2018, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 张宇霞, 连晓雯, 李儒, 杜惠芬, 李克生
- ZHANG Yu-Xia, LIAN Xiao-Wen, LI Ru, DU Hui-Fen, LI Ke-Sheng
- 抗酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)单克隆抗体制备
- Preparation of monoclonal antibodies against Alicyclobacillus acidoterrestris
- 微生物学通报, 2018, 45(2): 322-333
- Microbiology China, 2018, 45(2): 322-333
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170299
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文章历史
- 收稿日期: 2017-04-12
- 接受日期: 2017-08-11
- 网络首发日期(www.cnki.net): 2017-08-30
2. 甘肃省医学科学研究院 甘肃 兰州 730020
2. Gansu Provincial Academic Institute for Medical Research, Lanzhou, Gansu 730020, China
脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)俗称耐热菌、嗜酸耐热菌、耐热耐酸菌等[1-2]，能引起巴氏灭菌果汁风味改变甚至腐败[3]，而目前的杀菌条件难以消除该菌。美国、欧洲大部分果汁消费国脂环酸芽孢杆菌达到了小于1个/10 mL的要求，而我国部分浓缩果汁中脂环酸芽孢杆菌的含量超过了1个/10 mL，并且我国果汁产品中脂环酸芽孢杆菌的污染没有制定相应的限量值以及检测方法的滞后，已成为制约我国浓缩苹果汁出口的主要障碍。因此，如何在浓缩果汁中快速准确地检测和鉴定脂环酸芽孢杆菌已成为苹果浓缩汁生产企业亟待解决的问题。目前脂环酸芽孢杆菌的检测方法主要有传统检测方法、数值分类技术、细胞膜脂肪酸组成检测[4]、代谢产物的检测[5]、基于聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)的分子生物学检测[6-18]、傅里叶红外光谱检测[19]等，但这些方法对所需仪器设备以及设备操作人员技术要求较高，检测方法复杂，不利于浓缩苹果汁生产厂家在加工生产环节对该菌进行有效、简便的检测和控制，且不同检测方法判定标准的差异会导致结果存在一定的差异，而基于PCR的分子生物学方法快速、简便，因此成为目前检测该菌的首选实验室方法。为了建立脂环酸芽孢杆菌快速检测方法，利用免疫胶体金的快速高效、灵敏准确、结果受外因影响较少、安全简便、不需任何仪器和设备、成本低廉、所需试剂和样本量少、实验结果可长期保存等特点；从而有效地在生产环节中大大降低原料、主要生产工段、生产用水、超滤出的苹果清汁等环节的脂环酸芽孢杆菌的污染，以及时指导生产。本试验利用细胞融合技术，制备了单克隆抗体并对其特异性进行鉴定，旨在建立抗脂环酸芽孢杆菌的杂交瘤细胞株；并对单克隆抗体的特性进行研究，为检测用胶体金试纸条的制备打下良好的基础，从而期望实现对脂环酸芽孢杆菌的快速检测，而利用其制备单克隆抗体以及制备胶体金免疫层析试纸检测浓缩果汁中A. acidoterrestris在国内外尚属首次。
1 材料与方法 1.1 菌种酸土脂环酸芽孢杆菌(A. acidoterrestris) ATCC49025、A. acidocaldarius (NCIMB11725)、Bacillus cereus (ATCC11778)、Bacillus subtilis (ATCC11774)、A. cycloheptanicus (ATCC49029)均购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)；分离菌株A. species及以上菌株均由甘肃出入境检验检疫局综合技术中心微生物实验室保存。BALB/c小鼠，雌性，8-10周龄，体重18-20 g，购自兰州大学实验动物中心。SP2/0骨髓瘤细胞购自中国科学院细胞库，由甘肃省医学科学研究院医学生物技术中心保存。
1.2 主要试剂和仪器弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)和HAT、HT选择培养基、TMB (四甲基联苯胺)、鼠源单克隆抗体亚类鉴定试剂盒，Sigma公司；DMEM细胞培养基，GIBCO公司；二甲基亚砜(DMSO)、PEG1000、Tween-20，生工生物工程(上海)股份有限公司；羊抗鼠辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG酶标二抗，北京博奥森生物技术有限公司；胎牛血清，兰州民海生物工程有限公司；其它试剂均为进口分装或国产分析纯化学试剂。
恒温培养箱、低温冰箱、高压蒸汽灭菌器，日本Sanyo电器公司；酶标检测仪、酶联洗板机，美国BioTek仪器有限公司；精密移液器、高速离心机、蛋白浓度测定仪，德国Eppendorf股份公司；低温冷冻离心机，德国Sigma公司；倒置生物显微镜，日本奥林帕斯光学工业株式会社；光学显微镜，日本Nikon公司；电热恒温培养箱，德国Memmert有限公司；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；电热恒温水浴锅，美国Polyscience公司；塑料薄膜封口机，温州鹿城海达包装机械厂；pH仪，赛多利斯(上海)贸易有限公司；空气压缩机，天津第二仪表厂。
1.3 方法 1.3.1 抗原制备免疫用抗原制备：参考文献[20]的方法培养A. acidoterrestris (ATCC49025)，重复洗涤2次后，用生理盐水将该菌的浓度调整到109 CFU/mL。
包被用抗原制备：取部分洗脱好的菌液用超声波粉碎仪进行裂解。以20 kHz频率、150 W的功率在冰浴中将细菌细胞破碎，每6 s间隔4 s，总共时间为30 min。裂解后将液体3 000 r/min离心10 min，将上清与沉淀分别用Eppendorf管进行分装，存于-20 ℃。
1.3.2 筛选方法的建立筛选方法采用间接ELISA，用方阵滴度法确定抗原包被浓度和酶稀释度。抗原分别做1:1 000、1:2 000、1:4 000的稀释；酶标分别做1:20 000、1:40 000的稀释；免疫小鼠多抗血清用样品稀释液从40×起倍比稀释；HRP标记的羊抗小鼠IgG，用酶稀释液分别做1:20 000、1:40 000稀释；设阴性和空白对照；以450 nm波长，以空白对照调零，读记各孔光密度值(OD)，凡P/N > 2为阳性结果(P/N=待测孔OD值/阴性对照孔OD值)。
1.3.3 动物免疫及效价测定取5只6-8周龄体重18 g左右雌性的健康BALB/c小鼠，免疫前7天卡介苗致敏小鼠(0.1 mL/每只)。每次免疫间隔3周，都较前一次免疫剂量加倍，共3次。于第3次免疫7 d后以间接ELISA法检测小鼠抗体效价，取效价最高的小鼠脾脏进行细胞融合。按照1.3.2确定的抗原包被浓度包被酶标板，将免疫小鼠全血按照100×、200×、400×-51 200×稀释，即倍比稀释的方法进行间接ELISA法检测。
1.3.4 杂交瘤细胞株的建立对冻存的骨髓瘤细胞(SP2/0)进行复苏，用含20%胎牛血清的DMEM完全培养液进行传代培养，且加入1% 8-氮鸟嘌呤进行处理，细胞处于对数生长期时即可用于细胞融合。制备饲养层细胞、免疫鼠脾细胞悬液，与骨髓瘤细胞进行细胞融合[21]。当融合细胞覆盖孔底20%-30%时，用间接ELISA法对细胞培养上清进行检测，对挑选出的阳性孔及时采用有限稀释法[22]进行克隆。每次克隆后第9天左右，对克隆过的细胞上清用ELISA进行检测，对所得的OD450和对应的克隆数进行评价。选择克隆数少、OD450高的阳性孔，将其再次克隆。经3-4次克隆，直到阳性率100%。将细胞株转入24孔细胞培养板中继续生长，待其适应后再转入细胞瓶中。细胞数量足够多时收集细胞进行小鼠腹水的制备。
1.3.5 单克隆抗体腹水的制备取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 mL高压灭菌后的液体石蜡。7 d后腹腔注入1×106-5×106个杂交瘤细胞。小鼠腹部明显膨大时，无菌操作收集腹水，1 000 r/min离心10 min收集中间层液体即为单克隆抗体，-20 ℃冻存备用。离心沉淀物用生理盐水悬浮后按1×106-5×106个细胞/只注射小鼠，继续进行腹水的扩大化生产，将传代过程中生长良好的细胞移入2 mL冻存管于液氮罐中冻存[23]。
1.3.6 单抗生物学特性的鉴定用间接ELISA方法对单克隆抗体细胞培养液上清和腹水进行效价测定，亚类鉴定采用Sigma公司的免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒进行鉴定，杂交瘤细胞的染色体鉴定按照文献[22]进行。测定杂交瘤细胞在第1次到第4次克隆的OD450。同时测定小鼠第1、2、3、4代腹水的效价，并将这些结果进行比较。
用ELISA叠加试验进行抗原位点分析(腹水和细胞上清)，在确定各McAb饱和值的基础上，在最适菌体抗原包被的酶标板内分别加入一种饱和浓度McAb1 (100 µL/孔)，37 ℃作用30 min，洗涤4次后加入另一种饱和浓度的McAb2 (100 µL/孔)，同样孵育洗涤；加入1:1 000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP (50 µL/孔)，同样孵育洗涤；加入TMB底物溶液(100 µL/孔)显色10 min，2 mol/L H2SO4终止反应，测定OD450值，计算叠加率(AI)。按如下公式计算：AI=[2×A(1+2)÷(A1+A2)-1]×100%。公式中：A1为McAb1的OD450值；A2为McAb2的OD450值；A(1+2)为McAb1叠加McAb2的OD450值。AI > 50%说明被测的两株单抗的抗原结合位点不同；AI < 50%说明被测的两株单抗抗原结合位点相同；且AI值越大，抗原位点重叠的可能性越小。
用A. acidocaldarius (NCIMB11725)、Bacillus cereus (ATCC11778)、Bacillus subtilis (ATCC11774)、A. cycloheptanicus (ATCC49029)、分离菌株A. species菌液包被酶标板，将1.3.5收集到的腹水采用间接ELISA法测定单克隆抗体的特异性。
应用饱和硫酸铵盐析沉淀法及Sephacryl-S300凝胶柱，对3F7和9C4单克隆抗体腹水(各4 mL)进行粗提和纯化，收集各吸收峰的纯化产物，用间接ELISA法测定它们的效价，用蛋白测定仪测定各管产物的蛋白浓度，并将腹水原液和纯化蛋白作SDS-PAGE电泳。采用已建立的间接ELISA法分别测定3F7和9C4各吸收峰的纯化产物，并与纯化前的腹水、50%饱和(NH4)2SO4沉淀和45%饱和(NH4)2SO4沉淀的蛋白效价进行比较。将纯化后腹水中McAb进行亲和常数的测定。
2 结果与分析 2.1 最适抗原浓度和酶稀释浓度采用间接ELISA法筛选，结果如表 1所示。用方阵滴度法确定的抗原最佳包被浓度为1:2 000，最佳酶标二抗的稀释浓度为1:20 000。
| 酶浓度 Enzyme concentration |
包被浓度 Inclusion concentration |
阳性值 Positive value |
阴性值 Negative value |
空白 Blank |
| 1:20 000 | 1:1 000 | 1.202 | 0.095 | 0.003 |
| 1:2 000 | 1.311 | 0.026 | 0.001 | |
| 1:4 000 | 1.016 | 0.060 | 0.001 | |
| 1:40 000 | 1:1 000 | 1.065 | 0.105 | 0.017 |
| 1:2 000 | 0.884 | 0.141 | 0.008 | |
| 1:4 000 | 0.608 | 0.218 | 0.018 |
在融合前3天用最佳包被浓度和最佳酶浓度对免疫小鼠进行抗体效价检测，结果见表 2。3次免疫7 d后小鼠尾血效价测定结果可知，免疫小鼠中1号小鼠的效价最高，大于1:51 200，2、3号小鼠效价大于1:12 800，4、5号小鼠的效价大于1:25 600，1号和3号大于1:25 600。选取效价最高的小鼠进行细胞融合，融合用小鼠尾血的免疫效价均在1:10 000以上。
| 小鼠 Mouse |
1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:800 | 1:1 600 | 1:3 200 | 1:6 400 | 1:12 800 | 1:25 600 | 1:51 200 | 阴性对照 Negative control |
空白 Blank |
| 1 | 1.415 | 1.139 | 1.255 | 1.250 | 1.318 | 1.110 | 0.712 | 0.605 | 0.476 | 0.260 | 0.017 | 0.000 |
| 2 | 0.918 | 0.876 | 0.649 | 0.568 | 0.475 | 0.315 | 0.196 | 0.266 | 0.169 | 0.094 | -0.007 | 0.000 |
| 3 | 0.997 | 0.928 | 0.884 | 0.795 | 0.628 | 0.480 | 0.464 | 0.286 | 0.182 | 0.047 | -0.001 | 0.000 |
| 4 | 1.259 | 0.984 | 0.993 | 0.731 | 0.656 | 0.752 | 0.404 | 0.431 | 0.272 | 0.117 | -0.008 | 0.000 |
| 5 | 1.302 | 1.014 | 0.919 | 0.882 | 0.845 | 0.631 | 0.557 | 0.323 | 0.200 | 0.134 | 0.001 | 0.000 |
自2013年12月至今共融合21次，融合采用免疫小鼠处死后取脾，脾细胞计数后与SP2/0骨髓瘤细胞按6.5:1的比例在50% PEG1000作用下融合，在37 ℃、5% CO2及饱和湿度下培养，融合细胞先在HAT选择培养基中培养两周，随后换为HT培养基。待孔内细胞长至约1/2满时，取细胞上清液进行抗体检测，ELISA方法筛选阳性。采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，经3次亚克隆使抗体阳性率达100%后建株。筛选出3株针对49025菌株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3E12、3F7、9C4。3株杂交瘤细胞每次克隆孔的检测值见表 3。
| 克隆次数 Clone number |
3E12测定值 Value of 3E12 |
3F7测定值 Value of 3F7 |
9C4测定值 Value of 9C4 |
阳性对照 Positive control |
阴性对照 Negative control |
| 1 | 0.214 | 0.268 | 0.338 | 1.081 | 0.002 |
| 2 | 0.375 | 0.412 | 0.622 | 1.086 | 0.006 |
| 3 | 0.664 | 0.489 | 0.583 | 1.148 | 0.038 |
采用间接ELISA法检测所获得的单克隆抗体细胞株的细胞上清和腹水效价。以40倍稀释的免疫小鼠血清作为阳性对照，以DMEM细胞培养液、样品稀释液及健康小鼠血清作为阴性对照。以A. acidoterrestris (ATCC49025)菌原液作为抗原包被酶标板，包被浓度为1.475×106个/mL，每孔0.1 mL，37 ℃ 2 h，4 ℃过夜；拍干后加入封闭液37 ℃封闭2 h，拍干后进行检测。加入倍比稀释的细胞上清或腹水，37 ℃孵育0.5 h，洗涤3次，再加入1:20 000稀释的HRP标记的羊抗鼠抗体，37 ℃孵育0.5 h，洗涤后加底物显色10 min，加终止液终止反应，用酶标仪测定OD450值，P/N≥2.1为阳性，否则为阴性，结果如表 4和5所示。
| 细胞株 Hybridoma cell |
80× | 160× | 320× | 640× | 1 280× | 2 560× | 5 120× | 阴性对照 Negative control |
空白对照 Blank control |
| 3E12 | 0.664 | 0.329 | 0.089 | 0.029 | 0.018 | 0.025 | 0.017 | 0.015 | 0.000 |
| 3F7 | 0.489 | 0.250 | 0.272 | 0.232 | 0.219 | 0.169 | 0.093 | 0.019 | 0.000 |
| 9C4 | 0.583 | 0.386 | 0.299 | 0.241 | 0.176 | 0.155 | 0.069 | 0.021 | 0.000 |
| 细胞株 Hybridoma cell |
1×103 | 2×103 | 4×103 | 8×103 | 1.6×104 | 3.2×104 | 6.4×104 | 1.28×105 | 2.56×105 | 5.12×105 | 1×106 |
| 3E12 | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
| 3F7 | 0.835 | 0.764 | 0.702 | 0.619 | 0.603 | 0.593 | 0.316 | 0.322 | 0.202 | 0.116 | 0.079 |
| 9C4 | 1.153 | 0.950 | 0.885 | 0.787 | 0.571 | 0.404 | 0.252 | 0.109 | 0.079 | 0.050 | 0.025 |
| 阳性对照Positive control 0.937 | |||||||||||
| 阴性对照Negative control 0.021 | |||||||||||
| 空白对照Blank control 0.000 | |||||||||||
| 注：阴性对照为健康小鼠血清；/：检测后无腹水效价. Note: Negative controls were healthy mice serum; /: No ascites titer after detection. |
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单克隆抗体亚类鉴定如表 6所示；细胞培养上清、腹水效价测定及亚类鉴定结果总表，如表 7所示。
| 杂交瘤细胞株 Hybridoma cell line |
IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | IgA | IgM |
| 3E12 | - | - | - | - | - | + |
| 3F7 | + | - | - | - | - | - |
| 9C4 | + | - | - | - | - | - |
| 杂交瘤细胞株 Hybridoma cell line |
细胞上清效价 Cell supernatant titer |
腹水效价 Ascites titer |
腹水效价(2代) Ascites titer2 (2 Generation) |
腹水效价(3代) Ascites titer3 (2 Generation) |
抗体亚类 Antibody subclass |
| 3F7 | 1:2 560 | 1:2×105 | 1:2×105 | 1:2×105 | IgG1 |
| 9C4 | 1:1 280 | 1:1×105 | 1:1×105 | 1:1×105 | IgG1 |
| 3E12 | 1:320 | / | / | / | IgM |
| z注：/：检测后无腹水效价. Note: /: No ascites titer after detection. |
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由表 7可知，3F7和9C4的抗体细胞上清效价和腹水效价较稳定，而3E12抗体细胞上清效价检测时跳孔严重，腹水无效价，这与其抗体亚类不同密切相关。
2.6 杂交瘤细胞的染色体计数结果取对数生长期细胞于10%血清培养基中培养48-54 h，将秋水仙素加入培养液，使其终浓度为0.1 µg/mL，继续培养4-6 h。小心吹打贴壁细胞，1 000 r/min离心10 min后进行低渗处理。随后固定细胞、制片，用新鲜Giemsa染色液染色10-20 min，镜检观察记录并进行显微拍照。染色体计数结果发现：所得杂交瘤细胞的染色体数目处于98-100条之间，符合预期数量。杂交瘤细胞9C4和3F7染色体图如图 1所示。
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| 图 1 杂交瘤细胞9C4 (A)和3F7 (B)染色体图片 Figure 1 Chromosoma maps of hybridoma cell line 9C4 (A) and 3F7 (B) |
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阳性杂交瘤细胞株建株后，将能够稳定分泌抗体的细胞转入24孔板培养，每五代收集一次细胞上清检测效价，连续传代两个月。同时测定小鼠各代腹水的效价，对比传代前后效价变化情况以分析该细胞株的稳定性。细胞上清的抗体效价采用间接ELISA法测定，3F7、9C4两株单抗细胞上清经连续传代两个月后检测仍保持稳定。3F7和9C4两株单抗各代腹水效价基本保持稳定，可达10万以上，3E12亚类为IgM，腹水效价不稳定，因此未再次传代。3F7和9C4的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ代腹水效价测定结果如表 8所示，经多次传代后，效价基本保持不变。
| 腹水Ascites | 3F7 | 9C4 |
| Ⅰ代Generation Ⅰ | 1:2×105 | 1:1×105 |
| Ⅱ代Generation Ⅱ | 1:2×105 | 1:1×105 |
| Ⅲ代Generation Ⅲ | 1:2×105 | 1:1×105 |
采用1.3.6中ELISA叠加实验，计算增值指数AI。3F7和9C4两株单抗AI=64.85%，增值指数大于50%，配对良好。
2.9 单克隆抗体的特异性分析结果检测结果显示3F7抗体与A. acidocaldarius (NCIMB11725)、Bacillus cereus (ATCC11778)、Bacillus subtilis (ATCC11774)、A. cycloheptanicus (ATCC49029)无交叉反应，与分离菌株A. species有弱阳性反应；9C4抗体与上述5株菌株均无交叉反应。
2.10 腹水中单克隆抗体的纯化及检测 2.10.1 单克隆抗体的纯化结果3E12因抗体亚类特性，无法获得高效价的腹水，因此未纯化。饱和硫酸铵沉淀的抗体经Sephacryl-S300凝胶柱分离纯化如图 2A、B图所示。Ⅰ峰为杂蛋白，Ⅱ峰为目的蛋白。
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| 图 2 单克隆抗体3F7 (A)和9C4 (B)分离纯化图 Figure 2 The figure of McAb 3F7 (A) and 9C4 (B) purified 注：Ⅰ峰为杂蛋白，Ⅱ峰为目的蛋白. Note: The peak Ⅰ is the impurity protein and the peak Ⅱ is the target protein. |
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纯化物中蛋白含量测定结果如表 9所示。
| 杂交瘤细胞株 Hybridoma cell line |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 50%饱和硫酸铵 50% saturated ammonium sulfate |
45%饱和硫酸铵 45% saturated ammonium sulfate |
腹水 Ascites |
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| 3F7 | 蛋白浓度(mg/mL) Protein concentration |
0.29 | 0.45 | 0.31 | 0.27 | 0.84 | 1.36 | 1.19 | 沉淀 | 沉淀 | 杂质干扰 |
| 效价Titer | / | / | / | / | 1×105 | 2×105 | 1.5×105 | 2×105 | 2×105 | 2×105 | |
| 9C4 | 蛋白浓度(mg/mL) Protein concentration |
0.17 | 0.34 | 0.52 | 0.49 | 0.68 | 1.08 | 0.96 | 沉淀 | 沉淀 | 杂质干扰 |
| 效价Titer | / | / | / | / | 0.5×105 | 1×105 | 1×105 | 1×105 | 1×105 | 1×105 | |
| 注：1–7为纯化后的蛋白收集管；/：检测后无腹水效价. Note: 1–7 are the purified protein collecting tubes; /: No ascites titer after detection. |
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由表 9可以看出3F7腹水效价为2×105，9C4腹水效价为1×105，再经50%饱和硫酸铵沉淀和45%饱和硫酸铵沉淀后，效价未变。经Sephacryl-S300凝胶柱分离纯化后1-4管中虽有蛋白但无效价，进一步证实纯化Ⅰ峰为杂蛋白，纯化Ⅱ峰为目的蛋白。纯化后蛋白以管6为峰值，效价基本保持不变。
2.10.3 单克隆抗体的SDS-PAGE电泳纯化后的蛋白中以Ig重链为主，3F7和9C4单抗的重链为55 kD左右。从图 3中可以看出经饱和硫酸铵沉淀后，样品中各种蛋白的含量无明显减少。粗提后的蛋白上S-300层析柱后通过SDS-PAGE分析可见，两处明显的蛋白带是重链，其他小量杂带应该是未被完全去除的腹水中的杂蛋白，但是与纯化前相比较，腹水中含量很高的主要杂蛋白已被去除，如图 3所示。
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| 图 3 SDS-PAGE电泳图 Figure 3 The figure of SDS-PAGE 注：1：3F7腹水；2：3F7纯化抗体；3：9C4纯化抗体；4：9C4腹水. Note: 1: 3F7 ascites; 2: 3F7 purified antibodies; 3: 9C4 purified antibodies; 4: 9C4 ascites. |
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以纯化后的单抗作亲和力分析，其亲和曲线如图 4所示。根据测定曲线以及亲和常数的计算公式，测得3F7的亲和常数为2.067×106，9C4的亲和常数为3.76×106。
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| 图 4 3F7 (A)和9C4 (B)纯化单抗亲和力曲线 Figure 4 The affinity curve of McAb 3F7 (A) and 9C4 (B) purified |
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抗酸土脂环酸芽孢杆菌(A. acidoterrestris)单克隆抗体的研制主要有两个思路，一是用活菌或甲醛灭活的细菌直接免疫小鼠，制备抗A. acidoterrestris特异性表面抗原的单克隆抗体；二是提取A. acidocaldarius特有的天然蛋白或用基因工程的方法人工表达该蛋白，以之免疫小鼠制备抗该特有蛋白的单克隆抗体。因为该菌对人体无害，而活菌免疫获得的抗体效价高，针对的免疫原最接近实际生产，因此本次实验选用活菌免疫小鼠制备单克隆抗体。
据报道[24]，在小鼠体内高剂量的抗原主要诱发的再次免疫应答为IgM类低亲和力抗体应答，而低剂量抗原主要诱发IgG类高亲和力抗体应答。本实验进行了21次融合，共得到1株IgM和1株IgG抗体，可能与所选择的抗原类型有关。本实验中采用A. acidoterrestris全菌免疫的小鼠脾细胞融合后筛选单克隆抗体，确定所制备的单抗与脂环酸芽孢杆菌属、芽孢杆菌属等亲缘关系接近的种属均不发生交叉反应。
抗原的免疫剂量依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等的不同而不同。免疫剂量过低，不能引起足够强的免疫刺激；免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。在一定的范围内，抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。免疫剂量也与注射途径有关，并且两次注射的间隔时间应长短适宜，太短起不到再次反应的效果，太长则失去了前一次激发的敏感作用。
3.2 实验动物选择和动物免疫 3.2.1 实验动物的选择免疫小鼠的选择多采用BALB/c小鼠。由于实验动物对免疫应答的个体差异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。本试验先后共进行5组，每组5只健康BALB/c小鼠进行免疫。单克隆抗体的制备多采用动物体内诱生法。由于绝大数杂交瘤细胞是由BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞与同一品的免疫小鼠脾细胞融合产生的，因此选取最适周龄的BALB/c鼠对于大量制备单抗至关重要。焦艳等[25]认为选择11-13周龄小鼠制备单抗比较合适，其腹水诱生量平均为2.6 mL左右。本实验中选取8-10周龄的BALB/c小鼠，平均腹水诱生量为5 mL。从平均腹水诱生量来看，选择8-10周龄的BALB/c小鼠可以满足生产制备要求。
3.2.2 免疫方法许多实验室采取了脾内免疫、腹腔植入、淋巴结注射和足垫注射等方法。目的在于减少抗原用量和注射次数，缩短免疫周期，加速抗体成熟，本实验中采用了皮下注射免疫和足垫免疫同时进行。从小鼠免疫效价方面来看，该免疫方法的效果非常好，第二次免疫后免疫效价都在1万以上，而且还可以减少抗原的用量。
最后一次加强免疫与前一次最少应间隔3周，以保证绝大多数循环抗体自血流中消除(血清抗体浓度在免疫接种后14 d开始下降)，如果循环抗体滴度高，那么这种抗体会与抗原结合，降低加强免疫效果。加强免疫的目的：一是增强免疫反应；二是使所引发的这种最佳反应状态与细胞融合同步。
3.3 细胞融合细胞融合是杂交瘤技术的中心环节。
(1) 选择恰当的融合时间。有人认为处在转化时期的B淋巴细胞更易于融合，虽然免疫以后7-8 d是抗体产生的高峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少，因此本试验在加强免疫后的第3天取免疫小鼠的脾脏做细胞融合。
(2) 选择合适的细胞融合剂。不同批号的PEG即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。本实验选择对细胞损伤较小的高纯度低分子量的PEG1000。
(3) 融合细胞的状态对是否能获得阳性杂交瘤细胞的影响很大。本实验中SP2/0细胞为自己保存传代，在细胞融合前对SP2/0细胞进行了8-AG选择培养和BALB/c小鼠腹腔传代恢复，基本达到了去除细胞返祖和增强细胞活力的目的。
(4) 在融合过程中，操作尽量轻柔，以提高细胞的融合效果。
另外，在细胞融合过程中细致的实验准备、快速轻柔的实验操作和严格的无菌意识同样是获得融合成功的重要条件。
3.4 饲养细胞在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必需加入饲养细胞才能使其更好的生长繁殖。许多种类的动物细胞都可以作饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等。本试验选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面可以用作饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长营造良好的环境。在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则细胞可能会有严重污染。
3.5 血清一般说来，只有1/5的FBS适合杂交瘤培养，因此应选择高质量的FBS。将受试批次的FBS制成10%的培养基，培养骨髓瘤细胞。好的批次应可支持至少20个细胞/孔的生长，如果每孔100个细胞都生长不好的批次不应使用。FBS在使用前应在56 ℃作用30 min，灭活抑制杂交瘤细胞生长的物质。
另外，所用血清和培养基应经常检查是否有支原体污染。大多数支原体在胞浆或胞浆膜内生长，能通过0.22 μm标准滤膜，且通常不引起培养液混浊和pH改变，在普通显微镜下不易被观察到。支原体污染的培养液应弃用。
3.6 杂交瘤细胞的克隆经过抗体测定的阳性孔可以扩大培养进行克隆，以得到可分泌抗体的单个细胞的后代。克隆的时间一般来说越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞生长旺盛，互相争夺营养和空间，以至于使产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。克隆化的阳性杂交瘤细胞经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般来说，免疫性强的抗原克隆次数可能少一些，但至少要3-4次克隆后才能稳定。本试验中一般都是经过5次克隆后再进行扩大培养。当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必需将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。
3.7 单抗的纯化不同类型的抗体因其理化性质不同所以需要采用不同的纯化方法。陆学东等[26]报道，硫酸铵法、辛酸二步法以及离子交换柱层析法3种方法中，硫酸铵法单抗回收率最高(39.69%)，但纯度较差，不能完全去除白蛋白，对其它杂蛋白无去除作用；辛酸二步法单抗回收率较低(22.74%)，但纯化的单抗纯度较高，可有效地去除白蛋白，对其它杂蛋白也有一定的去除作用；离子交换柱层析法回收率为30.22%，对单抗的纯化程度最高，在纯化物中几乎无白蛋白和杂蛋白存在。3种纯化方法对单抗的活性均无明显影响。
本实验中，先采用饱和硫酸铵盐析沉淀法对腹水进行粗提，然后过S-300层析柱使回收的单抗有较高的纯度，以便于进行下一步的分析及鉴定。通过SDS-PAGE分析可见明显的蛋白带是重链，其它小量杂带应该是未被完全去除的腹水中的杂蛋白，但是与纯化前比较，腹水中含量很高的主要杂蛋白被去除了，说明这种纯化方法是可行的。
4 结论本实验运用杂交瘤细胞技术，以A. acidoterrestris (ATCC49025)免疫BALB/c小鼠，用建立的间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞，得到了3株能稳定分泌A. acidocaldarius抗体的杂交瘤细胞株，其中两株为IgG1亚类。
对所得到的两株IgG1做生物学特性的鉴定，结果表明两株单抗针对不同的抗原位点；多次传代后稳定性基本保持不变；特异性实验表明两株单抗均不与A. acidocaldarius (NCIMB11725)、Bacillus cereus (ATCC11778)、Bacillussubtilis (ATCC11774)、A. cycloheptanicus (ATCC49029)等发生交叉反应，说明具有较强的特异性，所以这两株单抗可以进一步用于检测胶体金试纸条的研制。
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