天然产物是药物开发的重要资源^[1-2]。到目前为止，人们已从自然界中鉴定了二十多万个天然产物^[3]。目前天然药物开发面临的最大问题是重复分离鉴定已知的化合物，所以在粗提物分离前期对其成分进行分析鉴别，排除已知化合物，有目标的挖掘新化合物可以极大节约资源和时间，提高发现新化合物的几率，这种方法叫做“排重(Dereplication)”^[4]。目前，排重的方法主要有基因组挖掘技术及色谱数据比对技术等。基因组挖掘技术是利用生物信息学的方法分析基因组序列，鉴定基因簇，预测化合物的种类以促进新化合物的发现^[5]。例如Scherlach和Hertweck等通过预测Aspergillus nidulans基因组序列中未知基因编码的产物，发现了Aspoquinolones A–D新型次级代谢产物，其具有很高的抗白血病作用^[6]。色谱数据比对技术是将化合物的色谱数据建成数据库，以此来筛选未知的化合物，包括紫外吸收图谱(UV)、高分辨质谱(HRMS)、二级质谱(MS/MS)、保留时间(Retention time)、核磁共振光谱(NMR)等^[7-9]。例如通过比对质谱数据筛选多肽类化合物^[10]和利用LC-DAD-TOFMS可以快速地对微生物天然产物进行排重^[11]。

本文研究菌株海洋链霉菌Streptomyces sp. B9173是从南美智利的太平洋沿岸沉积物中分离得到的。从该菌的发酵液里已经分离鉴定了抗白血病的生物碱类Maremycin A–F^[12-13]及抗肿瘤物质色霉素A₃^[14]，说明该菌代谢产物丰富且活性多样。我们利用HPLC-DAD和LC-MS结合的方法，排除已知化合物，筛选并成功分离鉴定了3个化合物：色胺酮(1)、甲基异靛蓝(2)、N, N-二甲基异靛蓝(3) (图 1)。其中色胺酮具有非常广泛的生物活性，是首次在细菌中被分离得到。甲基异靛蓝是临床治疗慢性粒细胞白血病的小分子药物，是首次在微生物中被分离得到。

图 1　3个化合物的化学结构 Figure 1　The chemical structure of three compounds 注：1：色胺酮；2：甲基异靛蓝；3：N, N-二甲基异靛蓝. Note: 1: Tryptanthrin; 2: Meisoindigo; 3: N, N-dimethylisoindigo.

图选项

Streptomyces sp. B9173是德国HKI研究所馈赠的海洋链霉菌菌株。

种子培养基(g/L)：Oxide TSB 30.0。产孢培养基(g/L)：甘露醇20.0，黄豆饼粉20.0，琼脂20.0。发酵培养基(g/L)：甘露醇20.0，黄豆饼粉20.0。

甲醇、乙酸乙酯、石油醚、氯仿、DMSO等有机试剂，上海国药集团；色谱纯乙腈(Acetonitrile，ACN)，Sigma-Aldrich公司；氘代氯仿(CD₃Cl-d₄)，Cambridge Isotope Laboratory公司；正相柱层析硅胶，青岛海洋化工有限公司；C₁₈反相柱层析硅胶，YMC公司；凝胶色谱填料，GE医疗集团。摇床，New Brunswick Scientific公司；旋转蒸发仪，BUCHI公司；冷却循环泵，上海东玺制冷仪器设备有限公司；真空泵，VACUUBRAND公司；冷冻干燥机，LABCONCO公司；自动样品收集器，上海青浦沪西仪器厂；高效液相色谱仪(Agilent 1260 infinity HPLC)，Agilent公司；超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪，Waters公司；600 MHz核磁共振波谱仪，Bruker公司。

将菌种划线接种于产孢固体平板培养基，30 ℃恒温培养5 d至长出一层浓密的灰色孢子。滴加1 mL 20%的甘油-无菌水溶液至平板上，使用棉签轻轻地洗下孢子，用移液器将液体转移到菌种管中，−20 ℃保存；取10 μL孢子接种于含有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、220 r/min振荡培养20 h，至菌液呈浓密粘稠状；取种子液，按8%接种量接种于装有500 mL发酵培养基的2 L三角瓶中，30 ℃、220 r/min振荡培养7 d。重复以上发酵步骤，共收集发酵液150 L。

将发酵液6 000 r/min离心10 min。取上清液进行分批萃取，每批用1.5倍发酵液体积的乙酸乙酯进行常温振荡萃取，振荡3 min，静置分层，分离水相和乙酸乙酯相。将水相再重复使用1.5倍的乙酸乙酯萃取2次。将萃取后的乙酸乙酯相30 ℃减压蒸馏浓缩，蒸除乙酸乙酯并回收再利用，共获得30.5 g黑色油状发酵粗提物。

取少量样品使用HPLC分析，DAD检测器全波长扫描，并选取210、254和400 nm作为检测波长。HPLC以H₂O-ACN作为流动相。分析柱为XDB-C₁₈柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，Agilent)，流速为0.4 mL/min。洗脱条件为梯度洗脱，乙腈的起始浓度为10%，0−12 min乙腈浓度由10%逐渐增加到60%；12−35 min，乙腈浓度由60%逐渐增加到95%；35−36 min，乙腈浓度由95%逐渐增加到100%；36−40 min，乙腈浓度持续为100%；40−41 min，乙腈浓度由100%逐渐降低到10%；41−46 min，乙腈浓度持续为10%，本研究中的HPLC检测方法均保持一致。

首先使用正相硅胶柱进行初步分离。取约450 g 200−300目的硅胶悬浮于石油醚中，然后装于直径约10 cm的柱中，沉降完全后待用。粗提物用甲醇溶解然后用约90 g 100−200目硅胶进行拌样，采用干法上样。然后用洗脱体系(石油醚→石油醚:乙酸乙酯=5:1→石油醚:乙酸乙酯=1:1→乙酸乙酯→乙酸乙酯:甲醇=1:1→甲醇)逐级洗脱，洗脱体积都为5个柱体积，流速约10 mL/min。用250 mL三角瓶收集洗脱液，每瓶收集样品约200 mL。每瓶取样品20 μL，使用HPLC检测，根据各组分的成分，将含有相近化合物的样品合并为FR1–FR10共10个组分，通过减压蒸馏去除有机溶剂，得到棕黑色固体残渣。

使用长35 cm，直径2.5 cm的C₁₈反相硅胶柱对各组分进行细分，采用干法上样，用甲醇和水的混合液作为流动相进行梯度洗脱，甲醇的浓度依次为35%→50%→75%→100%，每个体系洗脱5个柱体积。用试管结合自动收集器收集洗脱液，每管收集10 mL。HPLC检测后，选取含有不同代谢物的样品使用LC-MS分析。以上10个组分都按照上述步骤进行分离和检测。在组分FR5中确定3个目标化合物，将含有目标化合物的组分合并为FR5-4。

然后使用柱长200 cm，直径2.5 cm的Sephadex LH-20进行纯化，甲醇作为洗脱剂，洗脱体积为3个柱体积。收集洗脱液，每管收集5 mL。HPLC检测后，将含有目标化合物的组分合并为FR5-4-3。

对FR5-4-3使用上述相同的反相硅胶层析柱，洗脱液甲醇的浓度依次为60%、70%、80%、90%、100%，每个梯度洗脱5个柱体积。收集洗脱液，每管收集5 mL。HPLC检测后，合并含有相近化合物的组分，得到组分FR5-4-3-1、FR5-4-3-2、FR5-4-3-3、FR5-4-3-4。

对组分FR5-4-3-2使用长35 cm，直径1.5 cm的C₁₈反相硅胶柱进一步分离，洗脱液甲醇的浓度梯度缩小为60%、65%、70%、75%、80%、100%，每个梯度洗脱3个柱体积。收集洗脱液，每管收集3 mL，HPLC检测后，将洗脱液进一步分为2个组分。第二个组分中主要为化合物1，重复组分FR5-4-3-2的分离步骤，最终得到纯的目标化合物1。

对组分FR5-4-3-3同样使用长35 cm，直径1.5 cm的C₁₈反相硅胶层析柱进行分离，洗脱液甲醇的浓度依次为75%、80%、85%、90%、100%，每个梯度洗脱3个柱体积，收集洗脱液，每管收集3 mL。HPLC检测后合并为2个组分。对组分2重复上述分离步骤，最终得到纯的目标化合物2。

对组分FR5-4-3-4使用上述相同的层析柱进行再次分离，洗脱液甲醇的浓度依次为85%、90%、95%、100%，每个梯度洗脱3个柱体积。收集洗脱液，每管收集3 mL。HPLC检测后，排除含有杂质的组分，得到纯的目标化合物3。

取少量纯化后的样品，溶解于甲醇中，使用HRMS检测，获得样品的高分辨质谱；将剩余样品全部溶解于0.5 mL氘代氯仿中，以四甲基硅烷(TMS)作为内标，进行核磁共振光谱(NMR)分析。检测结束后，样品回收，减压蒸馏去除溶剂，将干燥的样品置于−20 ℃保存。

当使用HPLC-DAD对FR5的组分进行分析时，在石油醚-乙酸乙酯(5:1)洗脱部分发现3个HPLC峰(图 2A)，呈现出特殊的紫外吸收光谱(图 2B)。当使用反相层析柱对该组分进行细分时，纯甲醇洗脱部分(定为FR5-4)富集了这3个代谢物(图 2A)，该紫外吸收光谱暗示这3个代谢物可能含有共轭结构。结合对这3个代谢物的LC-MS分析(图 2C)推测，这3个化合物虽然分子量较小，但是结构上应该具有一定的新颖性，于是将这3个化合物作为目标化合物进行后续分离。

图 2　目标化合物的检测、富集和色谱数据 Figure 2　Detection, enrichment, and the chromatographic data of three candidate compounds 注：A：目标化合物在HPLC上的保留时间；B：目标化合物的紫外吸收图谱；C：目标化合物的质谱. Note: A: The retention time of three candidate compounds on HPLC; B: The UV-vis spectra of three candidate compounds; C: The MS data of three candidate compounds.

图选项

利用凝胶过滤色谱和反相层析色谱对FR5-4进行多轮反复的分离纯化，最终从组分FR5-4-3-2分离得到化合物1 (5 mg)，从组分FR5-4-3-3中分离得到化合物2 (5 mg)，从组分FR5-4-3-4中分离得到纯的目标化合物3 (4 mg)，得到的3个纯化合物使用HPLC共进样分析的结果如图 3所示。

图 3　化合物1、2、3的HPLC谱图 Figure 3　The HPLC chromatogram of 1, 2, and 3

图选项

1是黄色粉末，可溶于甲醇、氯仿。紫外吸收如图 2所示，其中λ_max：210 nm、252 nm。在正离子模式下，高分辨质谱分析(图 4A)给出其准分子离子峰为249.065 9 [M+H]⁺，而其理论分子量为248.058 6，因此确定它的分子式为C₁₅H₈N₂O₂。化合物1的¹H NMR (600 MHz, CD₃Cl)和¹³C NMR (150 MHz，CD₃Cl)如图 5所示。¹H NMR显示该化合物有8个芳香氢质子信号δ_H 8.64 (d，J=7.86 Hz，H-10)、δ_H 8.44 (d，J=7.68 Hz，H-1)、δ_H 8.03 (d，J=7.92 Hz，H-4)、δ_H 7.92 (d，J=7.32 Hz，H-7)、δ_H 7.86 (dd，J=7.56，7.32 Hz，H-3)、δ_H 7.80 (dd，J=7.62，7.56 Hz，H-9)、δ_H 7.68 (dd，J=7.32，7.26 Hz，H-2)、δ_H 7.43 (dd，J=7.26，6.89 Hz，H-8)，而信号δ_H 1.58为水的信号，此外通过二维核磁共振谱图可以确定信号δ_H 1.25是体系带来的杂质，基于这些信息可以推测该结构中存在2个邻位取代苯环单元(图 1)。¹³C NMR和DEPT显示该化合物有2个羰基信号δ_c 182.6 (C-6)、δ_c 158.1 (C-12)；5个不饱和季碳信号δ_c 146.6 (C-4a)、δ_c 146.3 (C-10a)、δ_c 144.3 (C-5a)、δ_c 123.7 (C-12a)、δ_c 122.2 (C-6a)；8个不饱和次甲基碳信号δ_c 138.3 (C-9)、δ_c 135.2 (C-3)、δ_c 130.7 (C-4)、δ_c 130.3 (C-2)、δ_c 127.6 (C-1)、δ_c 127.2 (C-8)、δ_c 125.4 (C-7)、δ_c 118.0 (C-10) (图 5B)。结合¹H-¹H COSY、HSQC、HMBC等2D NMR光谱，确定化合物1为色胺酮(Tryptanthrin)，化学结构如图 1所示，核磁数据与文献[15]报道一致。

图 4　3个化合物的高分辨质谱图 Figure 4　The HRMS spectra of three compounds 注：A：色胺酮的高分辨质谱图；B：甲基异靛蓝的高分辨质谱图；C：N, N-二甲基异靛蓝的高分辨质谱图. Note: A: The HRMS spectrum of Tryptanthrin; B: The HRMS spectrum of Meisoindigo; C: The HRMS spectrum of N, N-dimethylisoindigo.

图选项

图 5　化合物1的一维核磁共振谱图 Figure 5　The 1D NMR spectra of compound 1 注：A：氢谱(600 MHz)；B：碳谱(150 MHz). Note: A: 1H NMR (600 MHz); B: 13C NMR (150 MHz).

图选项

2是紫红色粉末，可溶于甲醇、易溶于氯仿。紫外吸收如图 2所示，其中λ_max：210 nm、274 nm、390 nm。在正离子模式下，质谱分析(图 4B)给出其准分子离子峰为277.098 0 [M+H]⁺，而其理论分子量为276.089 9，因此确定它的分子式为C₁₇H₁₂N₂O₂。¹H NMR (图 6A)显示该化合物有7组芳香氢质子信号δ_H 9.19 (d，J=8.04 Hz, H-5')、δ_H 9.11 (d，J=7.98 Hz, H-5)、δ_H 7.38 (t，J=7.68 Hz, H-7)、δ_H 7.32 (t，J=7.56 Hz, H-7')、δ_H 7.07 (d，J=7.68 Hz, H-6')、δ_H 7.04 (d，J=7.68 Hz, H-6)、δ_H 6.81 (m，H-8')、δ_H 6.81 (m，H-8)，推测该结构中存在2个邻位取代苯环单元，结合质谱该化合物为类二聚体；信号δ_H 3.28 (s)应该是氮甲基。¹³C NMR (图 6B)和DEPT显示该化合物有2个羰基信号δ_c 169.3 (C-2')、δ_c 167.9 (C-2)；6个不饱和季碳信号δ_c 145.3 (C-9)、δ_c 142.4 (C-9')、δ_c 133.7 (C-3)，δ_c 133.3 (C-3')、δ_c 122.5 (C-4')、δ_c 121.5 (C-4)；8个不饱和次甲基碳信号δ_c 132.5 (C-7)、δ_c 132.5 (C-7')、δ_c 130.2 (C-5')、δ_c 129.8 (C-5)、δ_c 122.5 (C-6')、δ_c 122.4 (C-6)、δ_c 109.2 (C-8')、δ_c 107.7 (C-8)；一个与氮相连的甲基碳信号δ_c 26.1 (C-10)。结合¹H-¹H COSY、HSQC、HMBC等2D NMR光谱，明确了重叠的信号峰并且排除了杂质信号(δ_H 1.25与δ_c 29.7)，最终确定化合物2为甲基异靛蓝(Meisoindigo)，化学结构如图 1所示，核磁数据与文献报道一致^[16]。

图 6　化合物2的一维核磁共振谱图 Figure 6　The 1D NMR spectra of compound 2 注：A：氢谱(600 MHz)；B：碳谱(150 MHz). Note: A: 1H NMR (600 MHz); B: 13C NMR (150 MHz).

图选项

3是紫红色粉末，微溶于甲醇，易溶于氯仿。紫外吸收如图 2所示，与化合物2完全相同。在正离子模式下，质谱分析(图 4C)给出其准分子离子峰为291.113 5 [M+H]⁺，而其理论分子量为290.105 5，因此确定它的分子式为C₁₈H₁₄N₂O₂。¹H NMR (图 7A)显示该化合物有4组芳香氢质子信号δ_H 9.21 (d，J=7.98 Hz，H-5/5′)、δ_H 7.38 (t，J=7.68 Hz，H-7/7′)、δ_H 7.07 (t，J=7.74 Hz，H-6/6′)、δ_H 6.79 (d，J=7.74 Hz，H-6/6′)，推测该结构中存在邻位取代苯环单元；¹H NMR还显示的一个氮甲基信号δ_H 3.26 (s)，并结合该化合物的分子量，推测该化合物为二聚体；¹³C NMR (图 7B)和DEPT显示该化合物有一组羰基信号δ_c 168.0 (C-2/2′)；三组不饱和季碳信号δ_c 145.2 (C-9/9′)、δ_c 133.4 (C-3/3′)、δ_c 121.6 (C-4/4′)；四组不饱和次甲基碳信号δ_c 132.4 (C-7/7′)、δ_c 129.8 (C-5/5′)、δ_c 122.4 (C-6/6′)、δ_c 107.7 (C-8/8′)；一组与氮相连的甲基碳信号δ_c 26.1 (C-10/10′) (图 7B)。信号δ_H 3.49 (s)和δ_c 50.9为甲醇的核磁信号。结合¹H-¹H COSY、HSQC、HMBC等2D NMR光谱，确定化合物3为N, N-二甲基异靛蓝(N, N-dimethylisoindigo)，化学结构如图 1所示，核磁数据与文献[17]报道一致。

图 7　化合物3的一维核磁共振谱图 Figure 7　The 1D NMR spectra of compound 3 注：A：氢谱(600 MHz)；B：碳谱(150 MHz). Note: A: 1H NMR (600 MHz); B: 13C NMR (150 MHz).

图选项

化合物1色胺酮具有非常广泛的生物活性，主要包括抗菌、抗炎症、抗肿瘤、抗疟疾、抗原生虫、抗氧化等^[18-20]。最显著的活性是对结核分枝杆菌的抑制作用，体外实验证明，它可以抑制多种类型的结核分枝杆菌，尤其是对多重抗药性的结核分枝杆菌，MIC值是0.5−1 μg/mL，活性远远高于肺结核的临床药物异烟肼(MIC 4−16 μg/mL)，但体内实验尚未报道^[21]。同时色胺酮在体内对多种肿瘤细胞具有抗性。目前色胺酮的来源主要有3种：一是从植物中提取；二是Hosoe等在担子菌属裂褶菌的发酵液里提取到^[22]；三是人工化学合成，主要方法是以吲哚醌和靛红酸酐为底物，以N-甲基哌啶为催化剂，在吡啶溶剂中回流1 h，产率达到75%−95%，但底物合成复杂，成本高，污染大^[18]。本研究是首次在链霉菌发酵液里发现色胺酮，为其生物合成途径的研究奠定了基础。

化合物2甲基异靛蓝是靛玉红的衍生物，凭借活性高，副作用小，替代了靛玉红，临床上用来治疗慢性粒细胞白血病(CML)^[23]，且有望成为治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)和急性骨髓性白血病(AML)的药物^[24]。目前甲基异靛蓝采用人工化学方法合成，这是首次从微生物的发酵液中分离得到。化合物3是化合物2的N-CH₃衍生物，水溶性较化合物2明显降低，且完全没有生物活性。

这3个化合物均含有2-吲哚酮结构单元。我们前期研究Maremycins生物合成机制过程中，阐明了血红素依赖的色氨酸双加氧酶在还原条件下特异性地催化3-取代吲哚经环氧中间体生成2-吲哚酮化合物^[25]。因此，我们推测这3个化合物可能同样利用了MarE催化吲哚形成的环氧中间体，以不同的形式分别形成了化合物1和化合物2、3，如图 8所示。如果MarE催化吲哚直接形成2-吲哚酮，那么2个2-吲哚酮在氧化酶催化下发生偶联脱氢反应，形成化合物2的前体(图 8的途径A)。这个氧化酶可能类似于催化3-氧吲哚发生氧化二聚生成靛玉红的氧化酶^[26]，将有利于我们通过对产生菌基因组的分析挖掘到该氧化酶。该前体经氮甲基转移酶的催化下发生了2次加载甲基的过程^[27]，第一次加载甲基形成了化合物2，第二次加载甲基形成了化合物3。

图 8　3个化合物生物合成途径的推测 Figure 8　The proposed biosynthetic pathway for three compounds

图选项

如果环氧中间体在邻氨基苯甲酸存在下，邻氨基苯甲酸氮上的孤对电子进攻这个中间体就形成了B途径中的化合物B₁，然后B₁发生脱氢和环化反应，形成内酰胺化合物B₂，B₂最后自发或酶催化发生脱氢反应形成芳香化合物1 (图 8的途径B)。依据推测途径，我们可以寻找相关基因和酶，继而利用代谢工程改造菌株，使之高产甲基异靛蓝和色胺酮，这将极大降低两个化合物的生产成本并保护环境，有很好的应用价值和社会效益。