植物内生固氮菌是指那些定殖在植物内部与植物宿主联合固氮的固氮菌^[1]。植物内生固氮菌占据着植物组织内有利于营养供应和微环境适宜的生态位，可以有效地拮抗病原微生物的生长，较根外环境更有利于形成高效固氮体系，进而促进作物的生长及产量的提高^[2-4]。到目前为止，已有文献报道的内生固氮菌均为内生固氮细菌，尚未见到有关内生固氮真菌的报道^[5]。植物内生固氮菌的种类不同，为寄主植物提供氮源的效率、产生植物激素类物质、促进宿主的生理变化也不同^[6]。对从植物体内分离出来的固氮菌进行系统发育进化关系研究是生物固氮的基础之一，只有通过科学的方法，准确而有效地确定每一种内生固氮菌的分类学地位，才能更好地进行生物固氮机理的研究以及功能应用的开发。

常用的植物内生固氮菌系统发育进化研究方法主要是从4个水平进行：形态学与蛋白质水平法；数值分类法和自动化鉴定；化学分类鉴定法；分子遗传学鉴定法。

传统的系统发育进化研究方法主要依赖于表型分析和个体形态学观察。形态学经常辅以生化试验来对植物内生固氮菌进行系统发育进化分析。生化试验是根据内生菌不同菌种在培养过程中所产生的新陈代谢产物各异而表现出不同的生长特性^[7]。如糖(醇)类代谢试验、脂肪酸类和蛋白质代谢试验、矿物质元素利用试验、酶活性^[8]、植物促生物质试验等。对内生固氮菌蛋白质水平的鉴定技术，主要是蛋白质图谱分析^[9]。蛋白质图谱分析主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)和SDS-PAGE。采用全细胞SDS-PAGE对高度标准条件下培养的细胞的可溶性蛋白质进行分析，可以得到反映生物基因组成的蛋白质图谱信息^[10]，这项技术也是一种分群和比较大量相近菌株的较好方法，该方法具有一定的可靠性，一般用于属内的分群^[11]。形态学与蛋白质水平法存在一些缺点，例如重现率低、某些技术的不定性、低辨识能力以及相似的表型特征并不等同于相似或者关系密切的基因型。所以对于许多表型特征难以区别的菌种，仅通过传统方法无法准确进行系统发育进化分析，该方法操作较繁琐，实验周期也较长^[12]。

数值分类法是近20年来发展起来的理论，它应用大量已知菌对相关生化试验反应出现的频率得出数据进行分析，根据相似系数大小判断细菌种属间的亲缘性^[13]，自动化鉴定系统便是采用数值分类原理建立的。随着微电子、计算机、分子生物学等先进技术向植物内生固氮菌生物学领域的渗透和多学科的交叉，对植物内生固氮菌进行快速系统发育进化分析有了突破性的进展^[14]。BIOLOG微生物自动分析系统是美国BIOLOG公司推出的一套运用数值分类原理的自动鉴定系统^[15]，该系统主要根据细菌对糖、醇、酸、醋、胺和大分子聚合物等95种碳源的利用情况进行分析并鉴定。细菌利用碳源进行呼吸时，会将四哇类氧化还原染色剂(TV)从无色还原成紫色，从而在鉴定微平板(96孔板)上形成该菌株特征性的反应模式或“指纹图谱”。鉴定板由读数仪自动读取吸光值，软件自动判断结果为阴/阳性或边界值，自动与数据库对比，给出鉴定结果。预测微生物模型自动化鉴定是运用微生物学、工程数学以及统计学进行数学建模，并与应用计算机学相结合组成的一种鉴定系统^[16]，它的目的在于用数学的语言描述微生物在不同环境条件下的生长、死亡情况。这些环境条件包括pH、水分活度、温度、气体环境等。预测微生物自动鉴定的核心在于建立完善的数学模型，然后利用美国BIOLOG公司开发的一种新的微生物鉴定方法——代谢指纹法，运用特征选择和优化技术，得到细菌鉴定板上每孔的特征曲线。对于得到的特征-时间曲线，再运用预测微生物学，拟合出预测微生物生长模型^[17]，结合统计学原理，对数据进行过滤和匹配，从而实现对细菌的全自动鉴定。

植物内生固氮菌化学分类法通过化学测定，获得各植物内生固氮菌组分的化学数据^[18]，依据得到的化学成分数据在种的水平上对植物内生固氮菌做出精确鉴定，属的分类主要测定各种氨基酸组分。另外，还有全细胞水解液糖型分析、脂肪酸分析、磷酸类脂成分分析、枝菌酸分析、醌类分析和光合色素成分分析等^[19]，常使用红外光谱、高效液相色谱等新技术。红外光谱法早在20世纪50年代起就开始运用于区分不同的植物内生固氮菌^[20]。随着现代干涉型红外光谱仪、傅立叶变换技术以及计算机的发展，这一研究领域又有了新的进展。傅里叶变换红外光谱法以未损伤细胞的傅里叶变换红外光谱的特殊指纹区为基础，光谱反映的是整个细胞组成分子的振动特征，也就是蛋白质、核酸等物质的特征，因此可以区分生化信息上的差别^[21]。高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代末发展起来的一种分离分析新技术^[22]，可直接测定细菌DNA的碱基组成和化学组分，可对细菌进行DNA的G+C%含量测定^[23]、分枝菌酸分析、醌类分析。化学分类法在植物内生固氮菌系统发育进化研究中具有分离效率高、选择性好、检测灵敏度高和分析速度快等优点。

自20世纪60年代开始，分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使植物内生固氮菌系统发育进化研究进入了分子生物学时代，目前主要的遗传学分析方法，包括DNA的G+C%、核酸杂交技术、16S rRNA基因序列分析、多位点序列分型、全基因组测序以及核酸指纹图谱等^[24]。染色体DNA的G+C%含量即DNA的碱基组成^[25]，由于不受菌龄的影响，已成为植物内生固氮菌系统发育进化的重要指标；热变性温度测定法(T_m法)操作简便、精确度高、重复性好，被广为采用^[23]。核酸杂交技术根据碱基互补配对原理，将2条不同来源的单链核酸进行复性以鉴定菌株间的亲缘关系^[26]，用于DNA-DNA (Southern杂交)、DNA-RNA、RNA-RNA (Northern杂交)和PNA-DNA杂交(PNA为肽核酸)。DNA-DNA杂交适用于种水平的研究，而DNA-RNA杂交^[23]用于属和属以上水平的分类研究。16S rRNA基因广泛存在于原核生物的细胞中，保留了大量的信息量又便于扩增和测序，其基因序列由恒定区和可变区组成，可变区序列因不同植物内生固氮菌而异，恒定区序列基本保守，通常利用恒定区序列设计引物，结合PCR技术，将16S rRNA基因序列扩增出来，再利用可变区序列的差异来对不同属种的植物内生固氮菌进行分类鉴定^[27]，现已成为大多数植物内生固氮菌系统发育进化研究的常用方法和描述新分类单元的必要指标^[28]。

作为最重要的分子生物学分析方法之一，DNA测序为遗传信息的揭示和基因表达调控等基础生物学研究提供了重要的数据。自2005年以来，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的高通量测序技术相继诞生。虽然高通量测序技术建立的时间不长，但发展非常快，已经应用于基因组，包括测序和表观基因组学以及功能基因组学研究的许多方面^[29]。高通量测序技术堪称测序技术发展历程的一个里程碑，该技术可以对数百万个DNA分子进行同时测序。这使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，将基因组学水平的研究带入了一个新的时期，也使经典分子生物学家对基因组学的认识和思考上升到一个新的水平。高通量测序技术开启了植物内生固氮菌的基因组测序。2006年Krause等^[30]对第一株内生固氮菌Azoarcus sp. strain BH72完成了测序工作，但在植物内生固氮菌的系统发育进化研究中，可用的基因组数据并不多，这给研究工作带来了一定的困难，鉴于此，有必要对已测全基因组数据的植物内生固氮菌进行系统总结。目前已完成全基因组测序的植物内生固氮菌汇总见表 1。

高通量DNA测序技术的飞速发展使其在微生物学领域的应用也不断成熟，比表型和基因序列分析的全基因组更准确的数据被应用到微生物系统发育研究，全基因组测序带来了植物内生固氮菌的海量信息，研究者们无法完全按照常规的方法对其进行系统发育进化研究^[53]，随之也涌现出一些基于基因组数据的分析方法，使植物内生固氮菌系统发育进化研究在精确度、可靠性等方面取得了重要的突破。

ANI (Average nucleotid identity)分析又名平均核苷酸一致性分析，是指2个基因组之间同源基因的相似性^[54-55]。平均核苷酸一致性是基于物种全基因组序列，通过分析比较同源基因序列来判定物种间遗传关联性的重要参数。ANI值可以通过2种运算方法得出，一种是以MUMmer运算法则为基础(ANIm)，另一种是以BLASTn方法为基础(ANIb)，相比之下后者应用更为广泛^[53]。普遍认为亲缘关系较近的种群ANI值至少为70%-75%，而定义一个种的ANI值需要达到95%-96%以上，并且引起研究者们关注的是这些ANI的数值与“金标准”——DDH有紧密的对应关系^[56-57]。平均核苷酸一致性具有使用方便、耗时少、较低错误率、高分辨率的优势^[58]。目前使用JSpecies软件计算ANI值是一个优选的方法^[59]。如Zhang等采用多基因序列(如SMc00019-truA-thrA)分析的ANI值比较，以94%或96%作为区分不同种的阈值标准，很好地将不同内生固氮菌区分开来^[60]。平均核苷酸同源性分析逐渐被一些学者认为可以作为代替DDH的下一代金标准候选方法^[61]。

最大唯一匹配在基因序列比对中可以发挥重要的作用。最大唯一匹配可以从相互重叠的序列片段中重构DNA的完整序列，也可在各种试验条件下从探测数据中决定物理和基因图存贮并查看和比较数据库中的DNA序列来判断2个或多个序列的相似性。最大唯一匹配指数法MUMi (Maximal unique matches index，MUMi)是以2个基因组间的最大唯一配对数为基础并结合生物信息软件来计算基因组距离的方法，可用于植物内生固氮菌的种内比较。MUMi值的变动区间在0-1之间，MUMi值越小则代表这2个基因组之间的亲缘关系越近。许多研究发现MUMi在衡量基因组亲缘关系时与ANI和DDH有比较好的关联性，0.33±0.03的MUMi值对应于95%±0.5%的ANI值和70%的DDH值^[62]。Orme o-Orrillo等^[63]在对根瘤菌进行研究中采用了最大唯一匹配指数的研究方法，并确定了Rhizobium sp. PRF 81、Rhizobium tropici CIAT899与其他根瘤菌的亲缘关系，其研究结果表明，Rhizobium sp. PRF 81和CIAT899为亲缘关系很近的菌株，而Rhizobium rhizogenes K84则应该属于其他的分类群。最大唯一匹配指数法在研究种内相近菌株的差异性方面具有很高的灵敏度^[62]，可在植物内生固氮菌种内相似菌株的鉴别中发挥作用；此外这种方法还具有方便快捷的优点，同时与DDH和ANI也存在紧密的对应关系，因此在植物内生固氮菌系统发育进化研究中具有较大的优势^[64]。

核心基因组(Core genome)是指在菌株基因组中不易发生水平转移、较为稳定、包括看家基因在内的基因集，这些基因大都具有种属特异性^[65-66]。由于核心基因组的进化比较缓慢并且受种内重组的影响比较小，因此可以将其用于鉴定植物内生固氮菌菌株之间的亲缘关系中^[67]。核心基因组的构建方法主要是利用BLAST工具进行相似性比对，在比对的同时设定研究所需要的阈值^[68]。核心基因组法在植物内生固氮菌系统发育进化研究中的具体应用通常是先将核心基因组数据进行比对，并据此绘制出内生固氮菌的系统发育树。谢剑波^[69]通过将固氮菌株与非固氮菌株的核心基因组比较后发现，固氮菌株具有9个特有的固氮基因。Kaas等^[70]在研究了大肠杆菌的核心基因组数据后发现，由核心基因组建立的系统发育关系具有优异的分辨率，同时也指出使用核心基因组建树的方法应该普及并应用于大肠杆菌的系统发育分析中。基于核心基因组方法研究的进展表明核心基因组分析可广泛应用于属及属以上植物内生固氮菌的研究中，也可用于揭示各内生固氮菌群体内的进化关系。目前对于核心基因组分析方法的争议主要在于应该如何定义核心基因组，定义核心基因组的具体界限应该是什么，这些基因到底需要保守到什么程度才可以被列入到核心基因组的范畴中^[71]。鉴于此，核心基因组方法在植物内生固氮菌系统发育进化中的应用还需进一步完善^[72]。

K串组分矢量法(K-string)是通过计算蛋白质序列或DNA序列中寡肽的出现频率来推断基因组相关性的一种方法^[73]。在一个长度为N的DNA或者RNA序列中长度为K的连续结构即为K串，对于基因序列有4 K个可能的K串^[74]。K可以选择从1-N之间的任意数。短K值侧重于反映不同种之间的共同特征，而长的K值重点在于强调种的特异性^[75]。在应用此方法构建的系统发育树中，当K=5或6时是最适合用于细菌系统发育构建的K值，并且也有学者指出没有必要选择大于7的K值^[76]。2004年，初步开始构建了这一方法应用的网络平台是CVTree (http://tlife.fudan.edu.cn/cvtree/)，这一平台在2009年得到了进一步的完善，从而为研究人员利用这一方法进行系统发育进化分析提供了技术支持。Chan等将熵原理应用到组分矢量方程中，并对原有方法进行了合理的调整改善，从而使组分矢量法更加准确、应用范围也更加广泛^[77]。Qi等^[73]利用组分矢量法分析了原核生物的系统发育关系，得到的结果与利用16S rRNA基因分析相似。K串组分矢量法在系统发育进化分析中取得了重要的成就，不但适用范围比较广，而且还可用于细菌、古菌及真菌的系统发育进化分析^[73]。然而K串组分矢量法也存在一些问题，研究发现并不是所有的K串都可以有效地用于种系发生树的建立^[78]，另外水平基因的转移也会影响到K串组分矢量法的准确性^[75]。

基因流动性φ (Genome fluidity)是指在一组个数为N的基因组中，独特基因数和总体基因的比值，这是属于一种基因容量的比对方法，可以简单地认为是基因组之间非重叠部分的度量，此方法最初主要用于衡量微生物种群内基因的多样性^[79-80]。基因流动性φ值为0.1的时候，代表一对基因组有10%的基因是不同的，有90%的基因是相同的，由此可见，基因流动性的数值越小代表对应基因组的特异性程度就越小^[81]。Lan等^[82]介绍了一个基因组信息的简易比较平台POGO-DB (http://pogo.ece. drexel.edu/)，基因流动性是此平台所使用的比对方法之一。Zwick等^[81]运用此方法计算了蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的基因流动性，结果显示蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的基因流动性值φ=0.22，说明这个属的分类地位处于世界性物种如脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)或者大肠杆菌(Escherichia coli) (φ=0.3)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (φ=0.15)之间。基因流动性分析这一方法的优点在于它不会因提供的基因序列过短或是鉴定基因同源性方法的不同而影响其结果的精确性^[79]，但是基因流动性的准确性同样也会受水平基因转移的影响^[77]，在一定程度上制约了这一方法在系统发育进化分析中的应用。

在系统发育进化分析研究中，以上论述的这几种基于基因组数据的方法，它们的应用领域各有侧重，但在微生物系统发育进化分析中均有大量成功的实例。DNA杂交分析因与平均核苷酸一致性分析有良好的关联性而有望成为下一代的金标准^[61]。最大唯一匹配指数法和平均核苷酸一致性分析同为计算基因组指数的方法，与DNA杂交同样也存在一定的联系这一特性增加了其在系统发育进化应用中的优势^[71]。核心基因组分析因为所选的基因都具有较强的保守性，因此在系统发育进化分析中会有比较高的分辨率和准确性。涉及到基因含量的2种方法——基因流动性分析和K串组分矢量法目前在植物内生固氮菌系统发育进化中的应用还比较少，但是由于其具有算法简便和免对比的优点，因而也具有一定的应用前景。在这5种方法中核心基因组分析和平均核苷酸一致性分析的应用相对比较成熟^[71]。以上所涉及到的方法大部分是用于可培养植物内生固氮菌的，但是到目前为止，因为局限于技术手段，仍有大量不可培养的植物内生菌我们无法获得。对这些不可培养的内生菌，传统的系统发育进化研究方法是行不通的，需要运用宏基因组学的方法。宏基因组学^[83]以环境中微生物基因组的总和为研究对象，从而规避了传统方法中绝大部分微生物不能培养的缺陷，因此近年来在环境微生物学研究中得到了广泛应用。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养的困难，而且还可以结合生物信息学的方法，揭示微生物之间、微生物与寄主植物、微生物与环境之间相互作用的规律，大大拓展了微生物学的研究思路与方法，为从群落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。

植物内生固氮菌系统发育进化研究的最终目标是建立一个可以反映“自然秩序”的系统。因此，植物内生固氮菌系统发育进化分析的技术在探索和争论中不断提高。目前已出现的基于基因组的新方法已经在很大程度上修正了之前存在的偏差，但是这些方法仍存在较大的改善空间。另一方面，由于目前对基因组序列信息所包含的生物学意义了解得不够透彻，所以在应用这些基因组数据时应当更加慎重。但由于以基因组数据为基础的这些方法具有快速、准确、节省人力等优点，相信会得到更广泛的应用。目前，对于不熟悉或从未发表的新菌种，很难采用现有的一种或少数几种方法进行系统发育进化分析；对于不可培养的内生固氮菌，更不能用传统的方法进行系统发育进化分析。在今后的研究中，为了提高植物内生固氮菌系统发育进化分析的合理性和准确性，除了对已有方法改进完善并且探索新方法之外，也需要考虑将这些基因组数据的方法同形态学、生理生化特性等表型标记方法联合使用，同时还要探索和开发基于宏基因组学的新方法。因此，植物内生固氮菌系统发育进化分析必须在充分利用和完善现有的鉴定技术基础上，更进一步开发基于宏基因组大数据的新技术手段，使用传统与现代相结合以及不断发掘新方法以适应需要。随着植物内生固氮菌系统发育进化研究方法的不断建立和完善，将为科研工作者提供简便、快速、准确、微量、灵敏和成本低廉的检测方法及更先进、更全面的检测手段。