2018, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 李志乾, 胡颖嵩, 张常建, 刘彦希, 韩雪琳, 韩黎
- LI Zhi-Qian, HU Ying-Song, ZHANG Chang-Jian, LIU Yan-Xi, HAN Xue-Lin, HAN Li
- 在大肠杆菌中高效表达可用于检测人源Rap1活性RapBD蛋白方法的建立
- Expression of RapBD in Escherichia coli for detecting human Rap1 activity
- 微生物学通报, 2018, 45(11): 2488-2493
- Microbiology China, 2018, 45(11): 2488-2493
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180191
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文章历史
- 收稿日期: 2018-03-13
- 接受日期: 2018-05-03
- 网络首发日期(www.cnki.net): 2018-06-04
2. 中国人民解放军疾病预防控制所医院感染监控中心 北京 100071
2. Department of Hospital Infection Control and Research, Institute of Disease Control and Prevention of Chinese People's Liberation Army, Beijing 100071, China
Rap是一种小GTP酶，属于Ras超家族。Rap分为2个亚类：Rap1和Rap2，具有Rap1A、Rap1B、Rap2A、Rap2B和Rap2C 5个家族成员[1]。其中，Rap1被研究最多，它通过各种信号通路参与不同的细胞活动，包括细胞的粘附和增殖以及基因的激活[2]。Rap1不仅可以调控整联蛋白，也可以调控细胞骨架[3]。作为小GTP酶，Rap1通过活性变化来调控这些过程。当Rap1以GDP结合的形式存在时是没有活性的，而以GTP结合的形式存在时是有活性的。GTP酶激活蛋白(GAPs)和鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)参与调控小GTP酶Rap1的活性，GAPs促进GTP酶以GDP结合形式存在，而GEFs促进其以GTP结合形式存在[4]。Rap1在细胞中起着分子开关的作用，对于高效的信号转导过程至关重要[5]。鉴于此，Rap1活性的检测显得尤为重要。目前常用的检测Rap1活性的成熟方法是RapBD pulldown实验，其原理是利用Rap1下游效应蛋白RalGDS的RapBD结构域能特异性结合GTP-Rap1[6]。市面上现有的Rap1活性检测试剂盒，如Abcam公司的Rap1 Activation Assay Kit，Cell Signaling Technology公司的Active Rap1 Detection Kit #8818，以及Thermo Fisher Scientific公司的Active Rap1 Pull-Down and Detection Kit也都是利用RapBD pulldown的原理[7-10]，它们提供可以直接利用的结合有RapBD的琼脂糖珠子。试剂盒虽然使用方便，但是价格昂贵且生产厂家少。本文将人RalGDS蛋白的RapBD结构域的基因序列优化后构建在pGEX-4T-1质粒载体上，使融合蛋白GST-RapBD在大肠杆菌中大量表达后，固化在谷胱甘肽亲和树脂上[11]，再利用融合蛋白Pulldown GTP-Rap1，满足了实验室大批量检测Rap1活性的需求。
1 材料与方法 1.1 细胞和质粒人肺泡上皮细胞A549、人支气管上皮细胞BEAS-2B、pGEX-4T-1质粒为本实验室保存；大肠杆菌BL21感受态细胞购于北京全式金生物技术有限公司。
1.2 培养基、主要试剂和仪器LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化钠10.0，琼脂15.0−20.0，pH 7.2。
细胞裂解液：25 mmol/L Tris (pH 7.2)，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，5% Glycerol，1% NP-40。
RPMI medium 1640 basic、Fetal bovine serum购于Gibco公司；谷胱甘肽亲和树脂珠子、异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)购于Promega公司；Rap1抗体购于Cell Signaling Technology公司。
台式高速冷冻离心机，Eppendorf公司；恒温振荡培养箱，天津市欧诺仪器仪表有限公司；脱色摇床，北京六一生物科技有限公司；DNA混合仪，宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 方法 1.3.1 构建表达GST-RapBD的载体提交需要合成的人源RalGDS的RapBD氨基酸序列和载体pGEX-4T-1，酶切位点为BamHⅠ和XhoⅠ，华大基因公司合成序列并利用pGEX-4T-1载体构建能表达GST-RapBD的重组质粒，并将重组质粒导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中得到亚克隆。
1.3.2 原核表达融合蛋白GST-RapBD将转化的感受态细胞涂布到含有100 mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基上，37 ℃培养过夜。随机挑取单菌落接种至含有100 mg/L氨苄青霉素的100 mL LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养至OD600为0.5左右，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，16 ℃诱导20 h，对照不加IPTG诱导。将菌液转移至50 mL离心管中，3 600 r/min离心30 min，将得到的菌体沉淀加入PBS缓冲液，在冰水混合物上静置，利用超声破碎仪破碎菌体，每次超声2 s，间歇2 s，共10 min。随后将裂解液转移至1.5 mL离心管，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清与600 μL经过预平衡的GST beads在4 ℃进行孵育1 h后，3 600 r/min离心1 min收集Beads，加入预冷的PBS缓冲液冲洗3次，4 ℃保存。
1.3.3 GST-RapBD pulldown实验用100 mm培养皿培养A549或BEAS-2B细胞，约1×107个细胞/皿。弃去细胞培养基，用PBS缓冲液冲洗3遍后，每皿加入1 mL含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液冰上裂解细胞20 min后收集细胞。4 ℃、14 000 r/min离心15 min，取上清，将上清平均分为2份，一份加入30 μL空载的GST-beads，另一份加入30 μL与细菌裂解液孵育的GST-RapBD beads，在4 ℃进行孵育1 h后，3 600 r/min离心1 min收集Beads。然后加入预冷的500 μL细胞裂解液洗涤Beads，重复3次后加入30 μL 2×Loading buffer，100 ℃金属浴10 min。蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，检测GTP-Rap1。
2 结果与分析 2.1 RapBD的氨基酸序列及其原核表达系统中优化后的核苷酸序列查询NCBI得到人源RapBD的氨基酸序列如图 1所示，共127个氨基酸；原核表达系统中优化后的核苷酸序列见图 2。核苷酸序列两侧的酶切位点为BamHⅠ和XhoⅠ。DNA测序结果表明RapBD序列已正确插入载体，GST-RapBD重组质粒构建成功，质粒图谱见图 3。
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| 图 1 人源RapBD的氨基酸序列 Figure 1 The amino acid sequence of human RapBD |
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| 图 2 原核表达系统中优化后的核苷酸序列 Figure 2 Nucleotide sequence optimized in prokaryotic expression system |
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| 图 3 插入RapBD的pGEX-4T-1质粒图谱 Figure 3 Plasmid profile of inserted RapBD fragment |
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如图 4所示，蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离后，考马斯亮蓝染色结果显示在分子量40 kD可见融合蛋白条带。融合蛋白GST-RapBD在16 ℃、IPTG诱导条件下培养20 h后可在大肠杆菌中大量表达，见第2泳道，而且用GST beads纯化后在相同位置可见融合蛋白条带，见第5、6泳道。蛋白大小符合预期。
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| 图 4 GST-RapBD融合蛋白表达和纯化及其与A549细胞裂解物的结合电泳图 Figure 4 The electropherogram of expression and purification of GST-RapBD fusion protein and its combination with A549 cell lysates 注：M：预染蛋白Marker；1：未经IPTG诱导大肠杆菌，菌体超声破碎后的裂解物；2：IPTG诱导后的大肠杆菌裂解物；3：空的GST beads；4：A549细胞裂解物孵育空的GST beads；5：IPTG诱导后的大肠杆菌裂解物处理后的GST beads；6：A549细胞裂解物孵育IPTG诱导后的大肠杆菌裂解物处理后的GST beads. Note: M: Pre-stained protein marker; 1: Lysates of E. coli without IPTG induction; 2: Lysates of E. coli induced by IPTG; 3: Empty GST beads; 4: Empty GST beads incubated with lysates of A549 cells; 5: GST beads treated with IPTG-induced E. coli lysates; 6: GST beads treated with IPTG-induced E. coli lysates and then incubated with lysates of A549 cells. |
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除了A549细胞，在BEAS-2B细胞中进行验证的考马斯亮蓝染色结果见图 5。
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| 图 5 GST-RapBD融合蛋白表达和纯化及其与BEAS-2B细胞裂解物的结合电泳图 Figure 5 The electropherogram of expression and purification of GST-RapBD fusion protein and its combination with BEAS-2B cell lysates 注：M：预染蛋白Marker；1：IPTG诱导后的大肠杆菌裂解物；2：空的GST beads；3：BEAS-2B细胞裂解物孵育空的GST beads；4：IPTG诱导后的大肠杆菌裂解物处理后的GST beads；5：BEAS-2B细胞裂解物孵育IPTG诱导后的大肠杆菌裂解物处理后的GST beads. Note: M: Pre-stained protein marker; 1: Lysates of E. coli induced by IPTG; 2: Empty GST beads; 3: Empty GST beads incubated with lysates of BEAS-2B cells; 4: GST beads treated with IPTG-induced E. coli lysates; 5: GST beads treated with IPTG-induced E. coli lysates and then incubated with lysates of BEAS-2B cells. |
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采用GST pulldown实验检测GST-RapBD融合蛋白能否特异性结合GTP-Rap1。图 6结果显示，第1泳道中A549细胞总蛋白中有Rap1的表达，第2泳道中空的GST beads不能结合GTP-Rap1，而第5泳道中构建的重组质粒表达出来的GST-RapBD融合蛋白能够特异性结合GTP-Rap1。
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| 图 6 GST-RapBD融合蛋白与A549细胞中GTP-Rap1的特异性结合 Figure 6 The binding of GST-RapBD fusion protein and GTP-Rap1 in A549 cells 注：1：A549细胞总蛋白；2：空的GST beads；3：A549细胞裂解物孵育空的GST beads；4：IPTG诱导后的大肠杆菌，菌体超声破碎后的裂解物处理后的GST beads；5：A549细胞裂解物孵育IPTG诱导后的大肠杆菌裂解物处理后的GST beads. Note: 1: Total protein of A549 cells; 2: Empty GST beads; 3: Empty GST beads incubated with lysates of A549 cells; 4: GST beads treated with IPTG-induced E. coli lysates; 5: GST beads treated with IPTG-induced E. coli lysates and then incubated with Lysates of A549 cells. |
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同样地，构建的重组质粒表达出来的GST-RapBD融合蛋白能够特异性结合BEAS-2B细胞中的GTP-Rap1，如图 7所示。
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| 图 7 GST-RapBD融合蛋白与BEAS-2B细胞中GTP-Rap1的特异性结合 Figure 7 The binding of GST-RapBD fusion protein and GTP-Rap1 in BEAS-2B cells 注：1：BEAS-2B细胞总蛋白；2：BEAS-2B细胞裂解物孵育IPTG诱导后的大肠杆菌裂解物处理后的GST beads. Note: 1: Total protein of BEAS-2B cells; 2: GST beads treated with IPTG-induced E. coli lysates and then incubated with lysates of BEAS-2B cells. |
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近年来，大量研究表明Rap可以调节细胞粘附和吞噬。在宿主与微生物相互作用的过程中，Rap1不仅可以调控补体受体3介导的吞噬[12]，还可以介导Fcγ受体依赖的吞噬[13]。在乙型肝炎病毒的研究中，Rap调控肝部炎症，影响肝硬化和肝癌的发生[14]。此外，Rap也参与人类癌细胞的侵袭和转移，与许多恶性肿瘤的研究密切相关[15-16]。Rap作为小GTP酶，其活性受到RapGEFs和RapGAPs的调控。RapGEFs导致GDP解离，促使GTP与Rap结合，进而激活Rap；而RapGAPs加快Rap上GTP的水解，促进Rap失活[4]。已知的RapGEFs主要有4类，分别是C3G (CrkSH3-domain binding guanine-nucleotide releasing factor)、CD-GEFs (CalDAG-GEF)、PDZ-GEFs和Epacs (Exchange protein directly activated by cAMP)；已知的RapGAPs主要包括RapGAPs和SPAR (Spine-associated RapGAP)两类[17]。小GTP酶Rap1的活性变化对于RapGEFs和RapGAPs以及其他上下游蛋白的研究非常重要，这就使得Rap1的活性检测成为了这些研究的关键。
我们研究了在烟曲霉和肺上皮细胞相互作用过程中第二信使cAMP的效应蛋白Epac发挥的功能。Epac是环腺苷酸鸟嘌呤交换因子，可以激活下游小G蛋白酶Rap1和Rap2[18-19]。Epac的活性检测是技术难题，目前主要是通过检测Rap的活性来间接反映。我们构建了能表达人RapBD的重组质粒，操作简单、成本低廉，使Rap1的活性检测不再依赖试剂盒，可以更加方便、经济地检测Rap1活性，为Rap1蛋白功能和作用机制及其相关信号通路的研究提供了便利。
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