黄曲霉(Aspergillus flavus Link et al.，1809)容易污染农产品，可产生强致癌、致畸的黄曲霉毒素；米曲霉(Aspergillus oryzae Cohn et al.，1884)可产生多种酶类，广泛应用于食品、饲料、酿酒等发酵工业，是具有上千年安全应用历史的生产菌种^[1]。二者均与生产和生活紧密相关。

Christensen提出米曲霉是野生黄曲霉种的驯化种^[2]，Chang等认为米曲霉是黄曲霉的形态学变种^[3]，二者同属于曲霉属黄绿组，形态相近、基因组高度相似^[2-4]，传统的分类鉴定方法较难区分二者，很容易出现假阴性或假阳性结果，因此对生产应用的菌种进行准确鉴定至关重要。

目前的研究发现黄曲霉(A. flavus)、寄生曲霉(A. parasiticus)、集蜂曲霉(A. nomius)、A. pseudotamarii、A. bombycis、A. toxicarius、A. parvisclerotigenus、A. minisclerotigenes、A. arachidicola、A. pseudonomius、A. pseudocaelatus等11种曲霉属黄绿组的真菌可产生黄曲霉毒素^[5]，准确鉴别这些菌种对实际生产及人类健康至关重要。本研究以包括模式菌株在内的22株标准菌株为研究对象，旨在建立一种准确鉴定黄曲霉和米曲霉的多相分类方法。

1 材料与方法 1.1 菌株

共22株，其中2株模式菌株(米曲霉CBS10025，黄曲霉CBS10027)购自于荷兰皇家文理学院真菌多样性研究中心(CBS-KNAW)；20株标准菌株选取自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)，具体编号和学名见表 1。

1.2 培养基

察氏酵母膏琼脂培养基CYA (g/L)：NaNO₃ 3.0，K₂HPO₄ 1.0，KCl 0.5，MgSO₄·7H₂O 0.5，FeSO₄·7H₂O 0.01，酵母膏5.0，蔗糖30.0，琼脂15.0。

产毒培养基AFPA (g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉20.0，柠檬酸铁0.5，四氯醌0.002，氯霉素15.0，琼脂15.0。

1.3 主要试剂和仪器

真菌基因组DNA提取试剂盒购自OMEGA Bio-Tek公司；GoldView购自北京赛百盛基因技术有限公司；溶菌酶购自美国Sigma-Aldrich公司；蛋白酶购自默克化工技术(上海)有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、Marker购自天根生化科技有限公司；黄曲霉毒素总量(Aflatoxin total) ELISA检测试剂盒购自普瑞邦(Pribo)北京科技有限公司。光学显微镜，尼康公司。

1.4 方法

1.4.1 传统形态学鉴定方法

将试验菌株三点接种于CYA培养基上，25 ℃培养7-15 d，观察菌落培养特征并记录；CYA培养基上25 ℃培养3-5 d，利用光学显微镜进行显微形态的观察。

根据菌落颜色的变化区分黄曲霉和米曲霉(产孢结构持久黄绿色或深绿色为黄曲霉；产孢结构初始为绿色，老后为淡褐色或深褐色为米曲霉^[6])。通过产孢结构的差异进行区分二者(黄曲霉特征：孢梗茎壁厚、长度通常小于1 000 μm，分生孢子球形或近球形，壁具明显小刺，直径3.5 μm-4.5 μm，产孢结构单层或双层，小顶囊上一般为单层，罕见同一顶囊上单层和双层同时存在；米曲霉特征：孢梗茎壁薄、很长，通常大于2 500 μm，分生孢子近球形或椭圆形，壁平滑或稍粗糙，长轴直径4.5 μm-8.0 μm，产孢结构单层或双层，同一顶囊上单层和双层可能同时存在^[7-10])。

1.4.2 产毒培养基(AFPA)检测方法

将试验菌株三点接种于AFPA固体培养基上，30 ℃培养2-3 d，观察AFPA培养基上的培养特征并记录。产毒的黄曲霉在AFPA培养基上，菌落反面呈明显橙黄色(Bright orange yellow)，区别于米曲霉的黄褐色或浅黄色^[11]。

1.4.3 酶联免疫毒素测定方法

将试验菌株在CYA培养基培养7 d，利用无菌解剖刀在菌落四周和中心切5块约5 mm×5 mm的菌落小块，置于1.5 mL灭菌离心管中，加600 μL甲醇-二氯甲烷-乙酸乙酯(1:2:3，体积比)，再加60 μL甲酸，利用超声提取60 min，提取完成后转移提取液至新的离心管中，12 000×g离心5 min，真空旋转仪旋干液体，收集毒素沉淀物进行后续试验^[12]。

采用竞争酶联免疫方法，在微孔板上预包被黄曲霉毒素抗原，加入样本(或黄曲霉毒素标准品溶液)以及辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素抗体。样本或标准品溶液中的黄曲霉毒素与预包被在板孔上的黄曲霉毒素抗原竞争结合辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素抗体。与样本或标准品溶液中的黄曲霉毒素结合的酶标抗体在洗涤时被除去。再加入显色液，读取吸光值。样本的吸光值与其所含残留物黄曲霉毒素抗原的含量成负相关。对照标准曲线即可得出相应残留物黄曲霉毒素的含量。试验设置双孔重复对照。

1.4.4 基于ITS rDNA、β-Tubulin (BenA)基因序列分析的系统发育方法

利用真菌基因组DNA提取试剂盒提取试验菌株的基因组DNA，具体步骤参见试剂盒说明书。利用引物ITS5 (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA GG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增ITS rDNA序列；引物Bt2a (5′-GGTAACCAAA TCGGTGCTGCTTTC-3′)和Bt2b (5′-ACCCTCAGTG TAGTGACCCTTGGC-3′)扩增β-tubulin基因^[5]。PCR反应体系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，模板2 μL，Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL) 1 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各1 μL，补充去离子水至50 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，33个循环；72 ℃ 7 min^[13]。PCR产物送北京诺赛进行测序，并将测序序列上传至NCBI数据库，序列登录号见表 1。

将测序结果在GenBank数据库中进行比对分析，以确定其与已知序列的同源关系。确定并下载各菌株的有效序列后，采用ClustalX 1.83进行多序列比对^[14]，再用MEGA 5.0进行邻接法(Neighbor-Joining)聚类系统发育及分子进化分析1 000次(Bootstrap value)重复自检分析^[15]。

1.4.5 产毒基因检测方法

黄曲霉毒素合成基因簇包含25个基因，长度大约为70 kb^[16]。米曲霉菌株部分不含有产毒基因；部分含有产毒基因，但基因发生突变、缺失或碱基替换，不能正常表达。黄曲霉菌株含有产毒基因，大部分正常表达，产黄曲霉毒素；部分菌株因产毒基因发生突变，不能正常表达产生黄曲霉毒素^[3]。

选取3个黄曲霉毒素合成的关键基因进行PCR扩增检测，三者在黄曲霉毒素合成通路中缺一不可，包括调控基因af1R、柄曲霉素转甲氧基酶基因aflO、杂色曲霉素A脱氢酶基因aflM，扩增引物详见Gallo等^[17]。扩增β-tubulin基因序列作为基因组和PCR条件的阳性对照，根据上述3个产毒基因的扩增结果，判断该菌株是否产黄曲霉毒素，扩增结果为阴性证明该菌株不产毒；若扩增结果为阳性，需进一步证明该菌株是否产毒^[17-19]。

2 结果与分析 2.1 形态学方法鉴定结果

菌株在CYA培养基上生长的菌落颜色及产孢结构见图 1，形态学描述见表 2，形态学鉴定结果见表 3。模式菌株CBS 100925具有孢梗茎长、产孢结构少等米曲霉典型的形态特征，模式菌株CBS 100927具有孢梗茎较短、产孢结构多、持久黄绿色、产生菌核等黄曲霉典型的形态特征。标准菌株CICC 2024、2066、2120、40866、41205均为黄曲霉，但形态学观察符合米曲霉特征，鉴定结果出现5个假阴性。

2.2 产毒培养基检测结果

菌株在AFPA培养基上30 ℃生长2-3 d后，菌落反面颜色及描述分别见图 1和表 2，检测结果见表 3。米曲霉模式菌株CBS 100925菌落反面颜色为浅黄色(阴性)，黄曲霉模式菌株CBS 100927菌落反面颜色为亮橙黄色(阳性)。其中菌株CICC 2024和CICC 2066在AFPA培养基上颜色反应不明显，结果无法判定；菌株CICC 40015为黄曲霉，但其AFPA培养基检测结果为阴性。

2.3 酶联免疫方法(ELISA)毒素测定结果

菌株的酶联免疫方法毒素测定结果见表 3。结果显示米曲霉模式菌株CBS 100925未产毒素，黄曲霉模式菌株CBS 100927产生毒素，其余米曲霉标准菌株均未检测到黄曲霉毒素；除菌株CICC 40015外，所有黄曲霉标准菌株都检测到一定量的黄曲霉毒素，结合2.2中产毒培养基检测结果，判定CICC 40015为不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌种。

2.4 系统发育分析结果

试验菌株ITS rDNA、β-tubulin基因序列与相关近缘菌种的系统发育树分别见图 2和图 3。系统发育结果显示，包括模式菌株在内的22株标准菌株聚为同一系统发育支，序列相似性大于99%。由系统发育结果可知，ITS rDNA序列分析可把黄曲霉和米曲霉鉴定为曲霉属黄绿组(Aspergillus section Flavi)，β-tubulin基因序列分析结果可鉴定为黄曲霉(Aspergillus flavus)或米曲霉(Aspergillus oryzae)，系统发育分析结果见表 3。

2.5 产毒基因检测结果

3个产毒基因PCR扩增的检测结果见图 4，分析结果见表 3。

所有试验菌株BenA基因(阳性对照) PCR扩增产物均有条带，大小约600 bp；菌株2、3号aflR产毒基因PCR扩增没有产物条带，其余都有大小约1 000 bp的条带；菌株1、2、3、21号aflM产毒基因PCR扩增没有产物条带，其余都有大小约500 bp的条带；菌株2、3号aflO产毒基因PCR扩增没有产物条带，其余都有大小约800 bp的条带。据文献[17-19]可知，菌株1、2、3、21号产毒为阴性，其余菌株PCR为阳性，是否产毒需进一步进行产毒试验验证。

3 讨论与结论

22株标准菌的5种检测方法结果见表 3，其中模式株CBS 100925和CBS 100927检测结果符合米曲霉和黄曲霉的典型特征，根据表 3结果可知ITS rDNA和β-Tubulin基因序列系统发育分析可以排除与黄曲霉和米曲霉相近的菌种，但无法区分黄曲霉和米曲霉；传统形态学鉴定方法出现5个假阴性结果，判别依据主观性较强，要求操作者具有良好的判别经验，容易出现假阴性；产毒培养基检测结果出现3个假阴性，只能鉴别出产毒素的黄曲霉，无法鉴别不产毒素的黄曲霉，容易出现假阴性；产毒基因扩增结果出现3个假阳性，只能鉴别出产毒基因缺失的米曲霉，对于基因发生突变的米曲霉菌株不能鉴别，容易出现假阳性；毒素测定结果出现1个假阴性，只能鉴别出产毒素的黄曲霉，无法鉴别不产毒素的黄曲霉菌株，容易出现假阴性。

综上分析，出现假阳性意味着米曲霉被错误鉴定为黄曲霉，因此会损失一些功能菌株的应用；假阴性意味着黄曲霉被错误鉴定为米曲霉，如果产毒素的黄曲霉应用于食品或饲料生产，后果将很严重。因此，若使用单一方法来鉴别黄曲霉和米曲霉，容易出现假阳性或假阴性结果，风险较高，多相分类鉴定方法是准确区分二者的必选手段。综合本研究的分析结果，推荐使用系统发育分析方法初步鉴定未知菌株为黄曲霉或米曲霉，再利用形态学方法区分二者，最后利用产毒培养基方法或毒素测定方法进行结果验证(推荐使用ELISA或液相方法测定)，该组合方法可以准确区分黄曲霉和米曲霉，建议使用该多相方法来确定应用于生产发酵菌种的分类学地位。

以上组合方法具体判定依据如下，首先利用系统发育分析方法将待检菌株鉴定为黄曲霉或米曲霉，再根据形态学特征区分二者，如黄曲霉判定特征为：分离基质广泛，菌落质地丝绒状，部分菌株产菌核，产孢结构大量，始终为黄绿色或深绿色，孢梗茎较短(通常小于1 000 μm)，分生孢子近球形、壁明显粗糙；米曲霉判定特征为：主要分离自酿造用曲，从其他自然基物中较少分离到；菌落质地绒毛状，基本不产菌核，产孢结构少，初为浅色(黄色或绿色)，老后变为深色(棕色或褐色)，孢梗茎很长(通常大于2 500 μm)，分生孢子较大(长轴直径4.5 μm-8.0 μm)；根据形态学特征区分二者后，再利用产毒培养基验证判定结果，防止假阴性结果的产生，在AFPA培养基上，菌落反面为浅黄色或黄褐色，则该菌株不产毒素；在AFPA培养基上，菌落反面呈亮橙黄色，则该菌株产毒素，为黄曲霉；最后利用液相方法或酶联免疫法进行菌种毒素代谢测定，进一步验证鉴定结果的准确性。

此外，目前已有研究认为一些不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌种可应用于工业生产，从而避免一些功能菌种的弃用^[17]。所以，应用于生产发酵的微生物菌种是应根据其分类学名限制，还是根据其是否产毒素来限制，有待进一步探讨。