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文章信息
- 任丽, 张永刚, 马睿, 周雪飞, 张亚雷
- REN Li, ZHANG Yong-Gang, MA Rui, ZHOU Xue-Fei, ZHANG Ya-Lei
- 代谢组学及其在微藻研究中的应用
- Metabolomics and its application in the study of microalgae
- 微生物学通报, 2018, 45(1): 166-172
- Microbiology China, 2018, 45(1): 166-172
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170618
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文章历史
- 收稿日期: 2017-08-07
- 接受日期: 2017-10-20
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2017-11-02
2. 同济大学环境科学与工程学院 长江水环境教育部重点实验室 上海 200092
2. Key Laboratory of Yangtze River Aquatic Environment of the Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China
代谢组学作为组学研究中下游代谢产物的分析手段,与基因组学、转录组学、蛋白质组学、表型组学共同组成系统生物学体系。代谢组学最早在1999年由英国帝国理工大学Nicholson教授提出,他定义的代谢组学(Metabolomics)是在完整的生物系统中定量测定生物体受到病理生理或基因改变等刺激作出的多参数代谢物质的动态应答[1]。随后,德国马普所Fiehn教授提出代谢组学概念,即在静态过程中,定性定量分析限定条件下生物体产生的所有代谢产物[2]。现在,普遍被学者认可的代谢组学是定性定量考察生物系统受到内外刺激后机体内相对分子质量小于1 000的代谢小分子化合物,反映应激后生物机体做出的代谢应答信息[3-4]。自代谢组学概念提出后,它被广泛应用在药物筛选和疾病诊断研究中,成效显著。随着检测分析平台的快速发展,代谢组学在越来越多的研究领域得以运用。
1 代谢组学概况 1.1 代谢组学分类代谢组学的研究对象是生物体内的小分子代谢中间产物或最终产物,根据研究对象和目的的不同,主要分为4个层次:第1层次为代谢指纹分析(Metabolic fingerprinting),以特定生物体的整个图谱代表特定代谢模式,是用于区分不同生物学状态或起源样品的筛选工具,是一种高通量、快速(通常为1 min或更短)、全局分析方法;第2层次为代谢靶标分析(Targeted analysis),是对特定代谢反应相关的一种或几种代谢物的定性和定量分析,适用于少数或特定代谢物的样品分析,并需要严格的样品分离和制备;第3层次为代谢轮廓分析(Metabolite profiling),与特定的代谢途径相关,对多种或一系列预设代谢物进行定量测定,这种分析手段广泛运用在新药物研发领域;第4层次为代谢组学,对生物系统的所有代谢物进行无偏差鉴定和定量分析,分析技术的选择性和灵敏度要求高[5-8]。
1.2 代谢组学应用状况代谢组学作为系统生物学重要研究领域之一,已引起国内外科学家广泛关注。目前研究主要集中在5个方面:(1)药物研发。通过代谢组学研究构建数据平台,预测药物毒性和筛选获得新的生物标志物[9]。Son等[10]通过代谢组分研究,发现胰腺肿瘤在能量代谢过程中天冬氨酸和苹果酸变化显著。运用基因敲除技术发现抑制肿瘤代谢途径的关键基因及蛋白酶,具有筛选控制胰腺肿瘤生长的药物前景;(2)疾病诊断。对比疾病的代谢物变化,获得特征代谢物的谱图进行生物标志物的寻找,辅助临床疾病的诊断。Sreekumar等[11]研究了前列腺癌变病人的血浆、组织和尿液的代谢物变化,发现肌氨酸的组分变化明显,可作为表征前列腺癌的疾病诊断;(3)毒理学研究。考察生物机体应对环境、药物等因素变化代谢物的反应,得出代谢途径与影响因子的作用效应。Zhang等[12]将中药半夏作用大鼠来考察毒性效应,研究发现大鼠在给予半夏后,尿液和血清中的多种代谢物含量发现显著变化,磷脂代谢和氨基酸代谢发生紊乱,对大鼠产生一定程度的心脏毒性;(4)植物代谢组学。研究代谢物在生物机体内的变化,寻找特定变化的代谢物,评价与之相应基因控制功能的关系。Urano等[13]研究拟南芥叶片在缺水条件下代谢组学的变化,观察到包括脯氨酸、氨基丁酸和三羧酸循环等多种代谢物的积累。在nc3-2突变体中发现其缺少参与脱落酸脱水诱导生物合成的NCED3基因,用它来评估脱落酸对缺水胁迫下代谢反应的影响;(5)微生物代谢组学。关注微生物代谢过程中生物标志物以及代谢机制研究,为解释生化协同作用的生理过程提供有力的分析途径。Olszewski等[14]将13C标记的谷氨酰胺喂给恶性疟原虫后,发现恶性疟原虫中三羧酸循环发生分支变体,形成乙酰辅酶A的独立反向的双碳单元,谷氨酰胺衍生的乙酰辅酶A用于组蛋白乙酰化,葡萄糖衍生的乙酰辅酶A则用于乙酰化氨基糖。
2 代谢组学分析流程代谢组学的分析流程一般包括样品采集与制备、数据采集、分析及解释等。样品的采集与制备包括样品的提取和预处理。将预处理所得样品用核磁共振、色谱、质谱、红外光谱等分析手段检测其中代谢物种类和含量。运用多元变量统计方法进行数据分析,得到相关代谢物变化特征,发现生物标志物,阐明生物体代谢途径及相关机制。
2.1 样品采集与制备样品采集是代谢组学研究的第一步,常见样品包括体液、细胞、组织等。取样前应充分考虑取样的时间、种类、部位、样本群体等因素。为了减少样本差异对实验造成的误差,需要采集足够数量的样本,以做出有统计意义的分析。由于样本中代谢物易受处理手段影响,为保障数据的可靠性,在处理生物样本时要特别注意避免残留酶活性或氧化还原反应对样本中代谢物产生影响。采集样品后通常使用液氮冷冻、酸处理等方式进行快速淬灭[15]。
采集后的样品需要进行预处理,根据化合物种类、分析手段的要求不同采取相应合适的处理方法。大多代谢物采用水或有机溶剂进行萃取获得,部分需要进行复杂处理的代谢物,常用的方法有固相萃取、固相微萃取、亲和色谱等。特定的预处理方法往往仅适合某种或某类化合物的处理,因此处理不同化合物需采用不同的处理方法,并在此基础上不断优化以确保提取化合物的准确性,并尽可能保留和体现样品中代谢物的完整信息[16-17]。
2.2 数据采集尽管越来越多的分析技术出现,但代谢产物由于组分、数量、官能团、挥发性、极性等因素的差异,至今尚无使用单一分析手段就能进行代谢组学的研究,况且各种分析技术都有各自的优势和适用范围,因此多种分析技术组合方法得到广泛使用[7, 18-19]。现有的分析技术包括核磁共振(NMR)、质谱(MS)、色谱(GC)、红外光谱(IR)、毛细管电泳(CE),在代谢组学研究中常用的技术是核磁共振(NMR)、气质联用(GC-MS)、液质联用(LC-MS)和傅里叶红外光谱(FT-IR)[7, 20]。代谢组学研究常用几种技术的优缺点比较见表 1。
通过分析技术所得的大量、多维原始数据,需要整合计量学和生物信息学方法来解释,一般分析流程为数据预处理、多变量分析及模式识别、生物标记物识别和代谢途径分析等。
2.3.1 数据预处理原始数据不能直接运用于模式识别分析,需经过数据预处理消除检测过程中的多种干扰,获取分类相关的信息。数据预处理的方法有数据降噪、中心化、尺度转换、转化、信号校正等。数据的预处理和分析不仅取决于所需获取的生物学信息,还依据所选用的数据分析方法[24-25]。
2.3.2 模式识别模式识别是一个将预处理的大量数据进行处理、区分的过程,将类似的样品聚集一起形成分组,迅速、准确地提取出有贡献的变量,建立样品信息与样本各因素的联系。模式识别包括非监督方法和有监督方法。非监督方法无需样品的背景信息,可采用可视化集视直接将预处理后的信息进行归类表达,常用方法有主成分分析(PCA)、层次化聚类分析(HA)、簇类分析(HCA)等;有监督方法基于多参数数学模型使各类样品得到最大分离并进行预测,常用方法有偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)等[25-27]。
2.3.3 生物标志物识别生物标志物是生物体受到刺激后机体在分子水平上做出异常变化的响应,研究中常用PCA、t检验和方差分析等多元统计方法寻找生物标志物[28-29]。生物标志物识别流程包括4个步骤,分别为构建代谢谱图、筛选特征代谢物、推断代谢途径和验证生物标志物。在此识别分析过程中,需要借助各种代谢途径与生物化学数据库。基于不同的分析手段,采用的数据库也有差异。质谱分析常用的数据库有GMD、METLIN、MassBank、ReSpect等,核磁共振分析中运用的数据库有NAPROC-13、NMRShiftDB、BML-NMR等[30-31]。目前代谢组学研究的数据库功能还不完备,现有的数据库主要用于代谢产物的结构鉴定。
2.3.4 代谢通路分析代谢通路是借以构建的图形表达机体内生物学过程,呈现细胞分子间相互作用及变化网络。KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)是一个整合基因组、化学和系统功能信息的数据库。利用KEGG网络可将代谢组数据运用流程图形式可视化,发现代谢通路显著调节因子[30]。SMPDB (Small molecular pathway database)是针对小分子代谢通路分析的数据库,其中超过350条人体小分子代谢通路,占比2/3的通路是其他通路数据库找不到的,而且所有的通路都附有条件、途径的详细描述[32]。
3 代谢组学在微藻研究中的进展代谢组学自提出后广泛应用在药物研究、疾病诊断、生态毒理、植物及微生物等方面研究,但在微藻领域研究中的应用尚不普遍。微藻作为第三代生物能源原料,具有多方面开发价值。近年来随着微藻研究热度的提升和代谢组学技术的飞速发展,越来越多的科研学者投入到微藻代谢组学的研究中,研究包括增产经济高附加值次级代谢产物、表征毒理学特性和研究抗逆性等方面。
3.1 在抗逆性研究中的应用微藻应对环境条件胁迫的机体代谢应答是研究高产生物量和经济产物的基础,因此针对环境诱导下微藻的代谢组学研究也逐渐增多。Renberg等[33]研究高、低CO2浓度胁迫莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的影响,检测出128种代谢物存在显著差异,将莱茵衣藻从高浓度转至低浓度CO2条件下,参与光呼吸的5种代谢物、11种氨基酸、1种脂质含量增加,6种氨基酸和21种脂质含量减少;Valledor等[34]发现低温胁迫下莱茵衣藻细胞内葡萄糖和淀粉合成途径被激活积累量显著增加,多不饱和脂肪酸含量增加,蛋白质为适应低温发生重塑。在缺氮诱导下,富油新绿藻(Ettlia oleoabundans)细胞内三酰基甘油和磺基奎诺糖基二酰基甘油积累增加,叶绿素耗尽,二酰基甘油发生差异调节[35];椭圆假索囊藻(Pseudochoricystis ellipsoidea)中的中性脂质增加,氨基酸的转化量降低[36];本课题组在研究药物和个人护理品(PPCPs)对小球藻(Chlorella pyrenoidosa)的生长影响中,发现低浓度PPCPs促使小球藻产生活性氧,激发藻细胞的抗氧化防御机制,酶活性增加,而在高浓度作用下,藻细胞防御机制呈现崩溃趋势[37]。
3.2 在经济高附加值产物研究中的应用微藻在自然条件下能通过利用太阳光、碳源、水和无机盐合成大量脂质、蛋白质和碳水化合物等。因此利用微藻进行废水资源化、能源化的研究越来越多,本课题组也在此方面做过大量研究,曾用微藻处理厌氧消化的活性污泥、淀粉废水和酒精废水等,发现微藻在有效调控下高效去除废水中污染物的同时,藻细胞体内的油脂含量得到提升[38-40],为微藻高附加值产物研究奠定基础。但是这些研究局限在宏观调控上并不能解释物质变化及代谢机理,由此将微藻研究与代谢组学结合运用在具有经济高附加值的次级代谢产物研究上,例如脂肪酸、多糖、类胡萝卜素、类固醇等,为解释物质代谢机理和定向物质积累提供理论支撑。Cheng等[41]通过GC-TOF-MS建立集胞藻(Synechocystis sp. PCC6803)、鱼腥藻(Anabaena sp. PCC7120)和斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)的脂肪酸以及代谢物图谱,用2 mmol乙醇胺作用斜生栅藻可明显提升藻内的脂质含量,其中不饱和脂肪酸C16:2和C18:1的含量提高,C18:3的含量降低;另外,Lu等[42]研究接种密度对小球藻(Chlorella sorokiniana)脂质积累与代谢物变化的影响,发现脂肪酸甲酯和十六烷值的含量随初始接种密度的增加而增加,后续研究发现增强光照强度有助于提升高密度接种小球藻脂质中不饱和脂肪酸的含量;本课题组用不同浓度双氯芬钠胁迫小球藻,在检测到的91种代谢产物中,发现低浓度(< 10 mg/L)作用下藻细胞中脂肪酸、糖类的代谢过程得到促进,氨基酸的代谢途径受到明显抑制,而高浓度(100 mg/L)的双氯芬钠则使得小球藻的正常代谢过程变得紊乱[37];Yang等[43]在考察解偶联剂羰基氰化物间氯苯基腙(CCCP)对莱茵衣藻产生物氢的影响研究时发现,延长CCCP暴露时间,H2稳定产生的同时脂肪酸含量持续增加,这些作用因子研究为微藻定向积累油脂、脂肪酸、糖类、氢气等能源物质提供了理论支持。Su等[44]从代谢组学角度分析了醋酸、Fe2+和高光强对雨生红球藻积累虾青素的影响,Lv等[45]在此基础上运用代谢组学探究了高光对雨生红球藻中虾青素的积累机理,发现卡尔文循环和三羧酸循环参与并影响细胞代谢物的合成,虾青素在变红阶段的含量最高。Han等[46]对不同光照处理下发菜的代谢物进行分析,发现红光诱导光抑制并刺激多糖产生,因此可运用诱导红光手段来调控发菜多糖的产生。
3.3 在毒理学研究中的应用微藻作为水体初等生产者,因个体小和生长周期短等特点,机体能在短时间内对环境、毒物等影响做出反应,因此常用微藻表征水体生态效应,考察水体污染物的毒理机制。莱茵衣藻是淡水环境的模式生物之一,常用作毒理研究的试受生物。Jamers等[47]研究不同镉浓度处理下莱茵衣藻的代谢响应,发现低浓度下毒害效应不明显,高浓度下影响谷胱甘肽合成途径中的代谢物合成,呈现对镉作用的敏感性;Taylor等[48]通过代谢组学考察二氧化铈纳米颗粒在莱茵衣藻生长环境下的吸入与毒性研究,观察到颗粒物能进入细胞囊泡,但在任何暴露浓度下对机体都不会产生明显影响,仅有在超环境二氧化铈浓度下对光合作用和固碳过程代谢有干扰。随着农药、除草剂等在农业中的广泛使用,雨水冲刷地表径流使得这些药物进入水体环境,给水体生态带来隐患。扑草净作用斜生栅藻(Scenedesmus vacuolatus)[49]和敌草隆作用杜氏盐藻(Dunaliella tertiolecta)[50],都发现机体细胞激活分解代谢过程的能量代谢受到影响。
4 展望代谢组学是系统生物学的重要组成部分,也是生物分子表型研究的主要手段,在科学研究与应用方面具有巨大潜力。现阶段代谢组学研究主要集中在药物开发、疾病诊断、毒理学、植物及微生物表型分子等方面,在微藻中的应用并不是很普遍。微藻在特定条件下能合成多种结构与功能独特的具有经济高附加值的代谢物,是人类未来能源、医药、保健、化工等方面的重要资源,因此在这类高经济价值物质的研究与开发上具有广阔的应用前景。尽管代谢组学分析技术不断发展,但是微藻与代谢组学结合实现资源开发的愿景依旧需要面对诸多的挑战,包括样本处理、检测方法及分析手段的局限性、数据库不完备、费用高昂等,这些问题也在一定程度上影响微藻代谢组学研究的进程。在未来随着微藻研究的进一步深化,代谢组学与蛋白质组学、转录组学、基因组学间两者或全部联用,从系统生物学的层面来全面解释微藻结构与功能的关系,为定向改造微藻提供理论基础。
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