吡啶及其衍生物属于氮杂环化合物，吡啶类废水主要来自矿业、煤和页岩油加工行业、木材防腐处理行业、医药和食品行业，以及染料制备和农业生产等^[1-2]。由于其高毒性和致癌性，吡啶类化合物已被美国国家环保局列为环境优先控制污染物^[2]。

2-吡啶甲酸是一种重要的吡啶类化合物，广泛用于医药、农药、日用化学品以及畜牧业食品添加剂的生产^[3-5]。由于极高的亲水性(溶解度=887 g/L，20 ℃)，2-吡啶甲酸可长期、稳定地存在于水体中从而对环境造成危害。迄今，已有报道显示好氧生物法可有效去除水中吡啶甲酸^[6]，降解菌主要包括节杆菌属(Arthrobacter)^[7]、芽孢杆菌属(Bacillus)^[8]和链霉菌属(Streptomyces)^[9]。2-吡啶甲酸在单加氧酶的催化下，位于N原子旁的α碳原子上引入一个羟基，生成6-羟基-2-吡啶甲酸；然后在双加氧酶的催化下，6-羟基-2-吡啶甲酸发生开环反应，同时脱去N原子生成酮戊二酸；最终，酮戊二酸矿化为无害的二氧化碳和水^[2]。现有文献尚没有定量描述2-吡啶甲酸的好氧生物降解特性，此外，2-吡啶甲酸是否可以被其它菌属的微生物利用也是未知的^[1-2]。

基于以上的研究背景，本文分离筛选了一株在好氧条件下以2-吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的新的菌株，通过细胞形态和核酸序列同源性分析对其进行了分类鉴定，并且考察了该菌株对2-吡啶甲酸的降解动力学，以了解其对2-吡啶甲酸的降解特性。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

2-吡啶甲酸(质量分数97%)和甲酸(质量分数95%)均为色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司；甲醇(质量分数99.90%)为色谱纯，美国Fisher Chemical公司；其它试剂均为国产分析纯。超纯水的电阻率= 18 MΩ/cm。

液相色谱仪、色谱柱，德国Sykam公司；扫描电镜，日本Hitachi公司；透射电镜，日本JEOL公司；PCR仪、DNA测序仪，美国Applied Biosystems公司；紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 菌株分离鉴定与形态观察

以某污水处理厂曝气池中的活性污泥为菌源，在含100 mg/L的2-吡啶甲酸无机盐培养液中^[10]，30 ℃、150 r/min下富集筛选，得到以2-吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的菌液，然后在固体培养基上纯化，分离出3株2-吡啶甲酸降解菌，分别命名为ZD1、ZD2和ZD3，选取ZD2做进一步研究。无机盐培养液配制方法见文献-[10]。固体培养基(g/L)：琼脂15.00，无机盐培养液Na₂HPO₄·12H₂O 7.00，CaCl₂·2H₂O 0.01，MgSO₄·7H₂O 0.02，2-吡啶甲酸0.10。

菌株ZD2的16S rRNA基因测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，登录GenBank通过BLAST数据库进行同源性比对，MEGA 6软件使用邻接法(Neighbo-Joining)构建系统发育树。

菌株ZD2接种至含100 mg/L的2-吡啶甲酸无机盐培养液中，30 ℃、150 r/min培养12 h，菌液4 ℃、2 000 r/min离心10 min，去除上清液收集细胞。使用扫描电镜和透射电镜对其进行形态观察，细胞样品的预处理见文献-[10]。

1.3 2-吡啶甲酸降解

菌株ZD2分别接种至含100-800 mg/L的2-吡啶甲酸无机盐培养液中(pH 7.0)。30 ℃、150 r/min下培养，于不同时间取菌液，4 ℃、8 000 r/min离心10 min，收集上清液，0.22 μm膜过滤3次获得样品，测量2-吡啶甲酸浓度(液相色谱法)。每个样品均重复3次，取平均值。对照实验：ZD2灭活(1×10⁵ Pa，20 min)，接种至以2-吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的无机盐培养液中，其余操作条件同上。

1.4 液相色谱

色谱柱：Reprospher 100 C18 (5 μm，150 mm× 4.6 mm)；流动相为含0.2%甲酸的水-甲醇体系(90:10)；流速1 mL/min，检测波长265 nm；进样体积20 μL；柱温30 ℃。

2 结果与讨论 2.1 菌株分离鉴定与形态观察

菌株ZD2在固体培养基上的形态特征：黄色、不透明，形状规则，大小均匀，表面光滑，边缘整齐(图 1)。

图 2为ZD2的扫描电镜照片，放大倍数10 000倍：细胞呈短杆状，长度在0.8 μm-4.0 μm之间。图 3A和B为ZD2的透射电镜照片，放大倍数分别为20 000倍和50 000倍。在图 3中，ZD2的细胞内都呈现出白色Ⅰ和黑色圆点Ⅱ，可能分别为内含物和核糖体；Ⅲ可能为在培养过程中菌株ZD2发生了溶胞。分析其原因：在以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的无机盐培养液中，当底物吡啶甲酸和代谢过程中的中间产物被ZD2完全矿化后，微生物进入内源呼吸阶段，此时细胞不能正常生长和分裂，从而导致细胞壁破裂(溶胞)。

由系统发育树(图 4)可知，菌株ZD2 (GenBank登录号为KP900020)与Chryseobacterium sp. P9的相似性高达100%，因此将菌株ZD2鉴定为金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)。金黄杆菌是由一群广泛存在于自然界的革兰氏阴性非发酵菌组成^[11]，包括脑膜脓毒金黄杆菌、产吲哚金黄杆菌、黏金黄杆菌等，属于条件致病菌，可引起脑膜炎、菌血症、心内膜炎、皮肤软组织感染等多种疾病^[12]。近年来，研究者们发现金黄杆菌可用来处理含多环芳烃^[13]、苯胺、苯酚、硝基苯、苯甲酸及甲苯^[14]、菠萝纤维素^[15]、乙酰甲胺磷等^[16]污染废水。然而，关于金黄杆菌对2-吡啶甲酸的降解目前尚没有报道。

2.2 2-吡啶甲酸降解

图 5显示了在以2-吡啶甲酸为唯一碳、氮和能源的无机盐培养液中，2-吡啶甲酸初始浓度为100 mg/L，最佳降解条件下(30 ℃，pH 7.0，0盐度)菌株ZD2的生长曲线。以浓度表示2-吡啶甲酸的降解。如图 5所示，菌株ZD2的延滞期为0-5 h，此阶段细胞数量增加较少；5-9.5 h为对数生长期，ZD2的繁殖速度最快，2-吡啶甲酸的基本降解发生在对数期。

2.3 2-吡啶甲酸好氧降解动力学

分别配制2-吡啶甲酸浓度为100、200、400、600和800 mg/L的无机盐培养液，在最佳降解条件下考察菌株ZD2对2-吡啶甲酸的降解。由图 6可以看出，当2-吡啶甲酸浓度为100、200、400、600和800 mg/L时，分别经过5、9、11、15和48 h后菌株ZD2开始快速降解2-吡啶甲酸，完全矿化所需时间分别为10、18、24、45和72 h。因此可以得出，随着2-吡啶甲酸初始浓度的增加，菌株ZD2完全降解2-吡啶甲酸所需要的时间越久，并且菌株ZD2适应期也随之延长。

对于2-吡啶甲酸的好氧降解动力学模型而言，公式(1)和(2)分别表示零级和一级动力学模型^[17]：

(1)

(2)

式中：a、b为常数；t为降解时间；c为底物浓度；k₀、k₁分别为零级、一级降解速率常数。

基于图 6中每一条降解曲线的线性范围数据，分别使用零级和一级动力学模型进行拟合(图 7)，发现零级动力学模型的相关系数R²明显高于一级动力学模型(表 1和表 2)。

当2-吡啶甲酸初始浓度范围为100-400 mg/L时，降解速率常数随着初始浓度的升高而增大，分析其原因可能是该浓度范围下的2-吡啶甲酸不能为菌株ZD2提供足够的碳源、氮源和能源，基质浓度相对于菌株生长处于非饱和状态，因此2-吡啶甲酸初始浓度越高其降解速率越快，这与文献-[17]的结果一致。当2-吡啶甲酸浓度增加到600-800 mg/L时，降解曲线仍然符合零级反应，但与初始浓度为400 mg/L时吡啶甲酸相比，其降解速率常数下降，底物抑制效应出现^[17]。

3 结论

(1) 分离筛选了一株好氧条件下以2-吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的菌株，16S rRNA基因序列分析鉴定该菌株为金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)，命名ZD2。

(2) 考查了不同初始浓度下该菌株对2-吡啶甲酸的降解性能，实验结果表明：随着2-吡啶甲酸初始浓度的增加菌株完全降解的时间也随之延长。

(3) 建立了2-吡啶甲酸的降解动力学模型，与一级动力学模型相比，零级动力学模型更好地拟合了初始浓度范围为100-800 mg/L的2-吡啶甲酸降解曲线。