粘细菌是一种具有社会性行为、复杂多细胞行为和形态发生的革兰氏阴性细菌^[1]。它具有显著的社会特征，例如能够在细胞间通过信号传导、感应、协同摄食、运动和形成子实体，所以粘细菌被认为是高等的原核生物^[2]。粘细菌是所有细菌中基因组最大的，约为10 Mb，DNA的G+C含量为67-72 mol%^[3-6]。在营养缺乏等各种不利环境条件下，粘细菌会通过一个复杂的多细胞行为而形成肉眼可见的子实体，子实体通常形态各异，大小不等，多为亮黄色、红色、橙色、棕色或黑色等鲜艳颜色^[7]。粘细菌作为一类可产生丰富次级代谢产物且产物具有高活性的微生物类群日趋受到重视。与其他细菌相比，粘细菌是一类“生活在真核生物边缘”的高等原核生物类群，能够产生众多结构新颖、作用水平层次多样和作用机制独特的生物活性物质^[8]，具有抗癌、抗病毒^[9]、抗真菌、抗细菌^[10]等作用，已经成为生物活性次级代谢产物的“微工厂”^[11]，目前粘细菌已成为国内外研究热点。

粘细菌能够形成对温度、干旱、辐射、盐胁迫均具有抗性的粘孢子，因而具有较高的环境适应力，广泛分布于全球各地的土壤中。除此之外，草食动物粪便、腐败植物表面、树皮、树叶表面甚至水体中也发现了粘细菌的存在^[12]。但粘细菌的一些特性使其部分种属菌株很难从环境样品中分离出来。传统分离方法在分离菌株种类上的局限性，使得研究者们对粘细菌的生态学研究并不深入，到目前为止对于土壤中粘细菌的丰度以及群落结构仍然未知。近几年，用于研究微生物生态多样性新方法的建立，使一些通过传统培养方法不能获得微生物的生态学研究成为可能^[13]。在众多分子生物学方法中，变性梯度凝胶电泳(Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)技术由于其成本低、快捷直观的优点成为应用最广泛的微生物多样性分析手段之一^[14]。

本研究采样点位于内蒙古海拉尔市根河市，在内蒙古大兴安岭森林生态系统国家野外科学观测研究站试验区内(50°49′-50°51′N，121°30′-121°31′E)，地处大兴安岭中山地带。该区最高海拔1 116 m，最低海拔810 m，相对高差200-300 m。山体北高南低，平均坡度12°，河谷开阔常形成沼泽湿地，其原始林面积是32 km²，实验区总面积为110 km^2[15]。该地区属寒温带半湿润气候区，一年当中有9个月的平均气温在10 ℃以下，只有不超过1个月时间的平均气温高于22 ℃。全年的平均温度是-5.4 ℃，一年中气温最高可达40 ℃，极端最低气温可达到-50 ℃。全年降水量中的60%都集中在七八月份，总降水量为450-550 mm。土壤冻结状态从9月下旬持续到次年的5月初，冻结时间长达7个多月。该区土壤以棕色针叶林土为主，土壤表层有较厚的枯枝落叶层，厚度可达5-8 cm。土壤pH为4.5-6.5，腐殖质层一般在10 cm左右。大兴安岭林区罕有人至，对其土壤中所含粘细菌的研究还未见报道，而且由于其落叶及枯木覆盖量大，土壤腐殖质含量高，推测其中可能粘细菌数量较多且种类比较丰富。

本研究从采集自内蒙古自治区大兴安岭地区的15份土壤样品中筛选粘细菌，通过形态特征、生理生化特征以及16S rRNA基因序列分析对纯化出的菌株进行分类鉴定，并对其进行抗菌活性的分析，而且通过变性梯度凝胶电泳技术对其多样性进行分析。以期丰富内蒙古地区粘细菌资源库，为该地区粘细菌的深入研究奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 样品来源

在土壤的表层、腐烂的植物、堆肥、食草动物的粪便中以及水环境中都可以发现粘细菌^[4]。本研究于内蒙古自治区大兴安岭地区代表不同森林经营利用方式(原始林、皆伐林、渐伐林)的地点，利用五点采样法对表层5-20 cm处土壤进行采集(表 1)。

1.1.2 主要试剂和仪器

蔗糖，广西凤塘生化股份有限公司；FeCl₃、NaNO₃、K₂HPO₄、CaCl₂、MgSO₄等，天津风船化学试剂科技有限公司。紫外分光光度计，美国Beckman公司；电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；高压蒸汽灭菌器，上海三申医疗仪器有限公司；电子pH计，意大利HANNA仪器；超净工作台，苏州净化公司；试管、滴定管、培养皿等玻璃仪器，上海欧泉仪器有限公司。

1.1.3 培养基

VY/2固体培养基、LB液体培养基、VY/4液体培养基、ST21CX培养基、WCX固体培养基、CAS液体培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基、YPD液体培养基、土豆固体培养基、黑麦培养基等参考文献[16]配制。

1.1.4 抗菌活性测定菌株

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bciciuus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)，均由本实验室提供。

1.2 土壤参数的测定

土壤样品水分的测定采用烘干法^[17]，pH值的测定参见生态学常用实验研究方法与技术^[18]，有效磷的测定采用NaHCO₃浸提-钼锑抗比色法^[19]，速效钾的测定采用NaNO₃浸提-四苯硼钠比浊法^[20]，水解氮的测定采用碱解扩散法^[21]，有机质的测定采用重铬酸钾容量法(稀释热法)^[22]。

1.3 土壤总DNA的提取及DGGE分析

土壤总DNA的提取参见Yeates等^[23]方法。PCR反应体系(50 μL)：10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL (表 2)^[24]，Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.4 μL，DNA模板(80 ng/μL) 1 μL，无菌水38.8 μL。PCR反应条件：94 ℃ 35 s，65 ℃ 45 s (每一个循环退火温度降低1 ℃)，72 ℃ 50 s，共10个循环；94 ℃ 35 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，72 ℃ 10 min，共20个循环。利用1%琼脂糖凝胶电泳检查扩增的DNA片段，GCW1/802R扩增产物长度在450 bp左右，GCW4/802R扩增产物长度在350 bp左右。

使用40%聚丙烯酰胺凝胶，45%-65%变性梯度[100%变性梯度包含40% (体积比)甲酰胺和7 mol/L尿素]。用50 μL注射器快速上样后，于60 ℃条件下75 V电泳20 h。硝酸银染色15 min后，用去离子水洗脱10 min。扫描条带，图像用Quantity One 4.6.2软件进行分析。比较不同样品中菌群的基因型差异：香农指数、丰富度以及均匀度等指标被用来比较各个样品的粘细菌多样性。计算公式为：香农指数；丰富度R=S；均匀度E=H′/H_max=H′/lnS。

用酒精棉擦拭刀片后灼烧，待其冷却后将目的条带从凝胶上切下，置于1.5 mL离心管中，加入1 mL去离子水，颠倒洗涤条带，3 000 r/min离心1 min后弃掉去离子水，重复该步骤2次。然后加入40 μL 1×TE缓冲液，将离心管置于4 ℃过夜。以上清液为模板，以不带GC夹的引物进行相同条件和体系的扩增，所得PCR产物与pMD19-T载体连接后转入大肠杆菌，然后挑取单克隆进行菌落PCR后送北京华大公司测序。将所得测序结果于NCBI数据库的BLAST程序进行分析及相似性比较，并下载相似性最高的核酸序列，利用ClustalX 2.0程序进行比对后，利用MEGA 5.0软件构建系统发育树，进行系统发育分析。

1.4 粘细菌的分离

1.4.1 土壤样品的预处理

将经自然风干且过60目筛后的土壤样品于58 ℃下烘30 min除去耐热性较差的杂菌，取大约30 g的土壤样品置于高温高压灭菌后的90 mm培养皿内，用终浓度为100 μg/mL的放线菌酮溶液于室温下浸泡过夜，除去部分霉菌和酵母菌。

1.4.2 兔粪诱导法

将经过预处理的土样倒入ST21CX固体培养皿中，并使其铺平，将3颗灭菌兔粪球半埋入其中，于30 ℃培养箱中恒温培养6 d后，持续观察粘细菌子实体的形成。

1.4.3 大肠杆菌划线诱导法

将20 μL Escherichia coli DH5α菌液接入200 mL灭菌的LB液体培养基内，37 ℃、180 r/min振荡过夜，次日将Escherichia coli DH5α以4 ℃、8 000 r/min离心15 min后取菌体沉淀于WCX培养基上划3条均匀且厚的平行线，晾干。挑取黄豆大小的预处理土样置于3条平行线的一端，封口，于30 ℃培养箱中恒温培养。

1.4.4 滤纸诱导法

在ST21CX培养基上铺一张已灭菌的滤纸作为唯一碳源和能源。挑取3个黄豆大小的预处理土样置于滤纸的不同位置上，封口，30 ℃恒温培养，10 d后开始持续观察。

1.5 粘细菌的纯化与保存

1.5.1 菌株的纯化

识别粘细菌，挑取具有特征性菌落的边缘或子实体的头部于新鲜的VY/2培养基上以除去部分较大且不能运动的杂菌^[25]，或者用灭菌的牙签刮取长在滤纸上的粘细菌子实体或已被腐蚀的滤纸部分，将其转入新鲜的铺有灭菌滤纸的ST21CX培养基上，于30 ℃恒温培养观察。

1.5.2 菌株的纯度检验及保存

挑取经观察没有杂菌的菌株子实体，将其接种于CAS液体培养基，30 ℃、180 r/min振荡培养36 h，观察CAS液体培养基是否出现浑浊。由于粘细菌在营养丰富的培养基内生长缓慢，而其他杂菌生长则相对较快，因此CAS液体培养基澄清即可认为该菌株已纯。将已经纯化的粘细菌菌株用30%灭菌的甘油于-80 ℃长期保存。

1.6 粘细菌的鉴定

1.6.1 菌种形态的观察

到目前为止，粘细菌的分类鉴定仍以其形态特征为主要依据，用Nikon SMZ745体视显微镜和Sony数码相机对分离纯化出的VY/2培养基和ST21CX培养基上的粘细菌菌落形态以及子实体结构进行观察并拍照分析。

1.6.2 生理生化测定

按照《伯杰细菌鉴定手册》第8版中对粘细菌个别属种的生理生化特性的描述，将纯化的粘细菌菌株进行LB液体培养、大肠杆菌利用、刚果红实验、明胶液化、纤维素水解、吐温-80利用、脲酶利用、硝酸盐还原、淀粉水解、牛奶胨化与抗生素敏感性检测等实验。

1.6.3 分子鉴定

采用石英砂及溶菌酶法共同破壁进行染色体DNA的提取^[26]，利用细菌16S rRNA基因通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1495R (5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)进行PCR扩增^[27]。PCR反应条件：94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 5 min。将PCR产物送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序，利用NCBI软件中的BLAST对实验菌株的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的已知序列进行同源性比对。

1.7 粘细菌的抗菌活性分析

将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌菌液分别接入灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基内，37 ℃、180 r/min振荡过夜，次日将这3种菌的液体培养物于4 ℃、8 000 r/min离心15 min，取菌体沉淀分别均匀涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，晾干。用经高温高压灭菌的蓝色枪头扎取VY/2固体培养基上已纯化的粘细菌菌株，将其倒扣在涂布有均匀指示细菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，并在边缘处放上同样大小的VY/2培养基作空白对照，37 ℃恒温培养，2 d后观察抑菌情况。

将马铃薯晚疫病菌事先接入黑麦培养基内培养3 d，再将已纯化的菌株琼脂块接于距指示真菌约1 cm处，18 ℃恒温培养，8 d后观察抑菌圈的大小。将酿酒酵母菌先接入YPD液体培养基内培养18 h，再将其均匀涂布在土豆培养基上，将已纯化菌株的琼脂块倒扣于该培养基上，37 ℃恒温培养，40 h后观察是否出现抑菌圈。

2 结果与分析 2.1 土壤参数的测定结果

对内蒙古自治区大兴安岭地区采集的15种土壤样品的含水量、pH值、有机质、有效磷、水解氮以及速效钾的含量进行了测定，结果如表 3所示。采集的土壤样品均偏酸，有机质含量相对较高。其中，1号土样的有机质含量最高，为27.27 g/kg，而12号土样有机质含量最低，为4.02 g/kg。15个土样的碱解氮含量不均，1、4、6、7、8号土样碱解氮含量均相对较高。其中4号土样碱解氮含量最高，为185.03 mg/kg，而12号土样碱解氮含量最低，为24.79 mg/kg，各土壤样品间存在较大差异。土壤有效磷和速效钾含量分别在8.08-43.84 mg/kg和23.86-178.65 mg/kg不等。其中7号土样有效磷含量最高，为43.84 mg/kg，而15号土样有效磷含量最低，为8.08 mg/kg，但其速效钾含量最高，为178.65 mg/kg，而13号土样速效钾含量最低，为23.86 mg/kg。

2.2 土样中粘细菌群落的DGGE分析

对15个土样中孢囊杆菌亚目、侏囊菌亚目和堆囊菌亚目的粘细菌基因进行DGGE分析，从DGGE图谱中可以看出基因条带数较多(图 1)，分布较为均匀，大多数泳道的优势条带相同。其中，粘细菌孢囊杆菌亚目和侏囊菌亚目16S rRNA基因的DGGE图谱显示1号样品和15号样品条带最少，为21条，3号样品的条带数最多，为35条。粘细菌堆囊菌亚目16S rRNA基因的DGGE图谱显示1号样品条带最少，为21条；8号样品的条带数最多，为31条。香农指数越大，多样性越高。从表 4中可看出这些采自大兴安岭的土样均表现出较丰富的粘细菌多样性，香农指数在2.929-3.406之间。其中1号样品孢囊杆菌亚目和侏囊菌亚目的香农指数最低，为2.962；3号样品香农指数最高，为3.406。5号样品中堆囊菌亚目的香农指数最低，为2.929；8号样品香农指数最高，为3.269。均匀度指数越接近1，群落结构组成越均匀，研究中15个样品中孢囊杆菌亚目、侏囊菌亚目和堆囊菌亚目的粘细菌都具有较高的均匀度指数，在0.934-0.989之间，表明土壤样品的群落结构稳定。

在DGGE图谱中，各样品显示出有限数量的优势条带和大部分较弱的条带(图 1)。在15个土样中，大部分条带是共有的，只有少部分条带较为特殊。如图 1A孢囊杆菌亚目和侏囊菌亚目中，4、10、11、14、15号条带在每个样品中均有出现，而出现5号和7号条带的样品数较少，且分别在11号与12号样品中较强，但是在7号样品，即唯一的人工林地土样中则出现了3条特异性带1、2、3。在图 1B堆囊菌亚目中，2、4、20和23号条带在每个样品中均有出现，而7号带较特异，只出现在3号样品中。根据所得到的16S rRNA基因指纹图谱，把其中相对优势的条带以及特别的条带进行切胶回收。因为一部分条带在进行胶回收时的DNA量较少，导致PCR扩增没有产物，出现这样的结果可能是由于从DGGE胶上切下的条带为假阳性条带或者是非特异性扩增所致。此外，部分送去测序的样品由于没有达到测序要求，出现套峰现象，导致测序失败，因此最终只得到了29个条带的测序结果。图 1A中7号人工林地土样中的3条特异性带分别属于Cystobacter sp.、Uncultured Archangium sp.、Myxococcus xanthus，由此可初步推测出人工林地的土样环境可能比较适合这3种粘细菌生存，而4、10、11、14、15号条带分别代表的Myxococcus virescens、Archangium sp.、Myxococcus stipitatus、Haliangium tepidum、Uncultured Plesiocystis sp.在每个样品中均有发现，说明其生存范围广泛且生存能力较强。图 1B中3号样品中的7号特异性条带属于Sorangium，但却不可培养，推测实验室条件无法模拟3号样品的生态环境，达不到该菌株生长所需的特殊要求，4号条带因胶回收后的DNA量没有达到测序要求，导致测序失败，而出现在每个样品中的2、20、23号条带则分别属于Sorangium cellulosum、Chondromyces apiculatus、Polyangium sp.。

将测序结果与GenBank数据库中相似性最高的菌株进行比对后，用软件MEGA 5.0建立Neighbor-Joining系统进化树，结果如图 2所示。由图 2可知，经鉴定的种属均分为两个分支，其中一个分支与不可培养的标准菌株同源性相近，而另一分支大多与可培养的标准菌株同源性相近。图 2中29个条带的同源菌分别代表了粘细菌孢囊杆菌亚目、侏囊菌亚目和堆囊菌亚目的一部分科属，分别为Archangium、Cystobacter、Haliangium、Nannocystis、Plesiocystis、Myxococcus、Corallococcus、Enhygromyxa、Sorangium、Polyangium、Jahnella、Chondromyces、Byssovorax共13个属。从系统进化树中可以看出，这些土壤中孢囊杆菌亚目、侏囊菌亚目和堆囊菌亚目的粘细菌具有很高的多样性。

将土壤中粘细菌多样性与环境参数作相关性分析，所得Pearson相关系数如表 5所示。丰富度A和含水量呈弱负相关，香农指数A和含水量呈显著性负相关，丰富度A和香农指数A与有机质的Pearson相关系数分别为-0.419和-0.512，其绝对值均大于0.4，因此孢囊杆菌亚目和侏囊菌亚目粘细菌在土壤中的丰富度和香农指数均与有机质含量呈显著性负相关，另外香农指数A与丰富度A与有效磷、速效钾均有弱正相关性。除此之外，pH、碱解氮与孢囊杆菌亚目和侏囊菌亚目粘细菌在土壤中的丰富度和香农指数无明显相关性。丰富度B与含水量、有效磷呈弱负相关，与pH、速效钾呈弱正相关；香农指数B和含水量、有机质、碱解氮呈弱负相关，与pH呈弱正相关。

2.3 菌株的分离纯化

利用兔粪诱导、大肠杆菌诱导及滤纸诱导3种分离方法从15个土壤样品中共分离出88株细菌，通过直接挑取子实体等纯化方法得到22株纯菌。其中，用兔粪诱导法分离出37株菌，纯菌14株；用大肠杆菌划线诱导法分离出23株菌，纯菌8株；用滤纸诱导法分离出28株菌，暂时还未有纯化的菌株(表 6)。虽然运用滤纸诱导法分离出的菌株数相对较多，但是由于溶纤维素类群的菌株较难纯化，一般需要1-2年的时间，因此其纯菌率是最低的；另外，由于噬大肠杆菌的微生物种类较多，所以用大肠杆菌诱导法分离出菌株后，在纯化的过程中很容易染杂菌，因此纯化出的粘细菌数量也相对较少。

2.4 菌株的鉴定

2.4.1 菌株的形态特征

对分离纯化菌株的子实体形态及菌落进行观察。利用兔粪诱导法分离出的粘细菌数量相对较多且形态各异，诱导出的部分菌株子实体形态明显，肉眼可见，多数呈卵球形，坚硬程度不同，颜色鲜亮，易于分辨。用兔粪诱导法及大肠杆菌划线诱导法分离出的22株纯菌均可以在VY/2固体培养基上形成特征性的菌落，能产生黏液，能够滑行运动，可侵噬活菌，有薄而半透明的膜，有的圆形扩展，有的呈放射状波纹。部分菌株的子实体形态如图 3所示，经形态特征鉴定可以初步确定纯化出的菌株分属于粘细菌的粘球菌属和珊瑚球菌属。

根据《伯杰细菌鉴定手册》第8版，对纯化出的具有粘细菌形态特征的22株菌进行形态鉴定，根据菌落和子实体的颜色、形态特征以及能否进行滑行运动，可以将这些菌株分为7大类，具体特征如表 7所示。

2.4.2 菌株的生理生化特征

对纯化的菌株进行生理生化检测，发现所有的菌株均不能在LB液体培养基内生长，而且可以利用活的大肠杆菌以及吐温-80，并使明胶液化，可吸附刚果红，但不能降解纤维素，生理生化特征与《伯杰氏细菌手册》中所描述的粘球菌属及珊瑚球菌属的特征相符，结合其形态特征可初步认为纯化的菌株有黄色粘球菌、橙色粘球菌、变绿粘球菌及珊瑚状珊瑚球菌和弱小珊瑚球菌。

2.4.3 菌株的分子鉴定

提取纯化菌株的基因组DNA，PCR扩增其16S rRNA基因片段并测序，将测序结果通过BLAST程序与在GenBank数据库中的已知序列进行相似性比对，结果如表 8所示，所有菌株的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的已知序列比对的最高相似性都达到了97%以上。

结合形态、生理生化特征及16S rRNA基因序列比对结果，最终确定得到的粘细菌菌株数为22株，均属孢囊菌亚目，分属粘球菌属和珊瑚球菌属。其中，4株为黄色粘球菌，1株橙色粘球菌，6株变绿粘球菌，1株具枝粘球菌，3株珊瑚粘球菌，3株大孢珊瑚球菌，3株弱小珊瑚球菌，1株珊瑚状珊瑚球菌。

为确定所纯化得到的菌株之间的亲缘关系，选取8株不同种间具有代表性的菌株，并且下载相似性最高的菌株序列，用ClustalX和MEGA软件进行多重比对和建立Neighbor-Joining系统发育树，进而阐明种属间的亲缘关系，结果如图 4所示。大多数的粘细菌在系统进化树上能形成各自独立的分支，说明粘细菌形态分类和16S rRNA基因的系统发育关系具有较好的一致性。

2.5 粘细菌的抗菌活性分析

将得到的22株纯菌进行抗菌活性的检测，观察其抑菌活性以及记录抑菌圈的大小(距离目的菌株1 mm内指示菌不生长即视为目的菌株对指示菌具有抑制活性)。部分菌株抑菌活性的检测结果如图 5所示。

结果表明，所得到的22株粘细菌均表现出可以对一种甚至多种指示菌产生抗性，其中有19株可以杀死和溶解大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)，7株表现出拮抗枯草芽孢杆菌(Bcicius subtilis)生长的活性，13株对酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的生长表现出抑制作用，8株可以抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的生长，14株表现出能够抑制马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)生长的活性，结果如表 9所示。

3 讨论与结论

粘细菌分布广泛，从南极到热带，从水体到陆地。通常一匙土壤可能产生5-10种粘细菌。但是，不同生境中粘细菌的生态分布仍然未知。关于粘细菌多样性的研究主要是基于传统的分离方法，目前仍然没有一种高效的粘细菌分离方法，因此不可避免地低估了粘细菌的多样性。粘细菌的分离技术通常是将自然样品接种到固体培养基上以期诱导子实体的形成。然而，许多粘细菌种属在目前的培养条件下并不能形成子实体，导致大部分菌株丢失。不同环境中的微生物群落通常使用分子生物学技术进行研究。虽然Wu等^[24]利用杂交方法发现粘细菌占不到总细菌的1%，但其数量和种类在复杂的群落中仍然未知。本文采用一种快速、经济的DGGE技术研究复杂微生物群落中粘细菌的多样性，通过对粘细菌16S rRNA基因的扩增及DGGE分析，发现土壤样品中粘细菌的种类较多。从对粘细菌多样性进行分析时所切胶回收条带的测序结果可看出，该土壤样品中含有孢囊杆菌亚目、侏囊菌亚目以及堆囊菌亚目粘细菌共13个属，基本覆盖了大部分已知的科属。其中，Myxococcus virescens、Archangium sp.、Myxococcus stipitatus、Haliangium tepidum、Uncultured Plesiocystis sp.、Sorangium cellulosum、Chondromyces apiculatus、Polyangium sp.共8个种的菌株在每个样品中都存在，而Cystobacter sp.、Uncultured Archangium sp.、Myxococcus xanthus只出现在7号人工林地土样中，3号渐伐林地土样中出现的特异条带经鉴定属于Sorangium，在目前的实验条件下还不可富集培养。我们的研究结果表明土样中依然存在很多在目前实验条件下不可培养的粘细菌，并且粘细菌的数量远超过Dawid的研究，他对64个国家采集的1 398份土样进行分析时发现每个样品中含有1-10种粘细菌^[12]。Li等^[28]基于Taxon-Specific Gene利用Semi-Nested PCR-DGGE技术对从新疆采集的8份土壤进行分析时只发现了5个种属的粘细菌，远少于本研究中发现的种属，但其却发现了本实验中未有的Stigmatella和Anaeromyxobacter，这可能是由于本实验中的土样均属于表层土，因而没有厌氧粘细菌Anaeromyxobacter的存在，其次PCR时所用的引物也有所不同而且不同地区的土壤样品中本就所含的粘细菌多样性不同。此外，山东大学Wu等^[24]和周秀文^[29]分别用分子杂交和高通量测序技术对校园土壤中粘细菌多样性进行分析，其结果均表明土样中粘细菌种类较多，基本覆盖了已知的科属以及大量未分类粘细菌。这与本研究所得结论基本一致。因此我们推测新的粘细菌资源可能需要依赖于新的分离方法。

本研究对内蒙古自治区大兴安岭地区采集的15种土壤样品的含水量、pH值、有机质、有效磷、水解氮以及速效钾的含量进行了测定。结果发现采集的土壤样品均偏酸，并将15个样品的参数分别与全国第二次土壤普查各项土壤养分指标的等级范围分级标准进行对比，可知有机质、有效磷、水解氮以及速效钾的含量整体都处在一个适宜以上的水平。将各参数与DGGE分析结果做相关性分析，发现土壤有机质含量是影响孢囊杆菌亚目和侏囊菌亚目粘细菌多样性的主要因素，但没有明显的相关性，可能是由于DGGE实验技术本身的分离鉴定能力有限，不能反映所有的种属分布，或者是由于本研究中有部分条带没有得到测序结果，无法鉴定种属。周秀文^[29]发现粘细菌的丰度与温度、pH、有机碳含量、碳氮比的相关性较低，与降水量以及颗粒分级更是无相关性。内蒙古大兴安岭地区地域辽阔，土壤类型众多，导致产生粘细菌多样性差异的原因众多，除本文中研究的环境因子对粘细菌多样性产生影响外，重金属、盐度、降雨量、地形以及土壤利用方式等诸多因素都可能影响粘细菌的多样性。

本研究利用传统方法分离到的可培养粘细菌只有两个属——粘球菌属和珊瑚球菌，远少于DGGE技术发现的粘细菌。由于粘细菌生长缓慢、纯化困难且分离纯化的方法特殊，并不能通过一两次操作达到目的，纯培养一株粘细菌菌株通常需要两三个月，甚至更长时间。此外，部分种属粘细菌在当前的实验条件下并不能富集培养，加之粘细菌子实体结构容易退化和丢失，致使传统的粘细菌分离纯化方法容易遗漏粘细菌菌株，因此，分离到的可培养粘细菌可能只是代表了自然环境中粘细菌类群的一小部分，并不能准确地反映自然环境中粘细菌的真实组成。虽然经过反复实验研究出了一套可行的粘细菌分离纯化方法，但在纯化方法上仍然存在不足，尤其是对溶纤维素类群的粘细菌的纯化方法上，还有待于进一步提高和优化，以提高纯化粘细菌的效率和缩短纯化时间。另外，3种分离粘细菌的方法中滤纸诱导法是最难诱导出粘细菌的，而兔粪诱导法和大肠杆菌诱导法则相对较容易，这可能是由于嗜细菌性粘细菌种类较多，而嗜纤维素粘细菌则相对较少，因此需要创新出更好的方法来分离嗜纤维素粘细菌。

采样地处于内蒙古海拉尔市根河市，在内蒙古大兴安岭森林生态系统国家野外科学观测研究站试验区内，大兴安岭中山地带为寒温带半湿润气候区。由于地形、气候、水热条件、植被及土壤等自然环境的不同，以至大兴安岭地区的生物具有多样性。本研究从该地区采集的土壤样品中均分离得到了粘球菌属及珊瑚球菌属的粘细菌，说明这两个属粘细菌的生态分布比较广泛。虽然分离到的粘细菌种类大致是相同的，但由此可以推断出粘球菌属及珊瑚球菌属可能为该地区粘细菌菌群中的优势菌。此外，在有机质、水解氮、有效磷以及速效钾含量都相对较低的12号土样中也分离到粘细菌，说明粘细菌在恶劣环境下也具有较强的生存能力。曾有科学家在南极地区采集到的土样中发现有粘细菌，这些粘细菌在实验室条件下并不能生存。在阿尔卑斯山脉6-8 ℃的环境中人类第一次发现了粘球菌属(Myxococcus)和小囊菌属(Nannocystis)^[30]，还有研究发现在美国亚利桑那州的高温沙漠土中也有粘细菌的踪迹^[31]。这些研究发现在极端环境中也有粘细菌的存在，说明其生存能力较强，与本研究的结果相符。

经抗菌活性分析发现，本课题所有纯化出的粘细菌菌株都有对抗一种或多种指示细菌或真菌的能力，而且从不同土壤样品中分离出的同一属种的粘细菌菌株所抑制的细菌种类以及抑制强弱均不同。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，隶属于葡萄球菌属，有“嗜肉菌”的别称，可引起局部化脓感染，也可引起心包炎、肺炎、伪膜性肠炎等，甚至脓毒症、败血症等全身感染。大肠杆菌是与人们日常生活关系非常密切的一类细菌，学名称作“大肠埃希菌”，属于肠道杆菌大类中的一种。在机体免疫力降低、肠道长期缺乏刺激等特殊情况下，其会移居到肠道以外的地方，例如胆囊、尿道、膀胱、阑尾等部位，造成相应部位的感染或全身播散性感染。本文共筛选出8株抑制金黄色葡萄球菌生长的粘细菌，19株抑制大肠杆菌生长的粘细菌，为今后防治金黄色葡萄球菌及大肠杆菌引起的疾病提供新的思路。其中还有14株纯菌表现出能够抑制马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)生长的活性。由于人口日益增长，越来越多的农药被用来提高粮食的生产，但其一般属于高毒，每年因农药造成的中毒事件时有发生^[32]。马铃薯是世界四大粮食作物之一，仅次于小麦、玉米和水稻，但每年都会因块茎腐烂大量减产。马铃薯晚疫病是由马铃薯晚疫病菌引起的马铃薯茎叶死亡和块茎腐臭的一种毁灭性病害。因此，研发高效无害的防治马铃薯晚疫病的农药迫在眉睫。在本研究中，从大兴安岭地区土壤样品中分离得到的大部分粘细菌菌株表现出抑制马铃薯晚疫病菌生长的活性，为研发有效防治马铃薯晚疫病的农药提供了新思路，但是其活性物质为何种物质以及其拮抗机理、大田应用等多种问题都有待今后进一步分析。本研究可为抗菌活性物质的进一步提取、分离、纯化及鉴定奠定基础，也可为内蒙古地区粘细菌的深入研究及抗马铃薯晚疫病农药研发提供基础数据，具有比较实际的指导意义。