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文章信息
- 张锐, 张奇亚
- ZHANG Rui, ZHANG Qi-Ya
- 大鲵蛙病毒编码96L蛋白(ADRV-96L)的腺苷三磷酸酶活性和促进细胞生长作用
- Adenosine triphosphatase activity and cell growth promotion of Andrias davidianus ranavirus 96L-encoded protein (ADRV-96L)
- 微生物学通报, 2018, 45(5): 1090-1099
- Microbiology China, 2018, 45(5): 1090-1099
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170945
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文章历史
- 收稿日期: 2017-11-12
- 接受日期: 2018-02-06
- 网络首发日期(www.cnki.net): 2018-03-16
2. 中国科学院大学 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
研究者们已从患病水产动物中分离鉴定了不同的病毒病原,并解析了上百株水生动物病毒基因组[1]。大鲵蛙病毒(Andrias davidianus ranavirus, ADRV)就是其中之一,也是本实验室从患系统性出血症的中国大鲵组织中分离到的一株致死性病毒病原[2]。经鉴定ADRV是虹彩病毒科Iridoviridae蛙病毒属Ranavirus的成员[3]。ADRV对我国野生两栖动物和养殖大鲵都造成严重危害,而且蛙病毒属成员也是引起鱼、蛙、鳖等多种水生动物严重系统性疾病的滥感染性病原[4]。在对亲缘关系分类及对基因组进行多重序列比对之后,明确虹彩病毒科有26个核心基因[5],这些基因结构的高度保守性预示其功能的重要性,而编码腺苷三磷酸酶(ATPase)的基因位列其中。虽对虹彩病毒ATPase基因进行了克隆和表达[6-7],但迄今尚未见这一虹彩病毒基因功能的相关报道。
ATPase是参与氧化磷酸化和生物体能量转换的核心酶,在所有生命形式中都有重要作用[8-12]。因ATPase的作用,如ATP合成和/或水解、F-或是否含旋转马达结构及运输离子种类等不同而分为不同类型[13]。本实验室已解析3株虹彩病毒基因组[2, 14-15],并在阐明其中多个病毒基因结构与功能[16-17]的基础上,经序列比对分析得知大鲵蛙病毒开放阅读框96L (ADRV-96L)不仅是虹彩病毒核心基因之一,而且能编码AAA-ATPase (与各种细胞活动相关的ATPase,ATPase associated with a variety of cellular activities)。这类酶是具有高度保守结构域Walker A和Walker B的蛋白,并与各种细胞活动相关的三磷酸腺苷酶[18-19]。基于生物信息学分析显示ADRV-96L与已知AAA-ATPase基因有高度同源序列,推测这是一个与病毒复制或病毒-宿主相互作用的关键基因。但由于虹彩病毒ATPase基因表达产物的纯化及其酶活性测定有困难,其功能也一直未被证实。
虹彩病毒呈世界性分布,能感染无脊椎动物、鱼类、两栖类和爬行类[1]。对虹彩病毒基因结构与功能开展研究,将有助于揭示特定基因对该病毒复制及与宿主相互作用的影响,阐释虹彩病毒广泛的地域性、宿主分布及其跨种传播的分子机制[20-21],进而为感染鱼、蛙、鳖等多种水生动物的病毒病预警与防控提供依据。因此,拟针对ADRV-96L的结构与功能开展研究。为查明ADRV-96L是否有ATPase活性?对病毒复制和细胞生长又有何影响?本文对大鲵蛙病毒基因ADRV-96L的克隆、表达、产物提纯及其对病毒复制和细胞生长影响进行了测试、分析。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 目的基因、菌种及质粒ADRV基因组DNA由本实验室制备并保存[2];基因克隆菌Escherichia coli Top10、原核表达宿主菌E. coli BL21(DE3)菌株与质粒pET32a(+)均为本实验室保藏;pMD18-T载体购自TaKaRa公司。引物合成和基因测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.1.2 主要试剂、仪器与培养基Taq DNA聚合酶、限制性内切酶EcoR Ⅰ与Hind Ⅲ、胶回收试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;T4连接酶、氨苄青霉素购自宝生物工程(大连)有限公司;DNA Marker、Protein Marker购自北京全式金生物技术有限公司;IPTG购自美国Sigma公司;高纯度质粒小量提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司;Ni-NTA His-Bind亲和层析柱购自美国Novagen公司;超微量总ATP酶测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;其他试剂为国产或进口分析纯。
核酸电泳仪购自北京市六一仪器厂;PCR仪、蛋白电泳仪、酶标仪购自美国Bio-Rad公司;超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物技术股份有限公司;高压灭菌器购自日本Hirayama公司;离心机购自美国Beckman公司;水浴锅购自上海新苗医疗器械制造有限公司;凝胶成像系统购自美国Syngene公司。
LB (Luria-Bertani)液体培养基(g/L):酵母提取物5.0,胰蛋白胨10.0,氯化钠10.0,pH 7.0;LB固体培养基:在LB液体培养基中加入含量为1.5%的琼脂粉;培养基1×105 Pa灭菌30 min。
抗性平板制备:待灭菌后的LB固体培养基温度降至50 ℃左右,加入抗生素至终浓度为50 µg/mL,摇匀后倒平板。
1.2 实验方法 1.2.1 序列比对参照已发表的大鲵蛙病毒(Andrias davidianus ranavirus,ADRV)基因组信息[2],由ADRV开放阅读框ORF 96L推导蛋白(ADRV-96L)的氨基酸序列。同时,从NCBI数据库下载7个物种与ADRV-96L同源蛋白序列,分别是:沼泽绿牛蛙病毒Rana grylio virus 16R (RGV16R,JQ654586)、虎纹钝口螈病毒Ambystma tigrinum virus 96L (ATV-96L,AAP33264)、淋巴囊肿病毒中国株(Lymphocystis disease virus-isolate China 209R (LCDV-C209R,NC_005902)、传染性脾肾坏死病毒Infectious spleen and kidney necrosis virus 123L (ISKNV123L,NC_003494)、山羊痘病毒Goat poxvirus A32L (GTPVA32L,JX683276)、鲫鱼Carassius auratus线粒体DNA ATPase6 (CCATPase6,AY714387)和斑马鱼Danio rerio线粒体DNA ATPase6 (DRATPase6,AC024175)。利用ClustalX软件对这8种同源蛋白进行多重序列对比,同时标注与各种细胞活性相关ATPase (AAA-ATPase)蛋白家族共享的保守模块序列。
1.2.2 原核表达质粒的构建及融合蛋白表达参照ADRV-96L的核苷酸序列,设计用于该基因PCR扩增和构建原核表达载体的引物:F (5′-AA AGAATTCATGGAACAAGTACCCATAAAGGA-3′)和R (5′-GAGAAGCTTAATCGTCCAAGTCCGAC TGG-3′),下划线部分为EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ的酶切位点。以制备的ADRV基因组DNA为模板(制备方法参见本实验室之前的报道[2]),利用上述引物进行PCR扩增。PCR反应体系:10×Taq Buffer 2.5 μL,dNTPs (2.5 mmol/L) 0.5 μL,MgCl2 (25 mmol/L) 2.5 μL,正、反向引物(1 pmol/L)各0.5 μL,模板DNA 1.0 μL,Taq Polymerase (1 U/μL) 0.5 μL,双蒸水补足至25 μL。PCR反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 10 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,使用DNA纯化回收试剂盒回收纯化,经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切、纯化后与载体pET32a连接,转化大肠杆菌DH5α。经抗性平板筛选后挑取克隆,菌落PCR检测含有目的基因的重组子,通过测序验证得到用于原核表达的重组质粒pET32a-96L。
将pET32a-96L转化表达菌DE3中,挑取单克隆,经鉴定阳性的菌株接种到200 mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中,37 ℃、250 r/min振荡培养2 h。用分光光度计测菌液的OD600值以确定细菌细胞密度值,当OD600值达到0.8时,加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG诱导表达。经24 ℃振荡培养10 h后,分别取1 mL诱导或未经诱导的菌液,于4 ℃、2 000 r/min离心10 min,分别收集上清与沉淀,对沉淀的菌体用超声波破碎,加上样缓冲液,煮沸使蛋白变性后进行12% SDS-PAGE电泳,经考马斯亮兰染色后观察蛋白表达情况。
1.2.3 蛋白纯化及酶活性测定将被诱导的菌液于4 ℃、2 000 r/min离心10 min收集菌体,按照培养液:缓冲液=1:10 (体积比)加入20 mL结合缓冲液(Binding buffer)重悬。经超声破碎,4 ℃、4 000 r/min离心30 min取上清,用组氨酸标签蛋白纯化磁珠,按操作流程介绍进行蛋白纯化。具体步骤是:将经超声波破碎后离心的菌上清样与磁珠混合,室温孵育1 h,磁性分离后保留磁珠,再依次分别用浓度为5、10、20、40、60、80、100、120、160、200、250和500 mmol/L的咪唑(Imidazole)洗脱液进行洗脱,收集各组分洗脱液;以未纯化的菌液作对照,取等体积各组分上样,经12% SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯化效果及相对含量,再辅以分光度计检测不同洗脱组分中的蛋白含量。
因为ATPase分解ATP能生成ADP及无机磷Pi,所以测定Pi的量就可以判断ATPase酶活性的高低,结合SDS-PAGE电泳结果,选择目的蛋白量较大、纯度较高的洗脱液组分,使用超微量ATPase测定试剂盒,按说明书(http://www.njjcbio.com/)进行酶活性测定。同时,也按该方法对经pET32a载体表达的硫氧还蛋白(Thioredoxin,Thx)进行纯化,作为测定酶活性时的对照样。步骤包括:将试剂一、二、三按照13:4:4 (体积比)的比例混合作为基质液备用,分别加入待测洗脱液组分,37 ℃孵育10 min,再加入终止剂终止反应。3 500 r/min离心10 min,分别取各上清液与显色剂反应,在636 nm处测定样品的吸光度。分别用双蒸水与0.02 μmol/mL磷标准液作为标准对照;将所制备的Thx用作酶活性测定的阴性对照,所测数据再按公式计算酶活性:待测样品中ATPase酶活性=(待测样OD636值
构建ADRV-96L真核表达质粒的引物是F (5′-AA AAAGCTTATGGAACAAGTACCCATAAAGGA-3′)和R (5′-TAGGAATTCCTAATCGTCCAAGTCCGA CTG-3′),其中各含Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切位点(见下划线处),经过测序验证。
在获得序列验证的重组质粒pcDNA3.1-96L后,使用转染试剂Lipofectamine 3000将重组质粒pcDNA3.1-96L或空质粒pcDNA3.1分别转入大鲵胸腺细胞系GSTC (Chinese giant salamander thymus cell)中(参见本实验室之前的报道[22]),48 h后按1:2 (体积比)传代至6孔板中,待细胞长成单层,加入终浓度为400 μg/mL G418进行筛选,持续筛选4周后分别获得稳定转染pcDNA3.1-96L或pcDNA3.1的2株细胞。分别制备这2株细胞的总RNA,逆转录成cDNA,进行ADRV-96L基因扩增,将产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,以鉴定稳定转染细胞。
1.2.5 稳定转染细胞生长曲线的绘制稳定转染细胞生长曲线的测定:用胰酶消化对数生长期的pcDNA3.1-96L稳定转染细胞,重悬、计数,通过调整培养液的体积使待测与对照细胞浓度一致。终浓度约为3×104个/孔,传至24孔板,25 ℃培养。每天各消化3孔细胞,用血球计数板分别计数,持续数日观察记录;同时,将空质粒pcDNA3.1转染的细胞设为对照。以时间(d)为横坐标,以细胞数(×104个)为纵坐标,绘制两种转染细胞的生长曲线。
1.2.6 病毒一步生长曲线的测定病毒一步生长曲线能反映病毒在宿主细胞中的复制情况。为了了解ADRV-96L过表达对ADRV扩增的影响,测定病毒在稳定转染pcDNA3.1-96L细胞中的一步生长曲线,方法参见本实验室的报道[23]。具体操作:将细胞传至24孔板中,待细胞长满单层后弃去培养基,每孔接入0.1 MOI (Multiplicity of infection)的ADRV,置于25 ℃孵育1 h,弃去孔中病毒液,然后加入新鲜培养基继续培养。在感染之后不同时间(0、4、8、12、18、24、36和48 h)分别收取感染细胞培养物,每个时间点分别收取3孔重复样,测病毒悬液的滴度(TCID50)。同时,按此操作步骤测定病毒在空质粒pcDNA3.1稳定转染细胞中的生长曲线,作为对照。以时间(h)为横坐标,以lg(TCID50)为纵坐标,绘制ADRV的一步生长曲线。
2 结果与分析 2.1 ADRV-96L的结构特征大鲵蛙病毒基因ADRV-96L编码的ATPase含有315个氨基酸,预测该蛋白的分子量约为35 kD。与AAA-ATPase蛋白酶家族其他成员一样,ADRV-96L拥有含Walker-A和Walker-B基序的保守模块,预示其具备结合底物及水解ATP的关键条件[24]。另外与来自沼泽绿牛蛙病毒、虎纹钝口螈病毒、淋巴囊肿病毒中国株、传染性脾肾坏死病毒、山羊痘病毒、鲫鱼线粒体DNA和斑马鱼7个不同物种线粒体DNA的同源蛋白结构却有所不同。前5种病毒蛋白都与AAA-ATPase共享保守序列模块,这个模块有Walker A (GXXXXGK[T/S],X代表任意氨基酸)和Walker B (hhhhD[D/E],h代表任意疏水性氨基酸)两个基序;此外,它们还共有2个保守的精氨酸位点(Arg,R),位于ADRV-96L约30-160氨基酸残基及其他同源蛋白相应的位置上(图 1)。
但是,山羊痘病毒GTPV32L缺少完整的AAA-ATPase的保守序列模块,如缺少Walker A基序,仅保留Walker B基序;而最后2种来自鱼线粒体的蛋白,鲫鱼线粒体DNA蛋白CCATPase6和斑马鱼线粒体DNA蛋白DRATPase6,则完全缺少AAA-ATPase的保守序列模块,不存在Walker A基序和Walker B基序。预示这3种蛋白不具备、或仅有很低的ATPase活性。
2.2 诱导表达的ADRV-96L融合蛋白将经诱导(IPTG)和未经诱导(–)的上清(Supernatant)及沉淀(Precipitation),分别经12% SDS-PAGE电泳,结果显示在52 kD的位置出现一条明显的差异带(图 2),与预期融合蛋白分子量大小相符(目的蛋白ADRV-96L为34 kD,加上His标签18 kD的融合蛋白)。显示ADRV-96L可被IPTG诱导表达。在经诱导的沉淀样品中这条带更浓,显示该蛋白在培养基中和菌体内都可表达,而被诱导的菌体在经超声波破碎后可获更多的目的蛋白。
使用超微量ATPase测定法,对这些原核表达产物中目的蛋白纯度和浓度均较高的洗脱液组分,如:含咪唑浓度分别为80、100和120 mmol/mL的组分进行了测定,结果显示它们都具有ATPase活性。进一步比较测试还显示,80 mmol/mL咪唑洗脱液中的相对酶活性更高,达到7.47 U/mg;100 mmol/L咪唑洗脱液中的酶活性次之,为4.68 U/mg;120 mmol/mL咪唑洗脱液中酶活性则更低,约为1.64 U/mg。这一结果表明:虽然120 mmol/L咪唑洗脱液中目的蛋白含量显著高于80 mmol/mL咪唑洗脱液,有良好的目的蛋白洗脱效果,但其中酶活性却显著较低,说明高浓度咪唑洗脱液对ADRV-96L的ATPase酶活性有重要影响。因此,要获得有较高ATPase酶活性的ADRV-96L,应尽量考虑使用浓度较低(如低于120 mmol/mL)的咪唑洗脱液。
2.3 纯化的ADRV-96L具有ATPase酶活性在镍柱纯化目的蛋白过程中,不同的洗脱组分中目的蛋白(含ADRV-96L的52 kD融合蛋白)的含量不同。电泳图谱显示:有些泳道有杂蛋白条带,如在未纯化的上清液(Unpurified supernatant,US)中或当咪唑浓度很低为5-20 mmol/mL时泳道未见目的蛋白条带。当咪唑浓度由40、60、80 mmol/mL升至120 mmol/mL时,目的蛋白的含量也随之增加(图 3)。经检测比较,在咪唑浓度分别为80、100和120 mmol/mL的洗脱液中,目的蛋白ADRV-96L的浓度分别为0.11、0.18和0.12 mg/mL。这说明使用100-120 mmol/mL的咪唑液洗脱能获得较高含量的ADRV-96L,但当咪唑洗脱液浓度超过160 mmol/mL后,目的蛋白含量又会逐渐降低(图 3)。
2.4 建成稳转细胞系分别对用真核表达载体pcDNA3.1-96L和pcDNA3.1转染细胞的总RNA浓度和纯度进行鉴定,经电泳显示它们的28S和18S条带完整,总量相当(图 4A),可用于反转录。
分别以来自病毒基因组DNA和2种稳转细胞系总RNA逆转录的cDNA为模板,进行ADRV-96L基因的扩增和PCR检测。结果仅从病毒基因组DNA和pcDNA3.1-96L稳转细胞的样品中扩增到特异的ADRV-96L条带;而从空载体pcDNA3.1转染细胞样中没有扩增到ADRV-96L条带(图 4B)。这证明稳转细胞系已构建成,而且能高效表达ADRV-96L基因。
2.5 ADRV-96L对细胞生长和病毒复制的影响对两种稳定转染的GSTC细胞生长曲线进行比较,结果显示:在第2天转染重组质粒pcDNA3.1-96L的细胞数量就要显著高于转染空质粒pcDNA3.1的细胞(图 5),而且这种状况一直持续到第4天。说明ADRV-96L能显著促进细胞生长和增殖。
比较ADRV在2种稳定转染的GSTC细胞中的一步生长曲线,结果显示:无论是在pcDNA3.1-96L或pcDNA3.1转染的细胞中,在感染后48 h pi (Hours post infection)的不同时间点病毒滴度都接近,变化趋势也一致(图 6)。说明ADRV-96L对病毒复制的影响不明显。
3 讨论与结论蛙病毒呈全球性分布[25],有广泛的无脊椎动物和低等脊椎动物宿主范围,还能跨种传播[26]。与其他大DNA病毒一样,蛙病毒基因组较大,而且也能编码与核酸、蛋白代谢相关的酶类。因此,鉴定和研究病毒酶类就成为认识虹彩病毒复制及病毒与宿主相互作用分子机制的突破口。本研究不仅从感染现存最大两栖动物物种——中国大鲵的虹彩病毒病原ADRV基因组中,克隆和表达了其编码ATPase的基因ADRV-96L,在构建稳转细胞的基础上,首次阐明虹彩病毒ATPase具有促进细胞生长的功能。这为深入研究虹彩病毒与低等脊椎动物的相互作用、不同虹彩病毒遗传变异和跨种传播提供了有价值的思路与研究材料。
已有文献涉及虹彩病毒的酶类基因,如密啶脱氧核糖核苷三磷酸酶(dUTPase)、胸苷酸合酶(Thymidylate synthase),胸苷激酶(Thymidine kinase)[27-29]等。但由于在当时有活性的病毒酶蛋白进行纯化分析相当困难,仅报道了这些病毒酶基因的克隆、表达和胞内分布的相关内容,而无法确定其对病毒复制或对宿主细胞的影响等基因功能。近期报道了纯化不同类型ATPase的方法[30],我们在参照、比较和反复优化这些方法的基础上,选用超微量法,从而获得有ATPase酶活性的原核表达产物,其活性可达7.47 U/mg。借助镍柱纯化和系列浓度咪唑液洗脱的方法,经反复测试在保持ADRV-96L酶活性的同时,试图获得浓度和活性都更高的纯化产物。虽然120 mmol/mL咪唑洗脱液中蛋白量最高,但酶的比活却不够高;而在80 mmol/mL咪唑洗脱液中蛋白含量较低,但酶比活最大。这表明用60-100 mmol/mL浓度范围的咪唑液洗脱能获得蛋白含量和酶活性都较高的纯化ADRV-96L。如果继续提升咪唑洗脱液浓度,虽然洗脱蛋白的含量会随洗脱液浓度升高而增加,但是会使酶活性显著降低。推测这可能是由于较高浓度的咪唑会使蛋白构象发生改变而使酶活性减弱或丧失。
ATPase的结构不同,其类型和功能也有所不同[31-32]。如山羊痘病毒A32L,虽也是大鲵蛙病毒ADRV-96L的同源物,并且具有ATPase活性,但该蛋白不同于AAA-ATPase与细胞活动相关,却被证明与病毒装配相关[33]。这可能与其缺少完整AAA-ATPase的保守序列模块、并在其C端有一个RGD基序[33]起作用有关。有证据表明RGD基序是病毒起始感染的结合位点,对病毒的感染力有影响[34]。在我们进行多重序列比对的同源物中,从ADRV、RGV、ATV、LCDV-C、ISKNV和GTPV这5个来自虹彩病毒、与ADRV-96L高度同源的蛋白,都具有与AAA-ATPase的Walker A和Walker B高度保守序列模块。推测它们会发挥蛋白降解、膜融合等与细胞活性相关的作用[35]。结果已证实,作为虹彩病毒的核心蛋白ADRV-96L的确有促进宿主细胞增殖的作用,但尚未检测到它对病毒复制的直接影响。这提示ADRV-96L是蛙病毒与宿主相互作用的一个重要蛋白,其功能可能类似一些肿瘤病毒的基因功能,如鱼类淋巴囊肿病毒中国株LCDV-C的胸苷激酶Thymidine kinase基因[28]、EB病毒的IL-13[36]等,通过这些病毒基因促进宿主细胞增殖,以利于产生更多的子代病毒、病毒的长期潜伏和病毒的再活化及其传播。
综上所述,本研究发现虹彩病毒的核心基因所编码的蛋白ADRV-96L具有促细胞增殖和生长的ATPase活性,这将可能为阐释虹彩病毒呈世界性分布和在低等脊椎动物之间跨种传播提供一个新的突破口。
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