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文章信息
- 唐凯, 高晓丹, 贾丽娟, 徐慧欣, 李蘅, 孟建宇, 陶羽, 冯福应
- TANG Kai, GAO Xiao-Dan, JIA Li-Juan, XU Hui-Xin, LI Heng, MENG Jian-Yu, TAO Yu, FENG Fu-Ying
- 浑善达克沙地生物土壤结皮及其下层土壤中固氮细菌群落结构和多样性
- Community structure and diversity of diazotrophs in biological soil crusts and soil underneath crust of Hunshandake deserts
- 微生物学通报, 2018, 45(2): 293-301
- Microbiology China, 2018, 45(2): 293-301
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170227
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文章历史
- 收稿日期: 2017-03-19
- 接受日期: 2017-06-05
- 网络首发日期(www.cnki.net): 2017-06-13
生物固氮是由固氮酶将N2还原成氨的过程,是自然界中氮营养的主要来源。nifH是编码固氮酶的基因之一,其核酸序列高度保守、系统进化关系和16S rRNA基因较一致,且基因数据库庞大,常用于固氮微生物多样性的研究[1]。目前已知的固氮作用仅局限于原核生物。细菌中能够自生固氮的种属主要包括固氮菌属(Aztobacter)、固氮螺菌(Azospirillum)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)、着色菌属(Chromotium)、脱硫弧菌(Desulfovibrio)、克氏杆菌(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodosospirillum)和硫杆菌属(Thiobacillus)。此外,一部分放线菌、蓝藻、根瘤菌等也可以进行自生或共生固氮[2]。
生物土壤结皮(Biological soil crusts,BSCs)分布广泛,在干旱地区覆盖度能达到40%以上,是由隐花植物如蓝藻、绿藻、地衣、藓类和微生物,以及菌丝体、假根和分泌物构成的;根据其演替阶段可分为藻类结皮、地衣结皮和苔藓结皮[3]。BSCs对干旱半干旱地区土壤中氮营养提高有重要贡献。例如,腾格里荒漠中的藻类结皮、地衣结皮和苔藓结皮的固氮活性分别能达到14-133、20-101、4-28 μmol C2H4/(m2·h)[4]。但目前有关BSCs固氮的研究多集中在影响其固氮能力的因素上,如结皮类型、水分、温度和检测方法[5],而对于固氮作用起关键作用的微生物的研究还较少。并且有限的BSCs中固氮微生物相关研究多基于藻结皮,其结果表明这些BSCs中固氮微生物以Cyanobacteria门细菌为主。而结皮形成早期阶段蓝藻并不是主要固氮者[6],在高山藻结皮中固氮速率与蓝藻生物量不相关[7]。这表明不同类型或地域的BSCs中固氮细菌类群存在差异,BSCs中蓝藻之外的、种类众多的其它细菌可能对BSCs固氮具有重要贡献。但是,不同类型或发育阶段BSCs中固氮细菌群落结构和多样性的异同目前还不清楚、有待明确。
因此,本研究以浑善达克沙地为例,对其中的3种BSCs及其下层土壤为研究对象,利用MiSeq高通量测序技术对nifH基因进行测序分析,揭示不同类型BSCs中固氮细菌群落结构和多样性及其异同,以期为理解BSCs中固氮细菌的生态功能及其对荒漠生态系统环境的修复潜力提供基础依据。
1 材料与方法 1.1 生物土壤结皮的采集和处理样品于2015年6月中旬采自浑善达克沙地(42°25′35.76″N,116°46′9.48″E)。采用五点采样法(点与点之间至少间隔200 m),使用无菌刀片分别采集藻结皮、地衣结皮和苔藓结皮(表层土1 cm-2 cm)及其相应下层土壤(结皮下层2 cm-5 cm)相应等量混匀,运回实验室于-80 ℃保存、备用。
1.2 土壤理化指标检测样品:水为1:5 (质量体积比),以pH计测定pH;速效氮使用碱解扩散法[8];有机质使用稀释热法测定机质含量[9]。
1.3 土壤总DNA的提取采集的不同类型土壤分别取0.5 g,依土壤DNA提取试剂盒(E.Z.N.A. Soil DNA Kit,D5625-01)操作手册提取土壤总DNA;将所提取到的DNA溶于50 μL无菌超纯水中;每种类型土壤DNA提取3个不同重复,将每次所得DNA混合均匀,置于-80 ℃保藏、备用。
1.4 高通量测序分别以各样品总DNA为模板扩增nifH基因,所用正向引物为F:5′-AAAGGYGGWATCGGYAA RTCCACCAC-3′;反向引物R:5′-TTGTTSGCSGCR TACATSGCCATCAT-3′[10]。PCR反应体系(20 μL):5×Fast Pfu Buffer 4 μL,dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μL,正、反向引物(5 μmol/L)各8 μL,Fast Pfu Polymerase 0.4 μL,DNA模板10 ng,BSA 0.2 μL。PCR反应条件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃ 8 min。以2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。委托上海美吉生物医药科技有限公司,采用Illumina MiSeq测序平台对扩增产物进行测序。
1.5 数据分析以FLASH和Trimmomatic软件对测序所得序列进行去接头拼接和序列优化去杂;利用Mothur和R语言工具进行稀释性曲线的计算和绘制;以USEARCH软件在Cutoff=0.05下,对设定聚类非重复序列、去除嵌合体、确定每个OTU的代表序列;通过FGR/nifH GeneBank的(Release7.3) (http://fungene.cme.msu.edu/)功能数据库进行OTU注释,并分别在Phylum (门)、Class (纲)和Genus (属)三个分类水平统计各样品的群落组成;以Mothur软件(v 1.30.1) (http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)计算Alpha多样性指数;以R语言统计物种并绘制Venn图;典范对应分析(Canonical correlation analysis,CCA)使用R语言Vegan包中的CCA分析和作图;样品层级聚类,先用QIIME计算Beta多样性距离矩阵后再以R语言作图。
2 结果与分析 2.1 土壤理化性质由土壤的理化性质分析结果(表 1)可知,采集的地衣结皮(HSL) pH最低(6.26),藻结皮(HSA)、地衣结皮(HSL)、苔藓结皮(HSM)和苔藓结皮紧邻下层土壤(HSMs)的pH值接近(6.89-7.07);HSA、HSL和HSM的有机质含量依次递增,甚至发育高级阶段的下层土壤HSMs中的有机质含量与初级阶段的HSA只相差3.36 g/kg;HSM有机质含量是其下层HSMs的4.12倍;HSM速效氮含量最高(172.67 mg/kg),其次为HSMs (145 mg/kg)、HSA (138.83 mg/kg)和HSL (115.50 mg/kg)。
样品 Samples |
pH | 有机质 Organic matter (g/kg) |
速效氮 Available nitrogen (mg/kg) |
HSA | 6.89 | 36.67 | 138.83 |
HSL | 6.26 | 113.70 | 115.50 |
HSM | 6.99 | 137.49 | 172.67 |
HSMs | 7.07 | 33.41 | 145.83 |
注:HSA、HSL、HSM和HSMs分别代表藻结皮、地衣结皮和苔藓结皮及其苔藓结皮紧邻下层土壤;仅对扩增出nifH基因的下层土壤测定了理化性质. Note: HSA, HSL, HSM and HSMs represents algae crusts, lichen crusts, moss crusts and soil underneath moss crusts, respectively; Only determined physico-chemical properties of soils under crusts that amplified the nifH gene. |
对3种类型BSCs及其下层土壤样本nifH基因进行扩增、构建文库和测序分析,其中下层土壤HSAs和HSLs未能检测到nifH基因的存在,可能与该样品nifH基因含量低有关。其余4个样品,即HSA、HSL、HSM及其紧邻下层土壤HSMs均扩增到了nifH,并进行了建库和测序。经过序列拼接、比对分析除去未能分类序列,所有固氮菌类群共划分为3个门6个纲和16个属(表 2)。其中,Cyanobacteria门是HSA、HSL中的绝对优势菌门;Proteobacteria门在HSM和HSMs中是优势菌门,其在HSM中的较在HSA和HSL中的分别增加了21.02%和16.73%;而Actinobacteria门仅在HSMs中检到,但丰度较低(0.11%)。
样品名称 Samples |
属水平 Genus level |
纲水平 Class level |
门水平 Phylum level |
|||||
属名 Name of Genus |
丰度 Abundance (%) |
纲名 Name of Class |
丰度 Abundance (%) |
门名 Name of Phylum |
丰度 Abundance (%) |
|||
HSA | Skermanella | 0.06 | Alphaproteobacteria | 0.09 | Proteobacteria | 0.09 | ||
Unclassified_f_ Rhodospirillaceae |
0.02 | |||||||
Unclassified_c_ Alphaproteobacteria |
0.01 | |||||||
Unclassified_f_ Nostocaceae |
90.99 | Norank_p_ Cyanobacteria |
99.90 | Cyanobacteria | 99.90 | |||
Scytonema | 6.68 | |||||||
Unclassified_o_ Nostocales |
1.97 | |||||||
Nostoc | 0.21 | |||||||
Trichormus | 0.05 | |||||||
Others | 0.01 | |||||||
HSL | Skermanella | 2.00 | Alphaproteobacteria | 4.12 | Proteobacteria | 4.38 | ||
Unclassified_c_ Alphaproteobacteria |
1.26 | |||||||
Unclassified_f_ Rhodospirillaceae |
0.68 | |||||||
Rhodopseudomonas | 0.15 | |||||||
Unclassified_o_ Rhizobiales |
0.02 | |||||||
Rhizobium | 0.01 | |||||||
Azohydromonas | 0.01 | Betaproteobacteria | 0.01 | |||||
Unclassified_p_ Proteobacteria |
0.25 | Unclassified_p_ Proteobacteria |
0.25 | |||||
Unclassified_f_ Nostocaceae |
44.14 | Norank_p_Cyanobacteria | 95.17 | Cyanobacteria | 95.17 | |||
Scytonema | 45.85 | |||||||
Trichormus | 3.50 | |||||||
Unclassified_o_ Nostocales |
0.94 | |||||||
Nostoc | 0.74 | |||||||
Others | 0.45 | |||||||
HSM | Skermanella | 14.74 | Alphaproteobacteria | 20.05 | Proteobacteria | 21.11 | ||
Unclassified_f_ Rhodospirillaceae |
2.23 | |||||||
Unclassified_c_ Alphaproteobacteria |
1.69 | |||||||
Bradyrhizobium | 1.32 | |||||||
Rhizobium | 0.04 | |||||||
Rhodopseudomonas | 0.03 | |||||||
Azohydromonas | 0.06 | Betaproteobacteria | 0.06 | |||||
Klebsiella | 0.07 | Gammaproteobacteria | 0.07 | |||||
Unclassified_p_ Proteobacteria |
0.93 | Unclassified_p_ Proteobacteria |
0.93 | |||||
Unclassified_f_ Nostocaceae |
29.21 | Norank_p_ Cyanobacteria |
77.78 | Cyanobacteria | 77.78 | |||
Nostoc | 15.34 | |||||||
Scytonema | 22.57 | |||||||
Unclassified_o_ Nostocales |
10.60 | |||||||
Trichormus | 0.06 | |||||||
Others | 1.11 | |||||||
HSMs | Skermanella | 33.80 | Alphaproteobacteria | 49.59 | Proteobacteria | 93.92 | ||
Unclassified_c_ Alphaproteobacteria |
10.62 | |||||||
Unclassified_f_ Rhodospirillaceae |
3.42 | |||||||
Unclassified_o_ Rhizobiales |
0.93 | |||||||
Rhizobium | 0.54 | |||||||
Rhodopseudomonas | 0.22 | |||||||
Bradyrhizobium | 0.06 | |||||||
Azohydromonas | 25.66 | Betaproteobacteria | 25.66 | |||||
Klebsiella | 0.47 | Gammaproteobacteria | 0.47 | |||||
Unclassified_p_ Proteobacteria |
18.20 | Unclassified_p_ Proteobacteria |
18.20 | |||||
Scytonema | 2.78 | Norank_p_ Cyanobacteria |
4.73 | Cyanobacteria | 4.73 | |||
Nostoc | 1.47 | |||||||
Unclassified_o_ Nostocales |
0.47 | |||||||
Unclassified_f_ Nostocaceae |
0.01 | |||||||
Frankia | 0.11 | Actinobacteria | 0.11 | Actinobacteria | 0.11 | |||
Others | 1.24 | |||||||
注:HSA、HSL、HSM和HSMs分别代表藻结皮、地衣结皮和苔藓结皮及苔藓结皮紧邻下层土壤. Note: HSA, HSL, HSM and HSMs represents algae crusts, lichen crusts, moss crusts and soil underneath moss crusts, respectively. |
在纲分类水平上,HSM和HSMs中Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaprote obacteria/unclassified_p_Proteobacteria的丰度分别为20.05%、0.06%、0.07%、0.93%和49.59%、25.66%、0.47%、18.20%;相比其它样品,少量(0.11%)的Actinobacteria纲只出现HSMs中;而在HSA和HSL中,Cyanobacteria门未能分类纲(Norank_p_ Cyanobacteria)占绝对优势,其丰度分别为99.90%和95.17%;HSA中属于Proterobacteria门的只有丰度极低Alphaproteobacteria,其在HSL中略有增加;HSL比HSA样品中多了极其微量(0.01%)的Betaproteobacteria,而HSM又比HSL多一个Gammaproteobacteria纲(0.07%);结皮层中依发育阶段提高(藻结皮-地衣结皮-苔藓结皮)而依次新出现的纲(Alphaproteobacteria-Betaproteobacteria-Gammaproteobacteria)在HSMs中的丰度明显高于结皮层。
在属分类水平上,在各样品中丰度超过5%的分别是:HSA中的Unclassified_f_Nostocaceae (90.99%)、Scytonema (6.68%);HSL中的Scytonema (45.85%)和Unclassified_f_Nostocaceae (44.14%);HSM中的Unclassified_f_Nostocaceae、Scytonema、Nostoc、Skermanella、Unclassified_o_Nostocale丰度分别为29.21%、22.57%、15.34%、14.74%和10.60%;HSMs中的Skermanella、Azohydromonas、Unclassified_p_ Proteobacteria、Unclassified_c_Alphaproteobacteria丰度分别为33.80%、25.66%、18.20%和10.62%。HSM和HSMs中的Skermanella丰度分别为14.74%和33.80%。Azohydromonas在HSMs中最多(25.66%),而在其它样品中含量极微。
2.3 固氮菌Alpha多样性指数分析Alpha多样性指数可反映生物群落的丰富度和多样性。其中,Ace和Chaol指数可以反映物种丰富度,其数值越大表示该样品物种丰富度越大;Shannon和Simpson指数则可以反映群落多样性,Shannon指数数值越大表示该样品物种多样性越大,Simpson指数则相反。由表 3可知,样品Ace指数和Chaol指数范围分别是13.53-31.00和13-31,两个指数的最低和最高值均分别来自HSA和HSMs,结皮层样品(HSA、HSL和HSM)随结皮的发育其物种丰富度逐渐上升;Shannon和Simpson指数范围分别是0.42-2.39、0.13-0.83,其中HSMs Shannon指数最大(2.39),Simpson指数最小(0.13);随结皮发育,Shannon指数增大、Simpson指数减小,说明物种多样性随结皮的发育逐渐提高。
样品名称 Sample |
Ace指数 Ace index |
Chaol指数 Chaol index |
Shannon指数 Shannon index |
Simpson指数 Simpson index |
HSA | 13.53 | 13 | 0.42 | 0.83 |
HSL | 22.00 | 22 | 1.47 | 0.30 |
HSM | 26.28 | 26 | 2.08 | 0.16 |
HSMs | 31.00 | 31 | 2.39 | 0.13 |
注:HSA、HSL、HSM和HSMs分别代表藻结皮、地衣结皮和苔藓结皮及苔藓结皮紧邻下层土壤. Note: HSA, HSL, HSM and HSMs represents algae crusts, lichen crusts, moss crusts and soil underneath moss crusts, respectively. |
样品层级聚类分析是基于Beta多样性距离矩阵、对不同环境样品中微生物进化差异程度进行可视化聚类的分析方法。由本研究的聚类结果(图 1A)可见,HSA、HSL和HSM聚在一起,HSL和HSM更近地一起聚在最里层,而HSMs单独分布在最外层的一支。Venn图用于统计多组或多个样品中共有和独有的物种数目,比较直观地表现出样品物种的异同。本研究的Venn图(图 1B)表明,3个结皮层样品(HSA、HSL和HSM)共有10个OTU;HSM和HSMs共有22个OTU,分别占HSM和HSMs中OTU总数的84.62%和70.97%;HSA和HSL样品没有独有OTU;HSM有1个独有OTU,为Rhizobacter sp. Root404;HSMs独有OTU最多,7个独有OTU分别是Bradyrhizobium japonicum、Lentisphaerae bacterium GWF2-50-93、Desulfovibrio putealis、Frankia sp. EUN1f、Paraburkholderia mimosarum和2个未知序列;HSA、HSL、HSM和HSMs共有9个OTU,分别占各自总OTU数的69.23%、40.91%、34.62%和29.03%。说明与HSMs相比,不同类型BSCs的固氮菌群落结构相互更相似。
2.5 CCA分析典范对应分析(Canonical correlation analysis,CCA),基于单峰模型将对应分析和多元回归分析相结合,主要用于反映群落、样品和环境因子的关系。在CCA图中,样品点或种属点的空间距离代表样品或种属间的距离,样品点或种属点到环境因子向量的投影代表样本或种属受环境因子影响的程度。本研究的CCA分析结果(图 2)表明,第一、二象限分别代表了66.98%和19.66%固氮菌群落和环境因子间的差异;OM和AN对样品HSA、HSL、HSM和种属1-6有促进作用,pH与之负相关;样品HSMs与种属7-16则相反;样品和种属聚为三组,即表明样品HSA与种属1相关;样品HSL、HSM与种属2-6相关,种属2-6之间距离较近;样品HSMs与种属7-16相关,种属7-16之间距离较近。
3 讨论生物土壤结皮(Biological soil crusts,BSCs)对土壤中无机氮的积累有重大贡献,在干旱、半干旱荒漠生态系统氮循环中起到至关重要的作用[11];而固氮微生物对于BSCs的形成和发育有着重要的影响[6]。BSCs不同发育阶段的固氮能力存在明显差异[4],其固氮细菌组成也可能不尽相同。可产生异形胞、能固氮的蓝藻如Nostoc属等在各类型的BSCs中丰度均较高,使得部分研究者一直以来认为BSCs中主要固氮微生物为蓝藻,它发挥着主要的固氮作用[12-14]。浅色的藻类结皮属于BSCs发育早期阶段,其中的微生物以蓝藻Microcoleus spp.为主[15],它们并无固氮功能[16]。Pepe-Ranney等[6]研究认为在形成之前以及早期发育阶段BSCs中的主要固氮微生物为Clostridiaceae和Proteobacteria中的可固氮类群[7]。成熟的各类型BSCs在腾格里沙漠中以Cylindrosperum蓝藻为主[14],S r Rondane山中以Nostoc属蓝藻为主[17]。而本研究表明,浑善达克沙地的成熟藻结皮(HSA)、地衣结皮(HSL)和苔藓结皮(HSM)中均以未能分类的Nostocaceae科和Scytonema属的蓝藻为主;BSCs由低级(藻结皮)、中级(地衣结皮)到高级(苔藓结皮)的发育过程中,固氮菌群落中的Proteobacteria门类群丰度逐渐增加,甚至在苔藓结皮中Proteobacteria门的Skermanella属类群成为了仅次于未分类Nostocaceae科(29.21%)和Scytonema属(22.57%)蓝藻的第三优势固氮菌类群、丰度达到了14.74%;下层土壤中,只有苔藓结皮下层土壤(HSMs)检测到了nifH,其反映出HSMs中固氮菌类群以Skermanella (33.80%)、Azohydromonas (25.66%)和未分类的Proteobacteria类群(18.20%)为主。在营养贫瘠的荒漠生态系统中,生物固氮极其重要,植物通过增加土壤有机质营养控制着这些生态系统中固氮细菌群落组成及其基因多样性[18]。有机质含量也是影响古尔班通古特沙漠[19]和本研究BSCs中固氮菌菌群结构的主要因子。可见,蓝藻可能是早期BSCs中主要的固氮微生物;而随着BSCs的发育,BSCs及其紧邻下层土壤中有机质含量提高,Proteobacteria类群(特别是Skermanella和Azohydromonas等)可能发挥了越来越大的固氮作用、更进一步地促进了BSCs的发育和稳定。
“生态保险”假说认为,生物多样性提供了对环境波动的保险或缓冲,使得群落或生态系统的综合特性是更可预测的[20]。本研究结果表明,随着BSCs的发育固氮菌的多样性明显增加。因此基于“生态保险”理论,固氮菌多样性增加可能是BSCs发育高级和稳定的重要体现。
4 结论藻结皮、地衣结皮和苔藓结皮及其紧邻下层土壤中的固氮细菌群落结构和多样性差异明显,而且固氮细菌类群和多样性指数随BSCs发育阶段的提高而增加。本研究为认识和利用生物土壤结皮相关固氮细菌提供了基础依据。
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