凝集素(Lectin)是一类具有糖专一性和凝集血细胞作用的非免疫来源的蛋白质或糖蛋白，其分子质量为12−190 kD，含糖量为0−18%，普遍存在于动植物和微生物中。目前，全世界有50多种药用真菌凝集素被纯化，研究发现这些凝集素对细胞的生理具有调节作用^[1-9]，有些还具有显著的抗肿瘤作用^[5-9]。

桑黄是珍贵的药用真菌，特指一种只生长于野生桑树上的一个种，产量极低。以前对于它的分类都是比较盲目的，直到2015年被重新归类为一个新的属并改科学名为Sanghuangporus sanghuang^[10]。广义的桑黄包括Phellinus igniarius、P. baumii、P. linteus，为担子菌亚门(Basidiomycotina)层菌纲(Hymenomycetes)多孔菌目(Polyporales)锈革孔菌科(Hymenochaetacae)。桑黄作为一种传统中药在东亚国家广泛用于胃肠功能紊乱、降火和淋巴疾病等的治疗^[11]。近年来桑黄中发现了具有显著抑制肿瘤生长和转移作用的活性成分，这些活性成分对人体不良反应小，作为抗癌候选药之一，被人们所关注^[12-14]。桑黄提取物的丰富药理作用还包括抗突变、抑制肝纤维化、抗脂质过氧化作用、增强血单核细胞产生干扰素、抗血管生成作用、降血糖和抗肺炎作用^[15-23]。目前对其研究大多针对桑黄胞内多糖的抗肿瘤作用和刺激免疫作用^[15-21]。

本文报道了从桑黄发酵液中分离出的一种凝集素，对其理化性质和血凝集活性的特点进行了初步研究。

1 材料与方法 1.1 材料

桑黄(Phellinus baumii)来源于江苏省农业科学院，小鼠购于大连医科大学实验动物中心，A、B、AB、O型人血液由本校健康学生提供。

1.2 主要试剂和仪器

丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris和十二烷基磺酸钠(SDS)等化学试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司；低分子质量标准蛋白购自宝泰克生物科技有限公司；糖抑制实验中所用的糖均购自Sigma公司；实验中所用其它试剂皆为国产分析纯。DEAE Sephadex G-50和A-25购自瑞典Amersham Bioscience公司；UV5100紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.3 培养基

马铃薯综合培养基(g/L)：马铃薯200.0，蔗糖25.0，KH₂PO₄ 1.5，MgSO₄·7H₂O 1.0^[24]。

1.4 凝集素的分离纯化

1.4.1 样品的采集和粗提液的制备

桑黄接种于马铃薯综合培养基平板上，26 ℃恒温培养至满皿。用直径为8 mm的打孔器取菌丝饼8块，接种于液体培养基中^[24]。在25 ℃、130 r/min条件下振荡培养，4 d后取3 L发酵液置于冷冻干燥机中冻干，Tris-HCl (pH 8.0)重溶浓缩成10 mL，4 ℃、8 000 r/min离心15 min，取上清得桑黄发酵液凝集素粗提液(SHL)。

1.4.2 Sephadex G-50凝胶层析

取DEAE Sephadex G-50经处理后装柱(2.6 cm×100 cm)，用Tris-HCl (pH 8.0)液平衡，取SHL粗提液10 mL (浓度为3 mg/mL)上柱，流速18 mL/h，3 mL/tube，部分收集器收集，UV-1100紫外可见分光光度计测A₂₈₀，洗脱至A₂₈₀ < 0.01。收集各峰检测活性^[25-26]。

1.4.3 DEAE Sephadex A-25离子交换层析

Sephadex G-50凝胶层析获得的活性峰冻干，经Tris-HCl (pH 8.0)透析，上样于A-25纤维素柱(2.6 cm×30 cm)，上样后先用Tris-HCl (pH 8.0)平衡一个柱体积，然后用NaCl (0−1 mol/L)连续pH梯度洗脱。流速为18 mL/h，3 mL/tube，部分收集器收集，751型分光光度计测A₂₈₀，洗脱至A₂₈₀ < 0.01。收集各峰检测活性^[27]。

1.4.4 MPLC-MonoQ柱离子交换层析

样品用Tris-HCl (pH 8.0)透析上样后先用Tris-HCl (pH 8.0)平衡一个柱体积，然后用NaCl (0−1 mol/L)连续pH梯度洗脱。紫外检测A₂₂₀和A₂₈₀，将活性峰进行收集合并。

1.4.5 LPLC-Sephadex G-75凝胶层析法测定分子质量

层析柱为1.6 cm×100 cm，洗脱液为Tris-HCl (pH 8.0)，流速30 mL/h，3 mL/tube。标准蛋白质分子质量分别为97 400、66 200、43 000、31 000、20 100、14 400。M=e^{(13.26–0.023V)} (M为分子质量，V为洗脱体积)，取标样(2 mg/mL)和供试样品(2 mg/mL)各1 mL，设定20 μL进样量，记录色谱图^[28]。

1.5 SDS-PAGE电泳

将从桑黄发酵液中分离收集到的蛋白样进行SDS-PAGE电泳，制作的分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度为5%。用考马斯亮蓝R-250染色，所用标准蛋白为兔磷酸化酶B (M_W=97 400)、牛血清白蛋白(M_W=66 200)、兔肌动蛋白(M_W=43 000)、牛碳酸酐酶(M_W=31 000)、胰蛋白酶抑制剂(M_W=20 100)和鸡蛋清溶菌酶(M_W=14 400)。

1.6 凝集活性的测定^[29]

测定SHL24对鼠、人A、B、AB和O型血细胞凝集活性。取新鲜红细胞200 μL，用0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.5) 0.15 mol/L NaCl溶液洗涤数次后，稀释至10 mL，制得2%红细胞悬液。在“V”型血凝板中加入25 μL生理盐水，取SHL (1 mg/mL) 25 μL作倍比稀释，每孔加入2%的血球悬液。稍加振荡后，静置30 min观察结果。

1.7 发酵时间对凝集活性的影响

采集到的桑黄连续25 ℃、130 r/min培养7 d，每隔24 h取样3 L并分离得到粗提液(SHL)，检测其对血细胞的凝集活性。

1.8 糖抑制试验

根据已经发表的大型真菌凝集素糖特异性的研究结果^[30]，选取D-甘露糖、D-麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、树胶醛糖、D-乳糖、L-鼠李糖不同糖溶液对SHL24血凝活性的影响。方法同血凝试验。SHL24作倍比稀释，各孔加入40 mmol/L的不同糖溶液，摇动血凝板使溶液混匀，室温放置30 min，观察结果^[31]。

1.9 pH对血凝活性的影响

配制pH 4.0−10.0的系列缓冲液，测定不同pH条件下的血凝活性。pH 4.0−6.0时采用0.015 mol/L的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液，pH 6.5−7.5时采用0.015 mol/L的磷酸盐缓冲液，pH 8.0−9.0时采用0.015 mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH 9.0−10.0时采用0.015 mol/L的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液^[32-33]。

1.10 金属离子对凝血活性的影响

在“V”型血凝板上，将在20 mmol/L EDTA-Na₂中充分透析后的SHL24溶液中分别加入10 mmol/L的CaCl₂、MgCl₂和ZnCl₂，检测其对小鼠血红细胞凝血活性的影响^[34]。

1.11 热稳定性试验

将浓度为1 mg/mL凝集素样品分成若干份，分别在40−100 ℃下温育30 min，迅速冷却至室温，在“V”型血凝板上检测对小鼠血红细胞的凝集活性^[35]。

2 结果与分析 2.1 桑黄发酵液中凝集素的分离纯化

凝集素的粗提液经过冷冻干燥后利用Sephadex G-50柱(0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0)分离纯化，洗脱后得到3个洗脱峰G1−G3 (图 1)，活性检测表明G2为活性峰。G2峰再经Sephadex A-25离子交换层析得到A1和A2峰(图 2)，活性检测A2为活性峰。A2经MonoQ柱离子交换层析，得到6个峰M1−M6 (图 3)，其中M6为活性峰；M6再经LPLC-Sephadex G-75分子筛凝胶层析得2个峰L1和L2 (图 4)，活性检测L2为活性蛋白峰。最终分离得到所需的活性蛋白SHL24。记录图 4中的标样和供试样品的洗脱体积，并以标样的洗脱体积建立分子量的标准曲线。根据供试样的洗脱体积，得到SHL24的相对分子质量约为24 kD。

2.2 SDS-PAGE垂直板型凝胶电泳

SDS-PAGE垂直板型凝胶电泳结果表明，L2为纯品，由一个亚基组成，相对分子质量在20.1−31.0 kD之间(图 5)。这与凝胶层析法测定的相对分子质量约24 kD相一致。

2.3 对各种血细胞凝集活性的测定

在凝集活性测定试验中，静置观察30 min期间，SHL24对鼠红细胞、人A、B、AB以及O型血细胞均能发生凝集反应，其中对AB型血细胞凝集效果最好，发生凝集的时间最短。

2.4 发酵时间对凝集活性的影响

在连续摇瓶培养7 d过程中，每隔24 h取样3 L分离SHL粗提液，发现不同发酵时间的桑黄发酵液对血液的凝集活性具有差异(表 1)。测定结果表明培养120 h，即第5天时粗提液血凝活性最强，说明随着培养时间的增加，发酵液中所产生的SHL24的量在逐渐增加并趋于饱和，且随着发酵时间的推移发酵液中的发酵产物对SHL24的凝集活性具有抑制作用，可能导致其失活。

2.5 糖抑制试验

在糖抑制试验中，加入树胶醛糖、D-麦芽糖、D-甘露糖、蔗糖、L-鼠李糖、D-乳糖以及葡萄糖后检测SHL24对血红细胞的凝集作用，结果显示试验组与不加糖的对照组均能使血红细胞发生凝集作用且发生凝集现象的时间无明显差异，表明SHL24具有良好的稳定性。

2.6 pH对SHL24血凝活力的影响

试验结果显示SHL24在弱酸、中性和弱碱环境下均能对血红细胞起到血凝作用。pH为5.0、6.0和9.0时血凝活性不强；pH小于5.0和大于9.0时无血凝活性；pH为7.0和8.0时血凝活性最强。说明强酸、强碱环境下可使SHL24丧失血凝活性。

2.7 金属离子及EDTA对SHL24凝血活性的影响

SHL24经过EDTA透析后，其凝血活性没有发生变化。在透析后的溶液中分别加入10 mmol/L CaCl₂、MgCl₂、ZnCl₂，其凝血活性也没有明显变化，说明SHL24凝血活性不受二价金属离子Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺及EDTA的影响，对二价金属阳离子具有很好的稳定性。

2.8 温度对SHL24血凝活力的影响

在40−100 ℃条件处理下，检测不同浓度SHL24对血红细胞的血凝活性。SHL24原液在8倍稀释时仍具有部分血凝活性，且其原液对温度变化表现出相当高的稳定性，基本不受温度的影响(表 2)。

3 讨论与结论

凝集素是通过与细胞表面特异性的糖基结合进而引发其凝集效应。本研究对从桑黄发酵液中分离纯化得到的一种凝集素SHL24进行凝集活性的测定，发现SHL24对不同类型的血细胞凝集能力有差异：对人AB型血细胞的凝集速度比鼠血细胞和人A、B和O型血细胞快。说明SHL24所识别的专一性的糖基在这些细胞中都是存在的，且在这几类细胞表面所具有的专一性糖基受体的数目、结合的构型以及糖结合的强度具有一定的差异，导致SHL24对几种血细胞凝集速度的变化。

凝集素具有可逆的糖结合特异性，凝集活性可以被单糖或寡糖所抑制，因为糖结合了凝集素肽链中的活性位点而抑制其与红细胞结合的能力^[36]。本实验用不同的糖对SHL24进行处理，结果表明树胶醛糖、D-麦芽糖、D-甘露糖、蔗糖、L-鼠李糖、D-乳糖以及葡萄糖等几种单糖和双糖对其并无抑制作用，说明从桑黄发酵液中提取的凝集素SHL24与一些已知的凝集素相比，具有较强的位点专一性和稳定性。如从金针菇和灵芝中分离的凝集素均能被D-果糖和木糖所抑制^[37]；从香蕉果肉中分离的香蕉凝集素Banlec1能被D-麦芽糖、葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖抑制^[38]；从刀豆中分离的凝集素ConA被葡萄糖与D-甘露糖强烈的抑制，鼠李糖、蔗糖、D-麦芽糖对其均有部分抑制作用^[39]。可见大部分的凝集素均能被一种或两种不同的单糖或双糖不同程度地抑制，而SHL24却不受实验过程所列的7种糖的抑制，位点专一性很高，其具体被何种糖抑制还有待于进一步研究。

本实验在对SHL24的热稳定性、pH和二价金属阳离子的研究中也显示出了高度稳定性。并且桑黄与其它药用菌相比，具有许多药用功效，是一种很有发展前景的药用菌，许多从桑黄子实体或菌丝体中分离到的小分子和多糖类物质具有调节寄主的免疫活性和抗肿瘤作用^[40-42]，而凝集素则是食用菌中所含的另一类生理活性物质，部分己分离的食用菌凝集素具有很强的抗肿瘤活性。随着人们生活水平的提高和对健康的关注，人们越来越倾向于通过进食“药食同源”的食物来进行疾病的预防和治疗。目前从食用菌中分离的凝集素也越来越多，如1994年，Kawagishi等从猴头菌里分离得到的凝集素在pH为5.0−10.5，温度在70 ℃以下能够保持稳定，且凝集活性不受金属离子的影响^[43]；2006年，林玉满等从桔斑玉蕈子实体中分离的凝集素对热较不稳定，40 ℃以下稳定，60 ℃则全部失活，在pH 5.0−8.0的范围内凝集活性较高^[44]；2014年，Rouf等从小脆柄菇(Psathyrella asperospora)的蘑菇里提取到的凝集素在55 ℃以下，pH 6.0−10.0的条件下十分稳定，温度再高将逐渐失去活性^[45]。与此相比，本研究中的SHL24凝集素在温度为100 ℃，30 min内，pH为5.0−9.0均表现出高度稳定性，且不受普通的二价金属阳离子Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺及EDTA的影响。尤其是SHL24具有的耐高温性，可推测其多肽中二硫键的数目较多或其主要的活性位点为糖链而不是肽链。SHL24具有的这些稳定的理化性质和生物活性为进一步探索其在药用真菌桑黄中的作用奠定了基础。

因此，本文对桑黄发酵液凝集素的研究，不仅开辟了凝集素的新来源，而且为其开发应用提供了科学依据。