH对菌体生长及产酶的影响

以成分优化后培养基为发酵培养基，培养基初始pH分别调整为5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，在30 ℃、200 r/min振荡培养48 h，取样测定菌体浓度和酶活力。如图 5所示，菌体浓度和产酶水平与培养基初始pH之间的关系基本一致。在pH低于7.0时，随着pH的升高菌体浓度和酶活力逐渐增加；当pH高于7.0时，随着pH的增大菌体浓度和酶活力都呈下降趋势，其中酶活力下降幅度更大。培养基初始pH为7.0时酶活力达到最高值，因此菌株GEL-09的发酵培养基的最适初始pH值为7.0。

2.2.4 发酵温度对菌体生长及产酶的影响

将菌株GEL-09接种于优化后的发酵培养基中，分别置于不同的发酵温度(20、25、30、33、35、37和40 ℃)条件下振荡培养48 h，取样测定菌体浓度和酶活力。如图 6所示，在温度低于30 ℃时随着发酵温度的升高菌体浓度逐渐增加；当发酵温度在30−37 ℃时菌体浓度变化不大；当发酵温度提高到40 ℃时菌体浓度迅速下降。发酵温度对生淀粉酶产量的影响规律与对菌体生长的影响不同，在发酵温度低于35 ℃时随着温度的升高酶活力逐步增大；当发酵温度达到37 ℃时酶活力有所降低；当发酵温度达到40 ℃时酶活力迅速降低到最高酶活力的26%。因此，菌株GEL-09的最佳发酵温度为35 ℃。

2.2.5 菌株GEL-09的生长及产酶曲线

在最佳培养基和培养条件下，延长发酵时间到120 h，中间每隔12 h取样测定菌株GEL-09的生长及产酶情况，并绘制相应发酵曲线。如图 7所示，0−12 h为菌株GEL-09的生长延滞期，此后进入对数生长期；在发酵时间为72 h以后进入稳定期；96 h以后进入衰亡期。酶活力增长趋势与菌体生长总体一致并略有滞后，酶活力在96 h达到最高，为430.6 U/mL。依据酶发酵动力学曲线判断菌株GEL-09所产的生淀粉酶属于生长半耦联型。

2.3 生淀粉酶酶学性质分析

2.3.1 生淀粉酶最适pH

最适pH测定结果如图 8所示，生淀粉酶的最适pH为7.0；在pH 7.0−7.5酶活力保留90.7%以上；在pH 6.5−8.0酶活力保留65.2%以上；在pH 6.0相对酶活力为55.1%。当pH低于5.5时相对酶活力仅有不到42.4%。由此可见，菌株GEL-09所产生淀粉酶为pH中性酶。

2.3.2 生淀粉酶最适反应温度

为了测定该酶的最适反应温度，以生淀粉为底物在不同温度条件下(40−60 ℃)测定该酶的相对酶活力。如图 9所示，生淀粉酶的最适温度为50℃，当温度低于或高于50 ℃时活力下降明显；在40、55和60 ℃分别保留38.4%、59.6%和52.0%的酶活力。因此，该生淀粉酶为中温酶。

2.3.3 不同来源淀粉酶利用生淀粉能力对比

以4 mL 1%木薯淀粉悬浮液或糊化木薯淀粉溶液为底物，在pH 7.0、50 ℃条件下分别与1 mL稀释的GEL-09生淀粉酶(稀释后酶活力约为4–5 U/mL)、α-淀粉酶、生麦芽糖淀粉酶和β-淀粉酶混合，在恒温水浴摇床中振荡反应，分别测定不同酶的RDA值。如表 1所示，其他3种淀粉水解酶中的甘薯β-淀粉酶对生淀粉水解能力最低，地衣芽胞杆菌α-淀粉酶次之，嗜热脂肪芽胞杆菌生麦芽糖淀粉酶的RDA值为6.76%，具有一定的生淀粉水解能力。GEL-09生淀粉酶RDA值为62.3%，分别是其他3种淀粉水解酶RDA值的107.4、48.7和9.2倍。可见，本研究中的植物来源β-淀粉酶基本没有水解能力；微生物来源淀粉水解酶对生淀粉具有一定的水解能力，但是不同来源微生物淀粉水解酶之间的生淀粉水解能力具有明显差别。

3 讨论

常见的工业发酵细菌菌株有乳酸菌、芽胞杆菌、谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌等，它们的最适发酵pH一般为中性，在pH 7.0左右^[4]。然而，已有的生淀粉酶主要是来自真菌的酸性酶，最适pH一般为4.5−5.0左右^[6-7]，与细菌最适发酵pH相差较大。如将细菌与来自真菌的酸性生淀粉酶同步糖化发酵，需要在pH控制上做出调整，控制在pH 5.5−6.0。该pH不是任何一方的最佳条件，因此会造成酶活力损失或者菌种活力不够，导致酶解或发酵效果不佳。筛选高活性中性生淀粉酶可能是克服现有技术不足的有效途径之一。

本研究筛选到一株产中温、中性生淀粉酶的芽胞杆菌GEL-09，该菌株与阿氏芽胞杆菌Bacillus aryabhattai B8W22的16S rRNA基因一致性为99.8%。据报道阿氏芽胞杆菌在不同自然环境中都有分布，如海水、污泥、土壤、植物根系等，被广泛用于植物生长促进剂和有机磷降解^[18]。虽然有少量关于该菌产植酸酶和天门冬酰胺酶的报道^[19]，但至今尚未有关于阿氏芽胞杆菌产生淀粉酶的报道，因此，我们对分离到的产生淀粉酶阿氏芽胞杆菌发酵条件以及所产酶的性质进行了初步的研究。

培养基摇瓶优化结果显示，虽然单糖更有利于菌株GEL-09的生长，但是对产酶却不利，当选用3.0%的玉米淀粉作为碳源时产酶水平最高。由氮源优化结果可知，有机氮源更有利于菌体生长及产酶，其中酵母粉有利于菌体生长，牛肉膏为唯一氮源时产酶水平最好。将上述两种有机氮源进行复配得到混合氮源，优化了复合氮源的最佳浓度。罗军侠等发现2.0%的玉米粉和1.5%的蛋白胨更有利于曲霉产生酸性生淀粉酶^[7]。夏媛媛等筛选到的一株Paenibacillus，菌株的最佳碳源为玉米粉，最佳复合氮源为酵母粉:玉米浆(2:1)，氮源最佳浓度为1%^[11]。周新尚等对筛选到的一株假单胞菌产酶条件进行了优化，采用的碳源为玉米淀粉，氮源为蛋白胨和牛肉膏^[14]。可见，不同种类生淀粉酶产生菌株虽然种类差别较大(有真菌也有细菌)，但是最佳碳源比较接近，以玉米粉或玉米淀粉为主；而氮源种类相对较多，有酵母粉、牛肉膏、玉米浆、蛋白胨等，但也都为有机氮源。此外，对比不同报道的培养条件发现，初始pH一般为7.0，培养温度以30−37 ℃为主^{[11, 13, 16]}。然而，周新尚等研究发现分离自海洋淤泥的假单胞菌ZXS-1最适发酵温度为25 ℃^[14]，明显区别于其他菌株。

虽然产生淀粉酶细菌最适发酵温度和pH分别为30−37 ℃和pH 7.0左右为佳，但是不同微生物产酶的最适温度和最适pH差别较大。本研究中获得的生淀粉酶为中温、中性酶，最适温度为50 ℃，最适pH为7.0。夏媛媛等^[11]报道的Paenibacillus菌株所产酶最适温度和pH分别为40 ℃和4.2；曾丽娟等^[13]筛选得到的Paenibacillus sp.菌株的最佳温度为50 ℃，最适pH为5.6。虽然2株菌都属于Paenibacillus属，但是二者的酶学性质在最适温度和pH都有明显差异，可见即使分类比较接近的菌株所产的生淀粉酶也存在明显差异。此外，生淀粉降解能力测试发现，本研究中生淀粉酶的RDA值略高于曾丽娟等^[13]报道Paenibacillus菌株所产酶的RDA值。

4 结论

本研究从木薯田浅层土壤样品中筛选出一株生淀粉酶活力较高的菌株GEL-09。通过形态观察、16S rRNA基因序列比对分析，该菌被鉴定为芽胞杆菌Bacillus sp. GEL-09。对其培养基和发酵条件进行了优化，优化后其生淀粉酶酶活力在96 h达到最高(430.6 U/mL)，是优化前的2.8倍；根据酶发酵动力学曲线判断该菌株生淀粉酶发酵属于生长半耦联型。该酶的最适温度为50℃，最适pH为7.0，说明该酶为中温、中性酶。生淀粉降解能力测试发现，该酶的RDA值明显高于甘薯β-淀粉酶、地衣芽胞杆菌α-淀粉酶和嗜热脂肪芽胞杆菌生麦芽糖淀粉酶的RDA值，进一步证明该酶具有较好的生淀粉水解能力。