微生物学通报  2018, Vol. 45 Issue (2): 250−265

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徐方继, 李桂鼎, 李沁元, 陈秀, 姜成林, 姜怡
XU Fang-Ji, LI Gui-Ding, LI Qin-Yuan, CHEN Xiu, JIANG Cheng-Lin, JIANG Yi
怒江大峡谷怒江州段土壤放线菌多样性
Diversity of actinomycetes in soil from Nujiang Grand Canyon in Nujiang Prefecture
微生物学通报, 2018, 45(2): 250-265
Microbiology China, 2018, 45(2): 250-265
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170420

文章历史

收稿日期: 2017-06-12
接受日期: 2017-10-25
网络首发日期(www.cnki.net): 2017-11-08
怒江大峡谷怒江州段土壤放线菌多样性
徐方继1 , 李桂鼎3 , 李沁元1,2 , 陈秀3 , 姜成林1 , 姜怡1     
1. 云南大学生命科学学院 云南省微生物研究所    云南 昆明    650091;
2. 云南大学生命科学学院实验中心    云南 昆明    650091;
3. 东北大学生命与健康学院 微生物药物研究所    辽宁 沈阳    110819
摘要【背景】 怒江大峡谷怒江州段凭借独特的地理环境、丰富的动植物多样性以及极少的人为干扰,拥有很高的生物多样性调查价值,但对于该生境中的放线菌多样性研究尚未见相关报道。【目的】 研究怒江大峡谷怒江州段土壤放线菌多样性情况。【方法】 利用Illumina HiSeq平台对怒江州段土壤样品放线菌免培养多样性进行高通量测序,通过相对丰度、物种聚类、主成分分析对不同样品中放线菌组成及其相似性进行了分析。同时通过9种不同类型培养基结合有效的预处理方法和非目的菌抑制剂进行放线菌的纯培养分离。【结果】 高通量测序共获得Tag数目474 203条,OTU数目15 671个,它们分布于细菌域下的47个门90个纲170个目320个科561个属。通过不同样品的比较,发现BS、F-G、F-L、L样品的放线菌免培养多样性普遍优于丙中洛样点的BB、BT、BH样品。纯培养分离共获得351株放线菌,分布于放线菌纲下8个目14个科26个属。所用9种培养基中,YIM171培养基的分离效果最好。通过比较不同样品的放线菌纯培养多样性,丙中洛混合样明显优于其他样品。【结论】 怒江大峡谷怒江州段土壤样品中放线菌多样性丰富,应进一步挖掘其放线菌资源潜力,为今后放线菌次生代谢产物的开发提供有效的菌株资源。
关键词怒江大峡谷     土壤     放线菌多样性     16S rRNA基因    
Diversity of actinomycetes in soil from Nujiang Grand Canyon in Nujiang Prefecture
XU Fang-Ji1, LI Gui-Ding3, LI Qin-Yuan1,2, CHEN Xiu3, JIANG Cheng-Lin1, JIANG Yi1     
1. Yunnan Institute of Microbiology, School of Life Sciences, Yunnan University, Kunming, Yunnan 650091, China;
2. Laboratory Center, School of Life Sciences, Yunnan University, Kunming, Yunnan 650091, China;
3. Institute of Microbial Pharmaceuticals, College of Life and Health Sciences, Northeastern University, Shenyang, Liaoning 110819, China
Received: June 12, 2017; Accepted: October 25, 2017; Published online (www.cnki.net): November 08, 2017
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (31460005, 31270001)
*Corresponding author: JIANG Yi, Tel: 86-871-65034073; E-mail:jiangyi@ynu.edu.cn.
Abstract: [Background] Nujiang Prefecture (Nujiang Grand Canyon), which possess unique geographic conditions and abundant flora and fauna diversity, making great value to study its biodiversity. However, little research have been done to investigate the actinomycetal diversity in this area. [Objective] Research the diversity of soil actinomycetes in Nujiang Grand Canyon. [Methods] High throughput sequencing (Illumina HiSeq platform) was employed to investigate the actinomycetal culture-independent diversity of soil samples. We used several bioinformational figures to making comparison of the differences in actinomycetes composition structure among the seven samples. Meanwhile, the suited culture-dependent isolation methods were determined by tested different pre-treatment methods, undesired bacteria inhibitors and multiple isolation media. [Results] A total of 474 203 bacteria genes and 15 671 OTUs were obtained, the results distributed in 47 phyla, 90 classes, 170 orders, 320 families, 561 genera. Specific to the actinomycetal phylum, high throughput sequencing detected 9 classes, 53 families, 80 genera. The analysis of the diversity between different samples showed that the samples, which called BS, F-G, F-L, L, exhibited better condition than BB, BT, BH. The results showed that 351 actinomycetal strains were obtained from seven soil samples. It belonged to 8 orders, 14 families, 26 genera. YIM171 medium showed the greatest isolation results. The sample of BH exhibited the most rich actinomycetal diversity obviously. [Conclusion] Abundant actinomycetal diversity in this area was mined out by this research. Further bioactivity potential should be tested to offer much more actinomycetal strains for the exploitation of secondary metabolite.
Key words: Nujiang Grand Canyon     Soil     Actinomycetal diversity     16S rRNA gene    

怒江发源于我国青藏高原,流经西藏、云南等地,在云南省境内蜿蜒长达650 km,在怒江傈僳族自治州境内310 km。怒江奔腾于碧罗雪山山脉和高黎贡山山脉之间,形成了从云南怒江傈僳族自治州(本研究中简称为怒江州)贡山独龙族怒族自治县的丙中洛乡至保山市龙陵县的老卡,长310 km、平均深度为2 km的大峡谷[1-2]。与我国典型河流(长江、黄河等)相比,怒江所流经区域,特别是云南怒江州处于一个非常少见的高海拔、高动植物多样性(怒江州段动植物多样性极其丰富,森林覆盖率达44%[3])、气候类型多样、受人为因素影响相对较小的区域。对于怒江大峡谷的各方面研究主要集中于民俗文化[4]、地质[5]、水文[6]、动植物[7-8]等方面,而对放线菌多样性研究方面还没有相关研究报道。

众所周知,土壤作为地球生态系统中分布较为广阔的一种生境,分布于各种生态系统(森林[9-11]、沙漠[12-14]、高原[15-18]等)。复杂的地理环境特点及多样的理化性质极大地丰富了土壤微生物群落结构的多样性和功能性[19]。作为土壤中的重要组成部分,土壤微生物承担着有机物质降解、无机养分循环的作用,同时保持与植物十分密切的互作关系[20-21]。放线菌门作为细菌域的重要成员之一,不仅能够调节土壤养分,而且是微生物来源抗生素的大量产生者[22]。据统计[23],在20%-25%具备生物活性的天然产物中,10%来源于微生物,而在这些微生物中有45%来源于放线菌。

本研究分别利用二代高通量测序Illumina HiSeq平台和平板分离纯化技术调查怒江大峡谷怒江州段土壤放线菌多样性,初步探明怒江州段各样点的放线菌组成情况,获得了大量放线菌菌株资源,为研究此区域放线菌资源提供了一定资料和借鉴。

1 材料与方法 1.1 样品信息

从怒江大峡谷怒江州段选取4个样区(即丙中洛、石月亮至贡山、福贡至泸水、泸水)进行土壤样品采集,每份土样均采用五点采样法,剥除表层土后用采样铲采集5-10 cm深土壤样品,收集至无菌袋中,每个样区获得约15份土壤样品,4个样区共得到60份,带回实验室后通过观察比较不同土样的外观特点进行初步整理和分类,包括颜色、土质、土壤颗粒形状以及土壤所夹杂的物质类型等方面。通过比较观察发现,丙中洛样区各土样呈现出较为多样化的情况,所以将具有同样土壤外观特点的样品分为一组。该样区共分为4组,包括黑土夹杂页岩组(BB)、团状土壤颗粒组(BT)、沙状土组(BS)以及混合样组(BH)。其余3个样区的土壤类型较单一,各作为混合样进行研究,即S-G、F-L、L样品。每份土样分为3部分,分别用于土壤理化指标检测、高通量测序中土壤总DNA的提取、放线菌纯培养分离。所测土样的理化指标包括水分含量、有机质含量、pH值、总溶解性固体及电导率,由云南同川农业分析测试技术有限责任公司完成。

1.2 怒江州段土壤放线菌免培养多样性研究

1.2.1 主要试剂和仪器

土壤DNA基因组提取试剂盒,TIANGEN公司;Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer、高效高保真酶、NEB Next® Ultra™ DNA Library Prep Kit for Illumina建库试剂盒,New England Biolabs公司;GeneJET胶回收试剂盒,Thermo Scientific公司。PCR仪,Bio-Rad公司。

1.2.2 样品总DNA提取

采用CTAB[24]方法对适量样本的基因组DNA进行提取,之后利用浓度为0.8%-1.0% (质量体积比)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。

1.2.3 16S rRNA基因V3-V4区的扩增和上机测序

以稀释后的基因组DNA为模板,使用带Barcode的特异引物,引物为16S V3-V4区引物341F (5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R (5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。PCR反应体系(30 μL):Phusion Master Mix (2×) 15 μL,Primer (2 μmol/L) 3 μL,gDNA (1 ng/μL) 10 μL (5-10 ng),ddH2O 2 μL。PCR反应条件:98 ℃ 1 min;98 ℃ 10 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30个循环;72 ℃ 5 min。根据PCR产物浓度进行等浓度混样,充分混匀后使用1×TAE浓度2%的琼脂糖胶电泳纯化PCR产物,选择主带大小在400-450 bp之间的序列,割胶回收目标条带。然后将扩增产物送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司用HiSeq2500 PE250进行上机测序。

1.2.4 测序数据处理

根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样品数据,截去Barcode和引物序列后对每个样品的Reads进行拼接,得到的拼接序列为原始Tags数据(Raw tags);过滤低质量、短长度以及嵌合体后得到高质量的最终用于分析的Tags数据(Effective tags)。对所有样品的全部Effective tags进行聚类后,默认以97%的一致性(Identity)将序列聚类成为操作分类单元(OTU),同时会选取OTU的代表性序列进行物种注释,获得分类学信息并分别在各个分类水平门(Phylum)、纲(Class)、目(Order)、科(Family)、属(Genus)、种(Species)统计各样本的群落组成。

(1) 单样品复杂度分析

使用R软件(version 2.15.3)绘制稀释曲线。

(2) 放线菌丰度统计及物种分布情况

通过利用SPSS19 (https://www.ibm.com/)分别制作样品相对丰度图,重点分析样品中放线菌在各分类水平上的丰度及分布情况。

(3) 多样品比较分析

多样品比较分析(Beta diversity)是利用CANOCO软件(v.5:http://www.canoco5.com/)制作主成分分析图(PCA)来分析样品间放线菌群落结构的相似性。

1.3 怒江州段土壤放线菌纯培养多样性研究

1.3.1 主要试剂和仪器

细菌通用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成;DNA提取步骤中的溶菌酶、蛋白酶、抽提化学试剂(苯酚、氯仿、异戊醇等)及PCR体系所用的Taq DNA聚合酶、dNTPs均购自昆明云科生物科技有限公司。PCR仪、电泳仪,Bio-Rad公司。

1.3.2 放线菌的分离

(1) 预处理方法

将2 g土样于28 ℃室温风干7 d,在80 ℃干热处理1 h,0.1% Na4P2O7·10H2O溶液中分散处理1 h,使用超声仪处理40 s。

(2) 培养基(g/L)

将以上通过预处理的土壤悬液涂布于以下前9种培养基(pH 7.2),培养基中添加重铬酸钾70 mg/L作为细菌和真菌抑制剂,稀释梯度为102、103倍。

1) YIM 171:甘油10.0,天门冬素1.0,K2HPO4·H2O 1.0,MgSO4·7H2O 0.5,CaCO3 0.3,复合维生素0.01,微量盐1.0,琼脂粉15.0。2) HV培养基:腐殖酸1.0,Na2HPO4 0.5,MgSO4·7H2O 0.05,FeSO4·7H2O 0.1,CaCl2 1.0,复合维生素0.01,琼脂粉15.0。3)甘露醇-丙氨酸培养基:甘露醇10.0,丙氨酸1.0,K2HPO4 1.0,MgSO4·7H2O 1.0,CaCO3 0.2,FeSO4·7H2O 0.01,微量盐1.0,复合维生素1.0,琼脂粉18.0。4)木质素培养基:木质素1.0,(NH4)2SO4 2.7,KH2PO4 2.4,K2HPO4 5.7,MgSO4·7H2O 1.0,微量盐1.0,琼脂15.0。5)甘油精氨酸培养基:甘油6.0,精氨酸1.0,K2HPO4 0.5,MgSO4 0.5。6)葡萄糖-天门冬素琼脂培养基:葡萄糖10.0,天门冬素0.5,牛肉膏2.0,K2HPO4 0.5,pH 7.2。7)棉籽糖-组氨酸培养基:棉籽糖10.0,组氨酸1.0,K2HPO4·H2O 1.0,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4 0.01,琼脂粉15.0。8) YIM 6:可溶性淀粉10.0,酪素0.3,KNO3 2.0,MgSO4·7H2O 0.05,NaCl 2.0,K2HPO4 2.0,CaCO3 0.02,FeSO4 0.01,复合维生素0.01,琼脂粉15.0。9) YIM 212:海藻糖5.0,脯氨酸1.0,(NH4)2SO4 1.0,NaCl 1.0,CaCl2 2.0,K2HPO4·H2O 1.0,MgSO4·7H2O 1.0,复合维生素0.01,琼脂粉15.0。10) YIM38:酵母粉4.0,葡萄糖4.0,麦芽膏2.0,微量盐1.0,复合维生素0.01,琼脂粉15.0。

(3) 菌株的分离纯化培养

将涂布好的平板于28 ℃倒置培养14 d,待放线菌菌落长出后根据其生理形态特点用竹签挑取菌落至YIM38琼脂斜面培养基。将斜面置于28 ℃倒置培养7-10 d,摒弃重复和污染菌株后编号。使用YIM 38培养基平板收集菌体用于基因组提取,并将菌株保藏于30%甘油管,-20 ℃保存。

(4) DNA提取、扩增及测序比对

采用酶法小量提取[25]进行DNA提取。细菌16S rRNA基因的扩增使用通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反应体系(50 μL):10×Buffer 5 μL,dNTPs (10 mmol/L) 4.0 μL,27F和1492R (10 μmol/L)各1.0 μL,Taq 酶(5 U/μL) 0.3 μL,ddH2O 37.7 μL,DNA模板1.0 μL。PCR反应条件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min,56 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min 30 s,32个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃保存。

将所得PCR产物用1.0%的凝胶电泳检测后,送至上海博尚生物技术有限公司进行测序。测序结果用EzTaxon数据库(http://www.ezbiocloud.net/)进行比对。利用MEGA 7.0[26]以邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树,Bootstrap 1 000次用于评价进化树分支聚类的稳定性。

2 结果与分析 2.1 土壤理化性质测定结果

表 1表示了7个样品的样品地理位置、采样情况及理化指标结果,包括水分、pH值、有机质、电导率和总溶解性固体。

表 1 样品信息 Table 1 Sample information
样品分区
Sampling areas
经纬度
Longitude & Latitude
样品特征
Characteristics
样品
Sample
采样海拔
Altitude (m)
土壤类型
Soil type
水分
Water (%)
pH 有机质
Organic matter (g/kg)
电导率
Conductivity (μS/cm)
总溶解性固体
TDS (mg/L)
丙中洛
Bingzhongluo village
98.65°E, 28.027°N 黑土夹杂页岩 BB 1 743 森林 21.34 6.6 94.5 899.9 463.4
团状颗粒土 BT 1 743 森林 30.20 7.1 42.6 499.0 256.2
沙状土 BS 1 743 森林 11.43 7.2 18.2 175.2 89.7
混合样 BH 1 743 森林 22.15 6.8 33.0 584.8 300.4
石月亮至贡山
Shiyueliang village-Gongshan county
98.68°-98.89°E, 27.74°-27.25°N 混合样 S-G 1 522 森林 17.74 7.2 19.0 454.8 237.8
福贡至泸水
Fugong county-Lushui county
98.87°-98.86°E, 26.91°-25.82°N 混合样 F-L 1 225 森林 6.18 7.7 10.8 168.9 87.4
泸水
Lushui county
98.86°E, 25.82°N 混合样 L 845 森林 3.70 6.6 11.3 156.1 79.3
2.2 怒江州段土壤放线菌免培养多样性研究

2.2.1 测序数据处理结果

原始下机数据经过拼接以及多重过滤后最终得到用于后续分析的Tag序列,各样品的序列统计结果如表 2所示。

表 2 样品测序数据统计 Table 2 Sequencing data statistics
样品
Sample
原始Tags序列数目
Raw tags
有效Tags序列数目
Effective tags
有效Tags序列平均长度
Average length
OTU数量
Number of OTUs
BB 86 341 73 083 415 1 312
BT 84 488 70 879 422 832
BS 81 984 70 288 418 2 911
BH 71 828 58 930 419 789
S-G 84 585 69 288 415 3 380
F-L 72 477 60 630 417 3 309
L 85 750 71 105 414 3 138

2.2.2 样品稀释度曲线

通过样品稀释度曲线(图 1)可知,7个样品测序数据量合理,总体上物种丰富程度在样本之间存在一定差异。BB、BH、BT 3个样品中细菌丰富程度明显低于BS、S-G、F-L、L 4个样品。

图 1 稀释度曲线 Figure 1 Rarefaction curve

2.2.3 放线菌群落结构分析

由于着眼于土壤放线菌多样性,所以抽取放线菌门下属(Genus)水平OTU数目制作相对丰度图。图 2表示了各样品在属水平上的放线菌相对丰度情况。

图 2 不同样品间属水平上放线菌相对丰度情况 Figure 2 The relative abundance of actinomycetes on the genus level among different treatments

在属水平上,测序共检测到80个属,BB样品中检测到43个属,BT、BH样品都检测到了30个属,BS、S-G、F-L、L样品分别检测到45、65、59、70个属。由图 2可见,链霉菌属(Streptomyces) (12%)、节杆菌属(Arthrobacter) (11%)、类诺卡氏菌属(Nocardioides) (10%)、鱼孢菌属(Sporichthya) (8%)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia) (7%)、列舍瓦里尔菌属(Lechevalieria) (6%)、地杆菌属(Terrabacter) (4%)、韩国生工菌属(Kribbella) (4%)等27个属在L样品中丰度较高;Iamia (9%)、Crossiella (6%)、Jatrophihabitans (11%)、Acidothermus (9%)、Unidentified_Acidimicrobiales (7%)共5个属在S-G样品中有较高丰度;Iamia在F-L样品中丰度较高,占10%;Collinsella (21%)、Leucobacter (20%)、Enterorhabdus (12%)、Senegalimassilia (9%)、Unidentified_Coriobacteriaceae (10%)共5个属在BB样品中丰度较高;Leucobacter (20%)、Collinsella (27%)、Coriobacteriaceae_UCG-003 (20%)在BT样品中丰度较高;Collinsella (33%)在BH样品中丰度较高;Gaiella (17%)、Iamia (18%)共2个属在BS样品中丰度较高。属水平上,L样品中的放线菌多样性程度最高。

2.2.4 基于属水平上各样品间放线菌群落组成相似性分析

通过使用PAST软件对7个样品中高通量测序所得放线菌门下各属进行主成分分析(Principle components analysis,PCA),以期探明各样品之间放线菌群落组成的相似性。

图 3中,BB、BT、BH样品基本上聚在第四象限,BS、S-G、F-L样品聚在第二象限,而L样品则单独处于第三象限。说明这三部分样品之间的放线菌群落组成差异性较大,而各部分所包含的样品之间拥有相似的放线菌组成。

图 3 主成分分析图 Figure 3 Principle components analysis (PCA)
2.3 怒江州段土壤放线菌纯培养多样性研究

2.3.1 纯培养放线菌多样性

通过分离方法的探究,找到了较适合怒江州段7个土壤样品的分离方法和培养基成分。统计了此区域分离得到的各放线菌菌株的分类地位、系统发育关系以及潜在新分类单元,分析了不同样品的纯培养多样性情况。

通过纯培养方法从怒江大峡谷怒江州段4个样点7个土壤样品中共分离到放线菌351株,分布于链霉菌目(Streptomycetales)、微球菌目(Micrococcales)、棒状菌亚目(Corynebacteriales)、丙酸杆菌目(Propionibacteriales)、动球菌目(Kineosporiales)、假诺卡氏菌目(Pseudonocardiales)、链孢囊菌目(Streptosporangiales)、小单孢菌目(Micromonosporales)共8个目,链霉菌科(Streptomycetaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriacea)、小单孢菌科(Micromonosporaceae)、间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、原小单孢菌科(Promicromonosporaceae)、纤维单胞菌科(Cellulomonadaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、动球菌科(Kineosporiaceae)、假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、链孢囊菌科(Streptosporangiaceae)共14个科,链霉菌属(Streptomyces)、微杆菌属(Microbacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、壤球菌属(Agrococcus)、壤霉菌属(Agromyces)、节杆菌属(Arthrobacter)、诺卡氏菌属(Nocardia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、北里孢菌属(Kitasatospora)、Microterricola、地杆菌属(Terrabacter)、短杆菌属(Brevibacterium)、类节杆菌属(Paenarthrobacter)、纤维微菌属(Cellulosimicrobium)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、威廉姆斯氏菌属(Williamsia)、戈登氏菌属(Gordonia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、韩国生工菌属(Kribbella)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、气微菌属(Aeromicrobium)、动球菌属(Kineococcus)、糖丝菌属(Saccharothrix)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、野野村菌属(Nonomuraea)、小单孢菌属(Micromonospora)共26个属。其具体分布情况如表 3所示。属水平上的系统发育关系详见图 4

表 3 分离所得放线菌在各分类水平上分布情况 Table 3 Taxonomic status of the isolated actinomycetes results
Order Family Genus
Streptomycetales Streptomycetaceae Streptomyces, Kitasatospora
Micrococcales Microbacteriaceae Microbacterium, Agrococcus, Agromyces, Microterricola
Intrasporangiaceae Terrabacter
Brevibacteriaceae Brevibacterium
Micrococcaceae Arthrobacter, Paenarthrobacter
Promicromonosporaceae Cellulosimicrobium, Promicromonospora
Cellulomonadaceae Cellulomonas
Corynebacteriales Nocardiaceae Rhodococcus, Nocardia, Williamsia, Gordonia
Mycobacteriaceae Mycobacterium
Propionibacteriales Nocardioidaceae Kribbella, Nocardioides, Aeromicrobium
Kineosporiales Kineosporiaceae Kineococcus
Pseudonocardiales Pseudonocardiaceae Saccharothrix, Pseudonocardia
Streptosporangiales Streptosporangiaceae Nonomuraea
Micromonosporales Micromonosporaceae Micromonospora

图 4 基于16S rRNA基因序列以邻位连接法构建分离所得菌株在属水平上的系统发育树 Figure 4 Phylogenetic tree constructed by using the Neighbor-Joining method based on the 16S rRNA gene sequences of isolated strains on genus level 注:计算结果大于50%的自举值显示在分支上,0.01代表两个核苷酸之间的遗传距离. Note: Numbers at branch points refer to bootstrap percentages based on 1 000 replicates (only values above 50% are indicated). Bar, 0.01 substitutions per nucleotide position.

2.3.2 各培养基的筛选结果

所用9种培养基碳氮源各异,无机盐成分不尽相同。通过使用多种培养基对样品进行放线菌分离培养,不仅可以筛选到最适于所选样品的培养基,更能够全面了解样品各分类水平上的放线菌群落结构组成。

本研究共获得放线菌351株。由图 5可知,在9种培养基中,M1培养基(即YIM 171)分离得到的菌株数目最多,达到151株,占总数的43%。M2、M6、M7所分离到的菌株数目分别占总数的9%、10%、9%,其余培养基的分离效果并不理想。图 6比较了各培养基在不同样品中的分离情况,M1培养基在各样品中均分离到相对较多数目的菌株,在BB、BH、S-G样品中分离到的放线菌菌株比例分别达到了70%、42%、50%。

图 5 各培养基所分离菌株 Figure 5 The number of isolated strains in each medium

图 6 各培养基在不同样品间的分离情况 Figure 6 The isolation results of different samples in each medium

结合图 7表 4,利用M1培养基共分离到21个属,其中有6个属在其他培养基中没有分离到。M5、M6、M7培养基的分离效果不错,分别得到10、9、9个属,各有3、1、1个属在其余培养基中没有得到。而其余培养基分离效果一般。综上所述,M1培养基在所试9个培养基中效果最优,不仅分离到的放线菌菌株数目多,而且属水平上多样性程度高。

图 7 属水平上各培养基分离的相对丰度图 Figure 7 The relative abundance results isolated from nine media on genus level

表 4 属水平上各培养基分离情况 Table 4 The isolation result of different media on genus level
培养基
Media
所分离得到的属
Isolated genus
M1 Streptomyces, Agromyce, Microbacterium, Nocardia, Rhodococcus, Nonomuraea, Aeromicrobium, Williamsia, Micromonospora, Cellulosimicrobium, Cellulomonas, Arthrobacter, Mycobacterium, Agrococcus, Promicromonospora, Microterricola, Kitasatospora, Kribbella, Nocardioides, Pseudonocardia, Kineococcus
M2 Streptomyces, Microbacterium, Rhodococcus, Nonomuraea, Cellulosimicrobium, Mycobacterium, Agrococcus
M3 Streptomyces, Agromyces, Microbacterium, Nocardia, Rhodococcus, AeromicrobiumWilliamsia, Arthrobacter
M4 Streptomyces, Microbacterium, Rhodococcus, Aeromicrobium, Cellulomonas, Arthrobacter
M5 Streptomyces, Agromyces, Microbacterium, Rhodococcus, Williamsia, Terrabacter Mycobacterium, Promicromonospora, Brevibacterium, Paenarthrobacter
M6 Streptomyces, Microbacterium, Rhodococcus, Micromonospora, Cellulomonas, Arthrobacter, Agrococcus, Saccharothrix
M7 Streptomyces, Agromyces, Microbacterium, Rhodococcus, Williamsia, Cellulomonas, Arthrobacter, Agrococcus, Gordonia
M8 Streptomyces, Microbacterium, Nocardia, Rhodococcus, Promicromonospora
M9 Streptomyces, Microbacterium, Rhodococcus, Arthrobacter, Promicromonospora

2.3.3 各样品纯培养放线菌多样性的比较

统计各样品在属水平上分离所得放线菌菌株的数目,并比较各样品的放线菌纯培养多样性情况,结果见图 8。由图 8可知,7个样品中来自丙中洛样点的4个样品普遍分离效果较好,尤其是BH样品分离所得菌株数目最多,达到119株,占34%;BB样品次之,分离到62株,占18%;而S-G、F-L、L样品则稍逊于丙中洛样点,分别分离到47株(13%)、56株(16%)、28株(8%)。

图 8 属水平上由不同样品所分离得到菌株数目 Figure 8 The number of the strains isolated from each sample on genus level

结合图 9表 5可知,BH样品的放线菌多样性最好,共分离得到17个属,其中4个属是其他样品中没有分离到的。BB、F-L、L样品多样性情况次之,这3个样品都分离得到10个属,L样品中有4个属在其他样品中没有被检测到。其余样品的多样性情况一般。链霉菌属(Streptomyces)在各样品中所占比例在30%-65%之间,为优势菌群。红球菌属(Rhodococcus)在BB、BT、BS、BH、F-L样品中所占比例也比较高,达到15%–20%。在BS、F-L、L样品中能够分离得到20%左右的微杆菌属(Microbacterium)。节杆菌属(Arthrobacter)在F-L、L样品中分别占22%和14%左右,在其他样品中未检测到较高的丰度。而其他放线菌属,如诺卡氏菌属(Nocardia)、原小单孢菌属(Promicromonospora)、纤维素菌属(Cellulomonas)及威廉姆萨菌属(Williamsia)等在各样品中的丰度较低,属于劣势菌群。

图 9 属水平上各样品分离放线菌的相对丰度图 Figure 9 Relative abundance of the isolated actinomycetes in different samples

表 5 各样品分离结果在属水平上的分布 Table 5 The isolated results of different sample on genus level
样品
Sample
所分离得到的属
Isolated genus
BB Streptomyces, Agromyces, Microbacterium, Nocardia, Rhodococcus, Nonomuraea, Agrococcus, Mycobacterium, Williamsia, Microterricola
BT Streptomyces, Agromyces, Microbacterium, Rhodococcus, Kitasatospora, Aeromicrobium, Arthrobacter, Cellulomonas
BS Streptomyces, Agromyces, Microbacterium, Rhodococcus, Williamsia, Aeromicrobium
BH Streptomyces, Agromyces, Microbacterium, Nocardia, Rhodococcus, Nonomuraea, Mycobacterium, Williamsia, Kitasatospora, Aeromicrobium, Arthrobacter, Cellulosimicrobium, Kribbella, Micromonospora, Brevibacterium, Paenarthrobacter
S-G Streptomyces, Agromyces, Microbacterium, Rhodococcus, Agrococcus, Arthrobacter, Cellulomonas, Promicromonospora, Terrabacter
F-L Streptomyces, Agromyces, Microbacterium, Rhodococcus, Agrococcus, Mycobacterium, Arthrobacter, Cellulomonas, Cellulosimicrobium, Gordonia
L Streptomyces, Agromyces, Microbacterium, Rhodococcus, Arthrobacter, Promicromonospora, Nocardioides, Saccharothrix, Pseudonocardia, Kineococcus

2.3.4 放线菌属水平上高通量测序与纯培养结果的比较

(1) 两种方法检测到属数目的总体比较

比较结果表明,通过纯培养得到的属有10个在高通量测序方法中没有被检测到,而高通量测序中有64个属没有在纯培养方法中分离到,两者都有的属达到16个。

(2) 两种方法在各样品中检测到的属数目的比较

图 10表 6可知,虽然高通量测序所得结果属水平上在各样品中都要高于纯培养分离所得属的数量,但大体上可以看出两种方法所得结果的差异。在纯培养结果中,BH样品的放线菌多样性属于多样性最好的一个样品,除丙中洛样点4个样品外的其他3个样品则表现一般。在高通量测序结果中,丙中洛的4个样品则在高通量结果中表现较差,而S-G、F-L、L这3个样品的放线菌多样性相对较好。总的来说,这两种方法所得结果在整体上所呈现出的趋势不一致。

图 10 两种方法在各样品中检测到的属数目的比较 Figure 10 The difference between cultured and uncultured results on genus level

表 6 高通量与纯培养结果在属水平上的比较 Table 6 Comparison between cultured and uncultured results on genus level
Culture-dependent Shared Culture-independent
Kineococcus
Cellulosimicrobium
Agrococcus
Cellulomonas
Micromonospora
Microterricola
Gordonia
Nonomuraea
Paenarthrobacter
Kitasatospora
Williamsia
Pseudonocardia
Kribbella
Promicromonospora
Aeromicrobium
Saccharothrix
Brevibacterium
Mycobacterium
Nocardioides
Agromyces
Terrabacter
Rhodococcus
Nocardia
Microbacterium
Streptomyces
Arthrobacter
Marmoricola, Amnibacterium, Hilus, Rhizocola, Oryzihumus, Dietzia, Iamia, Unidentified_Coriobacteriaceae, Frankia, Conexibacter; Actinocorallia, Sporichthya, CL500-29_marine_group, Catenulispora, Actinoallomurus, Microlunatus, Flaviflexus, Friedmanniella, Corynebacterium_1, Olsenella, Slackia, Brachybacterium, Leucobacter, Collinsella, Smaragdicoccus, Modestobacter, Actinospica, Solirubrobacter, Enterorhabdus, Lechevalieria, Bifidobacterium, Actinocatenispora, Crossiella, Dactylosporangium, Actinoplanes, Senegalimassilia, Candidatus_Planktophila, Aciditerrimonas, Glycomyces, Nakamurella, Angustibacter, Rubrobacter, Sanguibacter, Flexivirga, hgcI_clade, Luedemannella, Acidothermus, Actinomadura, Patulibacter, Illumatobacter, Metascardovia, Candidatus_Microthrix, Geodermatop, Actinophytocola, Gaiella, Sinomonaseuzebya, Jatrophihabitans, Phytomonospora, Amycolatopsis, Blastococcus, Unidentified_Gaiellales, Actinomycetospora, Unidentified_Acidimicrobiales, Coriobacteriaceae_UCG-003
3 讨论与结论

近些年来,微生物药物的开发和利用势头略显疲软,原因是发现新的有较好生物活性的微生物次生代谢产物需要耗费大量人力物力,而传统的链霉菌属已被反复研究。所以从一些相对新颖的样品来源中分离出未被研究且有高利用价值的放线菌菌株就显得尤为重要。土壤环境样品一直是放线菌资源的“宝库”,虽然它易于获得且被大量研究,但土壤环境在全球范围内分布广泛、形式多样、理化性质各异,还有很多未知的土壤环境样品没有被研究。本研究所选取的怒江大峡谷怒江州段气候多样、地貌独特、动植物多样性较高,且在土壤放线菌资源方面没有报道,应该予以重视。相比于曹艳茹等[27-28]、Kumar等[29]之前所做的类似工作,本研究优势在于所用土壤样品来源更加特殊,受人为影响程度更小;而且本研究所用方法更加全面,包括了免培养和纯培养两个方面的放线菌多样性,并结合土壤理化因子对结果进行了初步分析,本研究对于进一步丰富以及拓展此方面的研究有一定作用和借鉴意义。

通过高通量测序方法对怒江州段7个样品的放线菌免培养多样性进行研究。具体到放线菌门下,测序共检测到9个纲21个目53个科80个属。利用多种分析方法对不同样品中放线菌组成结构及其相似性进行了研究。BB、BT、BH 3个样品有相似的放线菌群落结构,BS、F-L、S-G的放线菌群落结构相似,而L样品则与其他样品相差较大。BS、F-L、S-G、L样品的放线菌丰度显著高于其余3个样品。结合各样品的土壤理化指标可以推论,在免培养方面,不仅仅是水分和有机质丰富的中性土壤样品中有大量的放线菌存在,沙质的偏碱性干燥土壤中同样可以检测到十分丰富的放线菌资源,甚至在一定程度上超过前者。

通过尝试不同的预处理方法、不同的抑制剂及其浓度以及多种培养基,得到了最适合怒江州段土壤样品的分离方法,并对样品中放线菌菌株进行分离、培养及鉴定。共获得351株放线菌,分布于放线菌纲下8个目14个科26个属。所用9种培养基中,YIM171的分离效果最好。通过比较不同样品的放线菌纯培养多样性,丙中洛混合样明显优于其他样品。通过对各个样品所分离放线菌菌株数目和属水平上分布情况的研究,结果表明丙中洛样点的各样品多样性普遍优于其余样点,尤其是丙中洛混合样,其放线菌纯培养多样性明显最好。结合土壤理化因子分析,可能是由于丙中洛样点(除了BS样品)相比于其余样点来说,有机质和水分比例较大,土质中性偏酸,较适合其中某一部分放线菌生存,如链霉菌属(Streptomyces)、红球菌属(Rhodococcus)、微杆菌属(Microbacterium)等,并且它们也较容易通过常规分离方法获得。当然,这些结果的获得也与培养基的选用有一定关系,分析可能此次选用的大多数培养基的成分有利于分离来自营养丰富的土壤环境的放线菌,导致了丙中洛样点的放线菌纯培养多样性明显好于其他样点。其中BH样品为混合土样,综合了丙中洛样点各样品的土壤特点,使放线菌群落更加丰富。而其余样点土样性质较干燥贫瘠,所用9种培养基的分离效果并不十分理想,推测这些培养基不适用于此种土壤理化性质的样品的放线菌分离。所以今后应进一步筛选培养基和设计放线菌分离方法来更加深入全面地探明此区域的土壤放线菌纯培养多样性情况。

本研究利用高通量测序分析和纯培养分离鉴定两种方法,对怒江峡谷怒江州段各土壤样品的放线菌多样性有了较为深入的了解。但初步比较结果发现,两种方法在样品间所呈现出的多样性情况有较大差别。高通量测序和纯培养分离方法属于截然不同的两种手段,他们都存在着一定的局限性和选择性。

Sun等[30]认为在16S rRNA基因中存在着基因内异质性,即16S rRNA基因的多样性,这种现象会导致在一定程度上对于样品中细菌多样性的高估;该文还指出,以16S rRNA基因的V1和V6区域设计引物会最大程度上高估多样性,从而使结果不准确;而使用V4-V5区域设计引物则会将这种偏差降到最小程度,可以得到较为令人信服的结果。结合本研究结果,高通量测序部分使用16S rRNA基因V3-V4区域设计引物,部分符合上述研究理论,即包含V4区域,在放线菌多样性结果方面还是相对稳定可信的。我们认为,导致结果中高通量测序与纯培养数据在样品之间显示出不一致性的主要原因在于高通量测序中采用分子生物学的方法提取土壤总DNA,而较贫瘠、土质为沙质的土壤样品由于土壤颗粒结构简单且之间的空隙较大,更利于各微生物类群的解离和遗传物质的释放,从而有利于其环境基因组DNA的提取。土壤有机质和水分含量丰富、土壤结构较为复杂的土样则相对处于劣势。在利用特异性引物对处理后的环境样品基因组16S rRNA基因的V3-V4区进行扩增过程中,由于扩增引物和扩增条件的选择、模板序列的不同特点造成扩增过程具有一定的偏好性,环境基因组中易于扩增的优势微生物会被大量扩增出来,相对来说抑制了其他不易扩增微生物的检出。

对于纯培养方法来说,由于实验工作量等实际问题,只能基于原先经验或是预实验基础来利用有限的培养基或分离方法进行实验,不可能对非常多的培养基或预处理方法组合进行实验,所以普通的平板分离方法更像是一种对放线菌的选择性分离方法。这就造成通过纯培养分离方法所展示出的多样性结果较好的样品必然是适合于所用的大部分培养基的,而所表现出的多样性情况较差的样品可能是由于不适合使用本实验中所用的培养基成分或预处理方法。这种同一样品在不同检测方法中结果不一致的现象是比较正常的,但为了更为全面地研究样品的放线菌多样性情况,在纯培养方面应该根据现有的结果尝试更多的分离方法和培养基成分,尤其是不能忽视营养贫瘠的沙质土,本研究充分表明了这种土壤中虽然水分和有机质含量较低,但同样蕴含着不容小觑的放线菌资源。在高通量测序方面,一方面是利用新的测序平台进行检测,另一方面由于测序过程交由公司完成,研究者们能做的是选择不同的环境基因组提取方法以适应于不同的样品状况,尽量全面地还原样品群落组成情况。

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