2018, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 杨宽, 毛如志, 赵悦, 何迟, 王慧玲, 曹建宏, 速伟, 何霞红
- YANG Kuan, MAO Ru-Zhi, ZHAO Yue, HE Chi, WANG Hui-Ling, CAO Jian-Hong, SU Wei, HE Xia-Hong
- 云南香格里拉葡萄酒产区酿酒相关酵母菌的生物多样性
- Biodiversity of wine-related yeasts isolated from Shangri-La wine-producing region of Yunnan
- 微生物学通报, 2018, 45(12): 2708-2721
- Microbiology China, 2018, 45(12): 2708-2721
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180065
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文章历史
- 收稿日期: 2018-01-09
- 接受日期: 2018-05-07
- 网络首发日期(www.cnki.net): 2018-06-06
2. 省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室 云南 昆明 650201;
3. 香格里拉酒业股份有限公司 云南 迪庆 674412;
4. 云南省玉溪市澄江县植保植检站 云南 玉溪 652500
2. State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resources in Yunnan, Kunming, Yunnan 650201, China;
3. Shangri-La Wine Limited by Share Ltd., Diqing, Yunnan 674412, China;
4. Plant Inspection Station of Chengjiang County, Yuxi, Yunnan 652500, China
香格里拉地区位于云南省西北部, 地处青藏高原横断山区腹地, 是滇、川、藏三省的交界处, 同时也处于云南三江并流世界自然遗产保护区内, 该保护区目前是我国面积最大的世界自然遗产地, 也是我国生物多样性最丰富的地区之一[1], 包含了丰富的地质地貌、生物物种和生态系统多样性[2]。香格里拉位于该保护区的中心位置, 区域内包含雪山、草甸、原始森林、高原湖泊、湿地和河谷等不同的自然景观[3], 同时还包含高山半寒冷半湿润、亚热带半湿润-半干旱和亚热带干旱等不同的气候, 因此造就了“一山分四季, 十里不同天”的立体气候特征[4]。香格里拉地区多样的地理气候环境, 蕴含着丰富的微生物资源, 有学者曾对香格里拉地区大型真菌资源进行了调查, 包括珍贵的野生菌松茸等[5], 李绍兰等[6]研究了香格里拉地区的白马雪山自然保护区中高山松林、杉林、高山杜鹃灌丛和草甸植被下野生酵母菌的多样性。子建文等[7]对云南香格里拉地区山脉土壤中微生物的数量分布进行了调查分析。
香格里拉葡萄酒产区的葡萄园主要建在金沙江和澜沧江流域海拔1 700-2 800 m的干热和干冷河谷地带, 是目前世界上海拔最高的酿酒葡萄产区之一。该地区光照充足, 有效积温高, 降雨量小, 紫外线强, 昼夜温差大, 非常有利于优质酿酒葡萄的种植[8]。酵母菌是酿造葡萄酒过程中很重要的一类微生物, 成熟的葡萄皮上则存在大量的野生酵母菌[9], 从葡萄园中分离野生酵母菌, 有望筛选到发酵性能优良、产香良好、具有本土特色的优质酿酒酵母菌株。Capece等[10]对意大利2个葡萄酒产区的酿酒酵母多样性进行了研究, 发现2个地区的酿酒酵母具有高度的多样性, 并且酵母的类群和产区地理特征有很大的关系。Schuller等[11]研究了不同葡萄酒产区以及不同葡萄品种相关酿酒酵母的种群结构和遗传多样性, 结果表明, 不同葡萄园中的酿酒酵母种群差异受多个因素影响, 不同葡萄品种上的酿酒酵母遗传差异更明显。Kántor等[12]对葡萄浆果上的细菌和酵母菌的数量进行了研究, 最后鉴定出10个属的酵母菌。Garofalo等[13]研究了一个本土葡萄品种“Nero di Troia”从果实到葡萄酒发酵过程中酵母种群的动态变化。
微卫星标记作为一种经典的分子标记方法, 自1989年Litt等[14]扩增到人类基因组SSR (Simple sequence repeats)序列以来, 其在动植物的遗传与进化[15-17]、遗传育种[18-19]、分子生态学[20]以及种质资源鉴定[21]等方面都得到了广泛的应用, 由于其高度的多态性、呈孟德尔共显性遗传、稳定性好等优点, 在微生物群体的遗传与分化研究中也得到了很好的应用。Pérez等[22]用RAPD (Random amplified polymorphic DNA)、CPAS (Cleaved amplified polymorphic sequence)和SSR 3种方法研究了酿酒酵母菌株的基因特性, 结果表明, SSR具有更高的多态性和更容易获得遗传图谱的特点。Gallego等[23]也比较了RAPD、AFLP (Amplified fragment length polymorphism)和SSR 3种方法对酿酒酵母菌株的分型效果, SSR同样优于其他方法。基于此, 国内外的一些研究者用SSR方法对葡萄园以及酿酒厂的酿酒酵母遗传多样性做了大量的研究[24-26], 本实验则选取11个微卫星多态性位点对香格里拉葡萄酒产区金沙江和澜沧江河谷两岸葡萄园中的野生酵母菌遗传多样性进行分析, 研究两个酵母群体的遗传差异性, 并与商业酿酒酵母作对比, 比较野生酵母和商业酵母之间的遗传差异。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株分离材料从香格里拉葡萄酒产区金沙江和澜沧江河谷流域选取5个5年以上的葡萄园采集成熟的赤霞珠葡萄样品, 其中采样点斯农(SN)、江坡(JP)和阿东(AD)属于澜沧江流域, 东水(DS)和东旺(DW)属于金沙江流域, 从成熟葡萄的果皮和自然发酵过程中分离野生酵母菌株。商业酵母UV43、F15和安琪酵母由香格里拉酒业股份有限公司提供。
1.1.2 培养基酵母分离培养基(YEPD, g/L):葡萄糖20.0, 酵母浸粉10.0, 蛋白胨20.0, 琼脂20.0, 为了防止细菌污染添加100 mg/L的氯霉素。酵母菌富集培养基是将YEPD中的琼脂去掉, 做成液体培养基。酵母菌鉴定培养基(WL营养琼脂培养基[27])(g/L):酵母浸粉4.0, 胰蛋白胨5.0, 葡萄糖50.0, 磷酸二氢钾0.55, 氯化钾0.425, 氯化钙0.125, 硫酸镁0.125, 氯化铁0.002 5, 硫酸锰0.002 5, 溴甲酚绿0.022, 琼脂20.0, pH 5.5。
以上培养基均在1×105 Pa灭菌30 min后使用。
1.1.3 引物PCR扩增酵母菌26S rDNA D1/D2区序列引物为NL1:5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′和NL4:5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′[28]。微卫星位点和相关引物见表 1。
| 位点 Locus |
重复类型 Repeat |
引物序列 Primers (5′→3′) |
荧光标记 Fluorochrome |
参考文献 References |
| C3 | CAA(13) | F: CTTTTTATTTACGAGCGGGCCAT R: AAATCTCATGCCTGTGAGGGGTAT |
FAM | [29] |
| C4 | TAA+TAG(i) | F: GAGAAAAATGCTGTTTATTCTGACC R: CCTCCGGGACGTGAAATAAC |
FAM | [29] |
| C5 | (GT)30 | F: TGACACAATAGCAATGGCCTTCA R: GCAAGCGACTAGAACAACAATCACA |
FAM | [29] |
| C6 | (CA) 13 | F: GTGGCATCATATCTGTCAATTTTATCAC R: CAATCAAGCAAAAGATCGGCCT |
FAM | [29] |
| C12/SCAAC1 | (CAA) 26 | F: TGCTGCAGCTGTTGTCTTGGTAGG R: CAAGCACAGGCGCAGGCACAAC |
HEX | [29] |
| C8 | (TAA)13 | F: CAGGTCGTTCTAACGTTGGTAAAATG R: GCTGTTGCTGTTGGTAGCATTACTGT |
HEX | [29] |
| YPL009C | (CTT)23 | F: CTGCTCAACTTGTGATGGGTTTTGG R: CCTCGTTACTATCGTCTTCATCTTGC |
HEX | [30] |
| C11 | (GT)20 | F: TTCCATCATAACCGTCTGGGATT R: TGCCTTTTTCTTAGATGGGCTTTC |
FAM | [30] |
| Sc-AAT3 | (AAT)23 | F: TGGGAGGAGGGAAATGGACAG R: TTCAGTTACCCGCACAATCTA |
FAM | [31] |
| SC8132X | (GAA)16 | F: CTGCTCAACTTGTGATGGGTTTTGG R: CCTCGTTACTATCGTCTTCATCTTGC |
HEX | [32] |
| YGL028C | (SerSerSerThr)9 | F: GGCAACACTCAAAGTCAGCA R: GCTGTTTCCTGTGTGGATGA |
FAM | [33] |
酵母菌基因组提取试剂盒、2×Taq PCR Mastermix、DNA Marker, 北京天根生化科技有限公司; 氯霉素, 生工生物工程(上海)股份有限公司; 蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、琼脂粉、磷酸二氢钾, 西陇化工股份有限公司。
生化培养箱, 上海恒一科学仪器有限公司; 全温震荡培养箱, 常州申光仪器有限公司; 超净工作台, 苏净安泰; 数显恒温水浴锅, 上海博讯实业有限公司医疗设备厂; 高压灭菌锅, 致微(厦门)仪器有限公司; 凝胶成像仪, Bio-Rad公司; PCR扩增仪, Eppendorf公司; 电泳仪, 北京六一仪器有限公司; 葡萄酒成分快速分析仪, 丹麦福斯有限公司。
1.2 方法 1.2.1 野生酵母菌株分离方法果皮上酵母菌的分离:称量约10 g的赤霞珠葡萄浆果, 放入盛有酵母菌富集培养基的三角瓶中, 28 ℃、120 r/min条件下培养24 h, 培养液稀释至10-2或10-3后取0.2 mL涂布于YEPD固体培养基上, 28 ℃培养2-3 d, 根据菌落颜色和形态的不同, 随机挑取10-15个菌落进行划线纯化, 经3次纯化后放入4 ℃下保存备用。
自然发酵过程中酵母菌的分离:将采集的成熟葡萄样品人工除梗破碎后放入10 L的玻璃罐中进行自然发酵, 用葡萄酒成分快速分析仪监测发酵过程, 分别在发酵的前、中、后期取发酵液0.1 mL, 加入0.9 mL无菌水中进行梯度稀释至10-5或10-6, 取0.1 mL稀释后的发酵液涂布于YEPD固体培养基, 28 ℃培养2-3 d。根据菌落的颜色和形态差异, 在每个发酵时期分别选取10-15个菌落进行划线纯化, 经3次纯化后放入4 ℃保存备用。
1.2.2 酵母菌的鉴定将分离纯化到的酵母菌用划线法接种到WL培养基上, 28 ℃培养5 d后根据菌落的颜色和形态初步鉴定酵母的种属[34], 并对形态相似的菌株进行归类。基于WL的培养结果, 在每种培养类型中选取1-2株进行26S rDNA D1/D2区序列分子鉴定。
1.2.3 酵母基因组DNA的提取和PCR扩增酵母菌基因组的提取使用酵母菌基因组提取试剂盒。PCR扩增26S rDNA D1/D2区序列, PCR反应体系:双链总DNA模板各2 μL, 上、下游引物(0.4 μmol/L)各2 μL, Master Mix 25 μL, ddH2O补足至50 μL。PCR反应条件:94 ℃ 5min; 94℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 30个循环; 72 ℃ 5 min, 4 ℃保存。PCR产物送至北京擎科生物技术有限公司进行测序, 然后将测序结果在NCBI进行BLAST搜索比对, 比较供试菌株与GenBank中相应菌株的相似性, 根据Kurtzman和Robnett[35]的酵母菌分类标准, 同种内不同菌株间D1/D2区序列差异不超过1%, 则它们应属于同一个种, 再结合前面的菌落形态分析, 初步确定酵母菌的种属。为了进一步确认供试菌株与酵母菌模式菌株的亲缘关系, 下载相关模式菌株的26S rDNA D1/D2区序列, 用MEGA 7.0构建系统发育树, 比较各菌株之间的亲缘关系。
1.2.4 酿酒酵母菌株间的微卫星分析对分离出的酿酒酵母进行遗传多样性分析, 主要分析金沙江和澜沧江两流域的酿酒酵母与商业酵母间的遗传差异。从相关文献中选出30对引物进行多态性检测, 选择11对多态性丰富的引物对样本进行处理。酿酒酵母的DNA提取同样采用试剂盒法。PCR反应体系(15 μL):2×Taq PCR Master Mix 7.5 μL, 正、反向引物(10 μmol/L)各1 μL, DNA模板1 μL, ddH2O 4.5 μL。PCR反应条件:94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 63 ℃ 30 s, 72 ℃ 20 s, 30个循环; 72 ℃ 10 min。用带荧光的接头引物和正向引物对一次扩增的产物进行二次扩增, 扩增产物会带上荧光标记。带有荧光标记的PCR产物进行稀释后与分子量内标混合, 用测序仪进行毛细管电泳, 用GeneMapper 4.1进行准确位点的数据分析, 获得扩增产物大小。然后用PopGene 32软件分析酵母群体的11个微卫星位点上的Shannon指数、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)以及金沙江和澜沧江两个酵母群体的遗传分化指数Fst、Nei’s遗传距离和遗传相似系数。用Cervus 3.0软件计算各微卫星位点的多态信息含量(PIC)。用Population 1.2.32软件以非加权算术平均数(Unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA)法构建相关酵母菌株的系统发育树。
2 结果与分析 2.1 野生酵母菌的WL培养基初步鉴定从香格里拉5个葡萄园中的葡萄皮上和自然发酵过程中共分离到230株酵母菌, 全部接种到WL培养基上, 培养5 d后根据菌落颜色和形态初步鉴定酵母菌的种属, 并对形态相似的菌株进行归类。Cavazza等[27]研究表明, 根据菌落的颜色和形态, WL培养基可以区分在葡萄酒自然发酵过程中出现的大多数典型的酵母菌。230株酵母菌的培养结果见表 2。
| 培养类型 Type |
菌落颜色及形态 Color and morphology of colonies |
菌株编号 Strains No. |
| Ⅰ | Medium green, edge cream, whole paniculate, surface: smooth, opaque, creamy | SN1-9, 13, 15; SN2-1, 2, 4, 7, 10; SN3-1-10; DS1-4, 6, 10, 11; DS2-1-3, 6, 8, 9; DS3-1-10; DW2-4, 6, 7, 10-15; DW3-1-10; DWP-8; AD1-13, 14; AD2-1, 3, 6, 9; AD3-1, 3, 5, 7, 8, 10-13, 15; ADP-4; JP1-7, 8, 10; JP2-1-4, 8, 10-15; JP3-1-10 |
| Ⅱ | Dark green, flat, surface: smooth, opaque, buttered | SN1-1, 3-5, 7, 8, 12, 14; SN2-3, 5, 6, 8, 9; SN3-5; SNP-3, 5, 6, 8, 9; AD1-1, 2, 4-12, 15; AD2-2, 4, 5, 7, 8, 10; AD3-2, 4, 6, 9, 14; ADP-1, 5, 7, 9, 10; DW1-8-10; DW2-9; DWP-1-3, 7; JP1-1-6, 9; JP2-5-7, 9; JPP-1-5, 7-10; DS1-1-3, 5, 8, 9, 12-15; DS2-4, 5, 7, 10; DSP-3-10 |
| Ⅲ | White with light green, flat colony, surface: smooth, opaque | SN1-10; DW2-1, 2, 5 |
| Ⅳ | Cream color, surface: smooth, spherical convex, opaque, creamy | SN1-6; ADP-3 |
| Ⅴ | White, surface: surface dry, villous | SN1-11 |
| Ⅵ | Milky white, spherical protruding, surface: smooth, opaque | SN1-2 |
| Ⅶ | White, spherical protruding, surface: smooth, opaque | SNP-1, 2, 4; JPP-6 |
| Ⅷ | White with light green, spherical bulge, surface: smooth, opaque, radiate edges | SNP-7, 10; DW1-4, DW2-3 |
| Ⅸ | Light green, spherical protruding, surface: smooth, buttered | SNP-9 |
| Ⅹ | Creamy and light green, the shape of a rounded roof, surface: smooth, creamy | DW1-1-3, 5-7; DW2-8 |
| Ⅺ | White, surface: wrinkled, rough, central volcanic | AD1-3 |
| Ⅻ | Cream color with red, surface: papillary protuberance, opaque | ADP-8 |
| XIII | Smooth, opaque, radiate edges, surface: smooth, sticky, buttered | ADP-2, 6 |
| XIV | Center green, edge transparent, spherical convex, surface: smooth, buttered | DS1-7 |
| XV | White, spherical convex, surface: rough, villous | DWP-6 |
| XVI | Light green, creamy, flat, surface: smooth, opaque | DWP-9, 10 |
| XVII | Light green, spherical protruding, surface: smooth, opaque | DWP-4, 5 |
| XVIII | White, central bulge, smooth: rough, radiate edges | DSP-1 |
| 注:P:从果皮上分离的菌株; 1、2、3分别代表自然发酵的前、中、后期. Note: P: Peel surfaces; 1, 2, 3 behind the letter represent the first, middle, and late stages of natural fermentation. |
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230株酵母菌被分为18个培养类型, 对照Cavazza等的描述以及前人的验证及补充[27, 34, 36], 根据菌落的颜色和形态, 初步可以鉴定Ⅰ类是酿酒酵母(S. cerevisiae), Ⅱ类是葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum), Ⅳ类是戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii), Ⅹ类是拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii), Ⅺ是克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri), Ⅻ类为美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima), XIII是一种红酵母(Rhodotorula), 其他11类酵母菌未见有相关描述, 但对其进行整理归类, 为下一步的分子鉴定提供参考。
2.2 酵母菌的26S rDNA D1/D2区序列分子鉴定根据WL培养基的初步归类, 在每个培养类型中随机选取1-2株酵母菌进行分子鉴定, 对菌株的26S rDNA D1/D2区序列进行测序, 在NCBI上进行BLAST比对, 比对结果见表 3, 根据Kurtzman等[35]的酵母菌分类标准, 同种内不同菌株间D1/D2区序列相似率大于99%一般可认为是同一个种, 结合WL培养基鉴定, 则可以鉴定出大部分的种。同时下载相关模式菌株序列与供试菌株一起建立系统发育树, 显示各菌株间及与模式菌株的亲缘关系。
| 菌株编号 Strain No. |
片段长度 Size (bp) |
相关模式菌株 Type strain |
相似性 Identity (%) |
GenBank登录号 GenBank accession No. |
| AD3-1 | 581 | Saccharomyces cerevisiae (KY109420) | 99 | MF769586 |
| SN1-9 | 587 | Saccharomyces cerevisiae (KY109420) | 99 | MF769605 |
| DW2-3 | 584 | Hanseniaspora uvarum (KY107853) | 99 | MF769587 |
| DS2-2 | 588 | Hanseniaspora uvarum (KY107853) | 99 | MF769604 |
| SN1-10 | 426 | Candida oleophia (KY106621) | 99 | MF769588 |
| ADP-3 | 585 | Torulaspora delbrueckii (KY109859) | 99 | MF769589 |
| SN1-11 | 535 | Hyphopichia burtonii (KY107885) | 99 | MF769590 |
| SN1-2 | 586 | Wickerhamomyces anomalus (KY110104) | 99 | MF769591 |
| SNP-1 | 581 | Debaryomyces hansenii (KY107560) | 99 | MF769592 |
| JPP-6 | 580 | Debaryomyces hansenii (KY107560) | 99 | MF769606 |
| SNP-7 | 579 | Meyerozyma guilliermondii (KY108546) | 99 | MF769593 |
| DW1-4 | 583 | Meyerozyma guilliermondii (KY108546) | 99 | MF769607 |
| SNP-9 | 591 | Cryptococcus heveanensis (KY108201) | 99 | MF769594 |
| DW1-3 | 607 | Zygosaccharomyces bailii (KY110236) | 99 | MF769595 |
| AD 1-3 | 578 | Pichia kluyveri (KD108826) | 99 | MF769596 |
| ADP-8 | 479 | Metschnikowia pulcherrima (JX188179) | 99 | MF769597 |
| ADP-2 | 581 | Rhodotorula glutinis (KY109044) | 99 | MF769598 |
| DS1-7 | 546 | Candida humilis (KY106507) | 99 | MF769599 |
| DWP-6 | 578 | Saccharomycopsis crataegensis (NG-055364) | 99 | MF769600 |
| DWP-9 | 570 | Candida californica (EF550230) | 99 | MF769601 |
| DWP-4 | 565 | Issatchenkia terricola (NG-055108) | 99 | MF769602 |
| DSP-1 | 569 | Pichia kudriavzevii (KY108855) | 99 | MF769603 |
根据表 3的序列比对结果, 供试菌株与模式菌株的相似性均为99%, 根据Kurtzman等的酵母菌分类标准, 22个测序菌株共鉴定为13属18个种, 其中AD3-1、SN1-9为酿酒酵母(S. cerevisiae), DW2-3、DS2-2为葡萄汁有孢汉生酵母(H. uvarum), SNP-7、DW1-4为季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii), SNP-1、JPP-6为汉逊氏德巴利酵母(Debaryomyces hansenii), SN1-10为Candida oleophia, SN1-11为Hyphopichia burtonii等, 结合WL培养基培养特征和聚类, 可以确定230株酵母菌的种属。下载18株相关模式菌株的26S rDNA D1/D2区序列和22株测序菌株用N-J法构建系统发育树, 结果如图 1所示, 被鉴定为同一个种的菌株和相关模式菌株聚在同一个分支上, 表明他们的亲缘关系较近, 而不同种菌株则处于不同的分支上。总体来看, 22个供试菌株分布在两个大的分支上, 分属于两个大的类群, 以酿酒酵母为代表的子囊菌类(Ascomycetous)及以红酵母属和隐球酵母属的担子菌类(Basidiomycetous), 其中AD3-1 (Pichia)、DWP-9 (Candida)的子囊菌和SNP-9 (Cryptococcus)、ADP-2 (Rhodotorula)的担子菌聚在一个大的分支上, 说明这几种酵母虽然分属于不同的门水平, 但相对于子囊菌类中的其他种, 他们具有更近的亲缘关系。根据WL培养聚类分析和分子生物学鉴定方法, 分离的230株最终被鉴定为13属18种, 这充分说明了香格里拉葡萄酒产区酵母菌种类的多样性。
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| 图 1 基于26S rDNA D1/D2区序列采用Neighbor-Joining法绘制的系统发育树 Figure 1 Phylogenetic tree constructed from Neighbor-Joining analysis based on the 26S rDNA D1/D2 domain sequences |
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随机选取20株金沙江葡萄园分离的酿酒酵母和27株澜沧江分离的酿酒酵母作为样本材料, 选取11个多态性好的微卫星位点(表 1)对它们进行遗传多样性分析, 经微卫星分析(表 4), 47株酿酒酵母在11个位点上共表现出24个基因型, 说明在所分离的某些菌株当中具有相同的基因型。每个微卫星位点均表现出较高的多态性, 多态信息含量可以反映微卫星标记的多态性水平, 度量群体内遗传变异的高低[37], 根据Botstein等[38]提出的PIC判断标准:当PIC < 0.25时, 该位点为低度多态; 当0.25 < PIC < 0.50时, 为中度多态; 当PIC > 0.50时, 为高度多态。本试验中的11个位点的PIC在0.474-0.794之间变化, 平均值为0.640, 其中在YGL028C位点为中度多态, 其他都为高度多态性位点。11个微卫星位点共检测出70个等位基因, 其中在C5位点上检测到10个等位基因, 表现出较高的等位基因多样性, Sc-AAT3位点仅检测出3个等位基因, 等位基因最少, 平均每个位点的等位基因数为6.364个。11个位点的观测杂合度(Ho)值在0.022-0.617之间, 平均值为0.166, 期望杂合度(He)介于0.507-0.828之间, 平均值为0.693, 杂合度是衡量酿酒酵母群体遗传变异情况的一个参数, 杂合度越高说明群体的遗传多样性越高, 整体来看, 香格里拉葡萄酒产区所选取的47株酿酒酵母在一定程度上处于中等遗传多样性水平。
| 微卫星位点 SSR locus |
等位基因数 Allele number |
多态信息含量 PIC |
观测杂合度 Ho |
期望杂合度 He |
| C11 | 7 | 0.644 | 0.106 | 0.698 |
| C5 | 10 | 0.728 | 0.149 | 0.767 |
| C6 | 5 | 0.660 | 0.064 | 0.714 |
| Sc-AAT3 | 3 | 0.574 | 0.022 | 0.656 |
| YGL028C | 6 | 0.474 | 0.152 | 0.507 |
| C3 | 5 | 0.633 | 0.133 | 0.684 |
| C4 | 5 | 0.614 | 0.106 | 0.681 |
| C8 | 9 | 0.794 | 0.617 | 0.828 |
| SC8132X | 6 | 0.686 | 0.152 | 0.734 |
| YPL009C | 6 | 0.685 | 0.130 | 0.732 |
| C12-SCAAC | 8 | 0.544 | 0.196 | 0.625 |
运用软件Popgene 32和Cervus 3.0计算金沙江和澜沧江流域酵母菌群体的香农指数(Shannon index)和多态信息含量(PIC)(表 5)。金沙江群体和澜沧江群体的平均Shannon指数分别是1.380和0.922, 11个位点的平均多态信息含量分别是0.659和0.456。Shannon指数是反映群体遗传多样性的一个重要参数, 结果显示金沙江酵母群体遗传多样性大于澜沧江群体。F-统计值Fst代表着群体的遗传分化程度, 根据Wright[39]的建议, 群体之间的Fst在0.05-0.15之间, 为中等程度的遗传分化; Fst在0.15-0.25之间, 群体间遗传分化较大; 当Fst为0.25以上时, 说明群体间存在很大的遗传差异[40]。金沙江酵母群体和澜沧江酵母群体的平均Fst为0.137, 说明2个群体之间存在中等程度的遗传分化。根据Nei[41]的方法计算了2个酵母群体之间的遗传距离(Genetic distance)和遗传相似性系数(Genetic identity), 结果表明2个酵母群体的遗传相似性系数为0.534 7, 遗传距离为0.626 0。遗传距离也是描述群体之间遗传变异程度的一个参数, 本研究中金沙江和澜沧江2个酵母群体的遗传距离为0.626 0, 与遗传分化指数Fst相吻合, 2个群体之间出现了中等程度的遗传分化。相反, 遗传相似系数用来表示2个群体之间亲缘关系的远近, 遗传相似性系数越接近1, 则表明它们之间的亲缘关系越接近, 本研究中的2个酵母群体的遗传相似性系数为0.534 7, 说明了2个酵母群体之间的亲缘关系处于中等水平, 同时也说明2个群体之间出现了一定的遗传分化。
| 微卫星位点 SSR locus |
澜沧江 Lancang River |
金沙江 Jinsha River |
|||
| 香农指数 Shannon’s index |
多态信息含量 PIC |
香农指数 Shannon’s index |
多态信息含量 PIC |
||
| C11 | 0.956 | 0.470 | 1.399 | 0.724 | |
| C5 | 1.097 | 0.519 | 1.729 | 0.716 | |
| C6 | 0.813 | 0.417 | 1.367 | 0.661 | |
| Sc-AAT3 | 0.844 | 0.435 | 1.077 | 0.535 | |
| YGL028C | 0.630 | 0.316 | 1.048 | 0.594 | |
| C3 | 0.874 | 0.422 | 1.334 | 0.611 | |
| C4 | 0.813 | 0.417 | 1.235 | 0.555 | |
| C8 | 1.541 | 0.718 | 1.835 | 0.789 | |
| SC8132X | 0.956 | 0.470 | 1.479 | 0.694 | |
| YPL009C | 0.956 | 0.470 | 1.473 | 0.735 | |
| C12-SCAAC | 0.659 | 0.358 | 1.203 | 0.630 | |
| Mean | 0.922 | 0.456 | 1.380 | 0.659 | |
以菌株间的Dice相似系数构建47株野生分离酵母和3株商业酵母的聚类图(图 2), 说明47株野生分离菌株和3株商业菌株的亲缘关系, 从聚类图中可以看出, 菌株AD2-1、AD2-3、AD2-6、AD2-9、AD3-11、ADP-4、SN3-1、SN2-2、DW3-3与来源于法国Laffort公司生产的F15酿酒酵母聚在一个分支, 具有相同的基因型; SN3-10和商业酵母UV43聚在一个分支, 亲缘关系较近; DS1-4和国产本土酿酒酵母安琪酵母聚在同一个分支, 基因型相似, 其中商业酵母F15和UV43是香格里拉酿酒厂的常用酵母, 安琪酵母则不常用, 但都能在葡萄园中找到与三者基因型相似的菌株, 这些菌株可能是由葡萄的货运运输带到了葡萄园中。值得提出的是, 金沙江酵母群体和澜沧江酵母群体在聚类图上并没有明显的界线, 并且2个群体中某些酵母菌株具有相同的基因型, 前文提到2个酵母群体具有一定的遗传分化, 但考虑到人为因素, 每年的葡萄集中采摘和货运运输可能会引起两地酵母群体的交流。另外, 同一个葡萄园中分离的菌株更容易聚在一起, 而不同葡萄园中的酵母菌株则分布在不同的分支上, 考虑到金沙江和澜沧江两岸葡萄园地形和海拔差异较大, 小气候丰富, 可能会造成不同葡萄园中酵母群体的差异。
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| 图 2 以UPGMA法构建的50株酿酒酵母菌株的亲缘关系聚类图 Figure 2 Dendrogram showing genetic relationship among 50 yeast strains built by UPGMA method |
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本研究从香格里拉葡萄酒产区成熟浆果上共分离到230株野生酵母, 经WL培养基培养和26S rDNA D1/D2区序列分子鉴定, 230株酵母菌共分为13属18种, 其中分离到酿酒酵母(S. cerevisiae) 98株, 占比42.60%, 主要分离于自然发酵的中后期, 葡萄汁有孢汉生酵母(H. uvarum) 97株, 占比42.17%, 主要分离于果皮上以及发酵前期, 从分离结果来看, 这2种酵母菌为所分离酵母群体中的优势种。商敬敏等[42]对香格里拉葡萄酒产区德钦地区葡萄园土壤中酵母菌多样性进行了研究, 共分离到8属8种; 史涛涛[43]研究了德钦冰葡萄自然发酵过程中酵母菌的动态变化, 共分离到12种酵母菌。相对于前人的研究, 本试验首次分离到的酵母菌有10种, 分别是T. delbrueckii、H. burtonii、W. anomalus、M. guilliermondii、C. heveanensis、Z. parabaili、C. humilis、S. crataegensis、C. californica、P. kudriavzevii。香格里拉葡萄园主要位于金沙江和澜沧江两岸的干热和干冷河谷中, 地形复杂, 海拔差异大, 气候多样, 微生物资源丰富, 前人的研究和本试验的结果也充分证明了香格里拉具有丰富的酵母资源多样性。
酿酒酵母的品种和用途有很多, 有专业酿造红酒、啤酒、白酒的以及专业生产面包的, 不同用途反映酵母菌株的内在遗传差异, 铁春燕等[37]利用微卫星分子标记的方法研究了不同工业酿酒酵母的种内遗传差异, 结果表明, 不同用途的酿酒酵母菌株具有不同的基因型。在葡萄园中, 酿酒酵母不同菌株间的遗传差异受葡萄酒产区气候条件、地理位置、海拔高度以及葡萄园面积等因素的影响[44]。裴颖芳[45]研究了新疆和宁夏葡萄酒产区葡萄自然发酵过程中酿酒酵母菌株的遗传多样性, 运用Interdelta指纹图谱和COX1基因指纹图谱的方法, 从新疆地区分离到的59个酵母菌株被区分为23个基因型, 宁夏地区分离到290株酿酒酵母可区分为33种基因型, 而且2个产区的酿酒酵母菌株具有明显的遗传差异性。Schuller等[46]研究了葡萄牙西北部葡萄酒产区酵母群体的多样性, 在3个葡萄园中对葡萄样品进行连续3年的采样, 共分离到1 620株酿酒酵母, 用mtDNA RFLP的方法进行分析, 得到了297种图谱, 说明该产区内也具有丰富的酿酒酵母遗传多样性。香格里拉葡萄酒产区的葡萄园主要位于金沙江和澜沧江两岸的河谷地带, 虽然同位于香格里拉市境内, 但两流域间的气候特征和土壤类型都有明显的差异。用SSR分子标记的方法对香格里拉分离到的47株酿酒酵母进行遗传多样性分析, 其中金沙江流域20株, 澜沧江流域27株, 47株酿酒酵母被分为24种基因型, 11个微卫星位点共检测到70个等位基因, 平均多态信息含量为0.640, 表现出一定的遗传多样性, 其中两个流域的酵母群体的平均遗传分化指数Fst为0.137, 遗传相似性系数为0.534 7, 遗传距离为0.626 0, 说明2个酵母群体之间出现了中等程度的遗传分化。以UPGMA法构建47株分离菌株和3株商业酵母的聚类图, 发现一些葡萄园中分离的酵母和商业酵母菌株具有相同的基因型, 推测应该是酒厂商业酵母通过人为因素或者葡萄货运运输进入到葡萄园, 然后定殖, 与野生酵母形成共生状态。
对香格里拉葡萄酒产区野生酵母进行收集整理, 有望从中筛选到发酵性能优良, 可以酿造具有本土特色的优质葡萄酒的酵母资源。李双石等[47]以河北产区赤霞珠自然发酵过程中分离的本土酵母菌株Y14和进口商业活性干酵母F15的发酵性能进行了对比研究, 结果显示, 本土优选酿酒酵母菌株Y14发酵酒产生香气物质种类较多。蒋文鸿等[48]从昌黎赤霞珠葡萄上分离到4株酿酒酵母, 从中筛选出2株耐受性好的酵母与2种商业酵母做对比发酵实验, 结果表明本土野生酵母a较市售的发酵葡萄酒感官评价高。Liu等[49]首先对新疆鄯善地区的酵母菌多样性进行了研究, 从中筛选到8株酿酒酵母, 对其进行发酵香气分析和感官品评, 并与商业酵母F15作对比, 结果表明有7株本土酵母比F15产生更多的酯类物质, 本土酵母菌株LFE1225的感官评价最高。Šuranská等[50]从南摩拉维亚葡萄酒产区长相思、黑皮诺葡萄浆果上和自然发酵的葡萄汁中分离出酿酒酵母, 并运用基因分型技术将不同的菌株进行区分, 最后选出一些有代表性的菌株和商业酵母BS6进行发酵性能比较, 结果他们更喜欢利用本土酿酒酵母去酿酒, 因为本土酿酒酵母可以加强产区特色。Senses-Ergul等[51]在葡萄自然发酵过程中分离到20株酿酒酵母, 对这些酵母菌的耐受性和发酵特性进行了研究, 最终筛选到4株各项性能比较优良的酵母菌株, 利用这些酵母菌有望能够生产具有产地特征香气的葡萄酒。从香格里拉葡萄酒产区分离的这些酵母菌的发酵性能和香气分析有待进一步的研究, 以期利用这些酵母菌可以生产出具有显著产区特色的葡萄酒。
香格里拉是一个新兴的、具有高原特色的葡萄酒产区, 该地区的气候、地理多样性非常丰富, 蕴藏着丰富的微生物资源。香格里拉金沙江和澜沧江两岸的葡萄园中, 吸引和聚集了大量的葡萄酒相关酵母, 本研究在5个葡萄园中共分离到230株18种酵母菌, 发掘这些酵母资源对于酵母菌多样性的保护和利用奠定了基础。另外, 酿酒酵母作为葡萄酒发酵过程当中最重要的一类微生物, 本土酿酒酵母更能够凸显产地葡萄酒的质量和风格特色, 所以对香格里拉葡萄酒产区酿酒酵母的遗传多样性进行研究, 可为将来优良菌株的选育提供理论基础。
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