副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，V. parahaemolyticus)是一种革兰氏阴性嗜盐性细菌，广泛分布于海洋和盐湖等环境中，主要污染海鱼、贝类和虾等海产品，可引起急性胃肠炎，临床症状包括腹泻、呕吐、恶心、腹部绞痛、低烧、寒战等，近50%以上的食物中毒由副溶血性弧菌引起，它是一种重要的食源性致病菌^[1]。上海作为全国重要口岸，每年进口大量海产品，尤其冰鲜类产品如大西洋鲑鱼、金枪鱼、海胆等，副溶血性弧菌是这些海鲜产品的必检致病微生物。由于新鲜程度是产品质量的关键因素，在海产品制备及运输过程中通常采用冷冻冷藏等处理工艺手段。但部分病原菌在低温及消毒剂、防腐剂作用下，可进入具有活性但不可培养状态^[2-3]。处于非可培养状态(Viable but non-culturable state，VBNC)的病原菌丧失了在传统培养基上生长繁殖的能力，采用常规培养检测法无法检出，但仍保留原有的致病性和毒力因子^[4-5]。VBNC状态作为病原菌抵御外界不良环境的存活机制，仍具有代谢活性和转录性，可在冷冻食品储存和输送过程中复活并大量繁殖，从而引发严重的微生物安全风险，威胁人体健康。据相关统计，在检验不合格的冷冻食品中，有害微生物的感染占了绝大多数，因此微生物残留已成为食品冷冻过程中的最大安全隐患。建立冷冻食品储存和运输系统中VBNC病原菌监测体系及有效控制方法，对于保障食品安全具有重要的现实意义。

随着分子生物学的发展，实时荧光PCR技术(qPCR)应用于快速检测食品中副溶血性弧菌。虽然该方法具有耗时短、精确度高的优点，但只能检测食品中总的细菌数，无法区分活性菌和非活性菌^[6]。叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide，PMA)作为一种新型的核酸染料，可以透过受损细菌的细胞膜与DNA发生共价交联反应，在光照作用下使DNA构象发生改变，抑制后续的PCR反应，但不会对活菌DNA产生影响^[7-11]。PMA-qPCR法不仅能选择性地检测活性菌，而且还具有快速、特异性强、灵敏度高等特点，能达到冰鲜类海产品的检测要求。本研究采取在冷冻环境中低温诱导三文鱼基质中的副溶血性弧菌使其进入VBNC状态，采用PMA-qPCR法来选择性检测不同冷冻时期副溶血性弧菌的数量，并与传统培养法比较，了解VBNC状态菌的动态，在此基础上探讨PMA-qPCR法应用于日常检测的适用性。

副溶血性弧菌ATCC 17802、溶藻弧菌ATCC 33787、创伤弧菌ATCC 27562、粪肠球菌ATCC 49452、铜绿假单胞菌ATCC 27853、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠杆菌ATCC 35218、迟缓爱德华氏菌ATCC 15947均购自上海汉尼生物技术有限公司；霍乱弧菌VbO FSCC 232004购自广东省食品微生物安全工程技术研发中心。所有菌株-80 ℃保存于10% (质量体积比)甘油肉汤中。

叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide，PMA)，美国Biotium公司；TIANamp Bacteria DNA Kit，TIANGEN公司；Premix ExTaq^TM，大连宝生物工程有限公司；脑心浸液培养基、缓冲蛋白胨水、营养肉汤、硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基，北京陆桥技术有限责任公司；弧菌显色培养基，上海欣中生物工程有限公司；CFX96 Real-Time System，美国Bio-Rad公司；PMA-Lite^TM LED Photolysis Device，美国Biotium公司；高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；ESCO生物二级安全柜，新加坡艺思高科技有限公司。

从甘油冻存管中取100 μL菌液接种到5 mL脑心浸液培养肉汤中，37 ℃、150 r/min振荡培养过夜。

按照GB4789.1-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验总则》的有关规定进行样品采集。无菌采集25 g三文鱼样品置于225 mL缓冲蛋白胨水的均质袋中，拍打均匀，分装到无菌罐中。添加副溶血性弧菌至终浓度为6.6×10⁵ CFU/mL，放置于-20 ℃。10、20、30和50 d后对取出样品解冻后立即进行检测。

用无菌PBS对菌液进行10倍梯度稀释，取稀释后的样品1 mL加入灭菌培养皿，倒入56 ℃恒温水浴的弧菌显色琼脂，轻轻摇匀，冷却后置生化培养箱，37 ℃恒温倒置培养24 h，每个梯度做3个平行对照，同时设PBS为空白对照。选取菌落数在30-300之间的平板进行菌落计数。

将2.5 μL 20 mmol/L PMA加到1 mL待测样品中，终浓度为50 μmol/L。上下混匀数次，使样品与PMA染料充分接触，避光反应5 min。将1.5 mL离心管置于冰上，LED灯照射15 min，距离20 cm。反应结束后8 000 r/min离心10 min，收集菌体。

副溶血性弧菌及各参考菌株，经37 ℃培养过夜，各取1 mL菌液置1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心5 min，弃上清。用细菌基因组提取试剂盒抽提DNA，-20 ℃保存备用。

选取GenBank上已发表的副溶血弧菌tlh基因，在NCBI中进行比对，取保守序列，利用ABI Primer Express 3.0软件设计引物及TaqMan探针，大连宝生物工程有限公司合成与标记，具体序列和探针标记见表 1。qPCR反应体系：Premix ExTaq^TM 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，探针(10 μmol/L)各1.0 μL，DNA模板0.5 μL，ddH₂O 10.0 μL。反应条件：95 ℃ 20 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，50个循环。于60 ℃进行FAM通道的荧光信号检测，设立阴性及空白对照，样品检测设3个复孔。

用建立的tlh实时荧光PCR方法对副溶血性弧菌标准菌株——溶藻弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、迟缓爱德华氏菌等参考菌株的DNA模板进行检测，验证qPCR方法的特异性。

将培养过夜的副溶血性弧菌菌液充分混匀后，用无菌PBS进行10倍梯度稀释，参照1.3.3利用平板法检测副溶血性弧菌的数量，选取菌落数在30-300之间的平板计数，计算培养过夜菌液的浓度。取各稀释度的菌液1 mL，参照1.3.5提取DNA模板，用建立的tlh实时荧光PCR方法检测，记录结果。根据培养液浓度和qPCR的结果制作标准曲线，并推算该方法检测的灵敏度。

根据灵敏度的结果，选取不同稀释度副溶血性弧菌的菌液模板进行qPCR检测，每个稀释度平行重复3次，通过对各次试验结果所得C_q值的平均值及变异系数CV进行分析来评价反应体系的稳定性。

利用Excel数据分析软件计算qPCR方法重复性试验的变异系数CV，即标准偏差SD与平均值Mean的比值的百分数。当CV < 15%时，说明两组数据的离散度越低，数据有效。采用SPSS软件对不同阶段样品中PMA-qPCR与常规qPCR的C_q值之间、PMA-qPCR换算成细胞对应数后与培养法的检测结果之间的差异分别进行单因素方差分析。P < 0.05被认为具有统计学意义。

用优化后的qPCR方法，对标准副溶血性弧菌和阴性参考菌株溶藻弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、迟缓爱德华氏菌进行检测。结果副溶血性弧菌出现相应针对tlh的特异性扩增曲线，阴性参考菌株及灭菌双蒸水均没有荧光信号产生。结果表明所建立的qPCR方法的特异性好，与其他阴性参考菌株无交叉反应(图 1)。

图 1　副溶血性弧菌qPCR特异性试验 Figure 1　The specificity test of qPCR for V. parahaemolyticus Note: 1: V. parahaemolyticus; 2: V. alginolyticus; 3: V. cholerae; 4: V. vulnificus; 5: E. faecalis; 6: P. aeruginosa; 7: S. aureus; 8: E. coli; 9: E. tarda.

图选项

根据平板计数结果，副溶血性弧菌过夜培养物的浓度为1.98×10⁹ CFU/mL。将培养过夜的菌液10倍梯度稀释，提取基因组DNA进行实时荧光PCR检测，从左到右依次是1.98×10⁹-1.98×10¹ (图 2)。菌液浓度的对数值为横坐标，临界循环数C_q为纵坐标，建立qPCR的标准曲线(图 3)。标准曲线的线性回归方程为y=-3.272x+45.310，斜率为-3.272，线性回归系数R²为0.996，PCR扩增效率E为102.1%，检测限为19.8 CFU/mL。

图 2　副溶血性弧菌qPCR灵敏性试验 Figure 2　The sensitivity test of qPCR for V. parahaemolyticus

图选项

图 3　副溶血性弧菌qPCR的标准曲线 Figure 3　The standard curve of qPCR for V. parahaemolyticus

图选项

将培养过夜的副溶血性弧菌悬液作10倍稀释成6个稀释度进行荧光定量PCR检测，每个稀释度做3个平行。结果显示根据tlh毒力基因建立的qPCR法的C_q值变异系数均在2%以下(表 2)，说明建立的荧光定量PCR检测方法重复性好，结果稳定可靠。

利用常规qPCR和PMA-qPCR法对不同冷冻阶段样品中副溶血性弧菌进行检测(图 4)。结果显示，qPCR检测副溶血性弧菌各个冷冻阶段的C_q值分别为26.57±0.23、26.35±0.09、26.55±0.15和27.34±0.09，与冷冻前(0 d)的C_q值26.32±0.04相比没有明显变化，而PMA-qPCR检测的各阶段C_q值则在10 d后由冷冻前的26.43±0.05很快变为31.24±0.06、32.32±0.03、34.25±0.12和38.84±0.36，数值呈明显增加趋势；同一冷冻阶段PMA-qPCR检测的C_q值也均高于qPCR检测的结果，且两者之间的C_q值差异显著(P < 0.05)。说明随着时间的延长，冷冻样品中存留的活菌数量明显减少，用常规的qPCR方法不能有效地追踪及检测。

图 4　不同阶段副溶血性弧菌的qPCR和PMA-qPCR的Cq值 Figure 4　The Cq of V. parahaemolyticus in different stages by qPCR and PMA-qPCR

图选项

根据标准曲线及PMA-qPCR的结果计算出对应阶段样品中的副溶血性弧菌的数目，同时利用传统的平板计数法测定不同阶段中的目标菌数目(表 3)。PMA-qPCR法检测4个阶段活性菌的数量分别为19 981±852、9 335±197、2 400±214和96±25 CFU/mL。平板计数法计算出4个阶段样品中可培养的细菌数分别为7 866±251、1 933±57、306±41和0 CFU/mL。PMA-qPCR法与培养法的检测结果之间具有显著的差异性(P < 0.05)。

病原菌的活性一般是指在含有营养物质培养基上进行细胞增殖并且形成菌落的能力^[12]。然而，VBNC病原菌的发现及其引发的食品安全风险使这一传统定义受到质疑^[13]。目前，科学界已经提出基于病原菌不同生理特性和分子生物学特征的活性评价标准，包括可培养性(Culturability)、可转录性(Transcript ability)、代谢活性(Metabolic ability)以及细胞膜完整性(Membrane integrity)等。基于代谢活性的染料法结合流式细胞分析技术在快速检测和分选染色后的活性菌和非活性菌方面显示出优势，但该方法的局限性是不能特异性地检测复杂环境样品中某一种病原菌。而将叠氮类染料与分子生物学方法相结合，便可特异性地检测复杂环境样品中的特定活性菌。自2006年第一次报道使用PMA可用于区别死、活细菌以来，PMA已被广泛应用于微生物领域。PMA-qPCR检测过程中PMA浓度对结果的影响较大，许多研究者均对PMA作用的浓度及时间进行了摸索和探讨^[14]。PMA浓度较低时(5-10 μmol/L)，其渗透到细胞膜受损的细胞中与其DNA结合的效果也差；而如果浓度过大，则增加了对活细胞的毒性。Wu等研究表明，当PMA浓度 > 80 μmol/L时，活细胞的数量下降至26.47%-5.92%；当PMA浓度 > 160 μmol/L时，活细胞的数量则会下降至7.67%-0.31%。PMA渗透入死菌阻止DNA扩增的作用在20 min之内随着光照时间延长效果会增加，超过20 min则影响不大。因而通常选择20-50 μmol/L PMA作用20 min^[15]。

实时荧光定量PCR技术中引物探针的设计是关键，本研究根据副溶血性弧菌tlh毒力基因设计的引物探针经测试能特异性扩增出副溶血性弧菌tlh毒力基因，而对于其他弧菌如溶藻弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌及金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等革兰氏阳性和阴性杆菌、球菌等均未能扩增到该基因，特异性达到100%，灵敏度检测可达到19.8 CFU/mL，与市售试剂盒比较效果相当(结果未显示)。重复性试验变异系数均 < 2%，表明建立的qPCR法可靠稳定，可用于副溶血性弧菌的灵敏、快速检测。

出入境的冰鲜制品及肉制品中，副溶血性弧菌及单增李斯特菌是重要的检测项目。相对于单增李斯特菌，副溶血性弧菌对低温尤其敏感。-20 ℃保存的副溶血性弧菌即使加入海藻糖、甘油等保护剂，死亡比例也相当高。但同时有研究显示，在极端环境中，细菌会通过相容性溶质的积累、适应性细胞膜和蛋白质组修饰等机制来应对压力环境^[16-17]。为了应对低温环境，细菌会通过自身的变化来适应环境，也会更容易进入VBNC状态。本研究中，副溶血性弧菌在大西洋鲑鱼的冷冻基质中-20 ℃保存至10 d时，PMA-qPCR显示活菌数由最初的6.6×10⁵ CFU/mL下降为19 981±852 CFU/mL，平板培养法则下降更快，低至7 866±251 CFU/mL；到50 d时分别低至96±25 CFU/mL和0 CFU/mL。显示在此过程中有相当数量的副溶血弧菌成为VBNC，单纯应用传统的平板培养法有很高的漏检风险。

本研究中，常规qPCR在冷冻前后扩增循环数C_q值一致处于26附近，几乎无变化；而PMA-qPCR则由最初的26.43逐步上升为31.24、32.32、34.25和38.84。与常规qPCR相比，PMA-qPCR的检测结果在一定程度上去除了来自于非活性菌的DNA对检测结果的影响，能够更准确地反映样品中病原菌的浓度水平。与培养法相比，PMA-qPCR不仅能够更为快速地对样品中的病原菌进行检测(检测时间从1-2 d缩短到约3 h)，并且能够检测到进入VBNC状态的病原菌，且检测结果相比于传统检测方法更为准确。

鉴于此，在冰鲜产品及肉类冷冻运输及加工时，PMA-qPCR技术在确定疾病暴发的流行病学调研或应用于食品安全的控制措施方面，都将是很有前途的分析手段。