微生物学通报  2018, Vol. 45 Issue (1): 91−101

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金磊, 周美丽, 王禄禄, 刘凯珍, 王立志
JIN Lei, ZHOU Mei-Li, WANG Lu-Lu, LIU Kai-Zhen, WANG Li-Zhi
不同能量代谢率的山羊瘤胃微生物结构与组成的差异性
Differences of microbial structure and composition in goat rumens with different energy metabolism efficiency
微生物学通报, 2018, 45(1): 91-101
Microbiology China, 2018, 45(1): 91-101
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170185

文章历史

收稿日期: 2017-03-03
接受日期: 2017-05-26
优先数字出版日期(www.cnki.net): 2017-06-29
不同能量代谢率的山羊瘤胃微生物结构与组成的差异性
金磊 , 周美丽 , 王禄禄 , 刘凯珍 , 王立志     
四川农业大学动物营养研究所    四川 雅安    625014
摘要【背景】 能量代谢率是衡量饲粮利用效率的一个重要组成部分,提高反刍动物对不同营养物质所含能量的消化代谢率,有助于提高反刍动物对能量的利用效率。【目的】 通过高通量测序技术比较不同能量代谢率的山羊瘤胃微生物结构与组成的差异。【方法】 以19只山羊作为试验动物,通过代谢试验和呼吸测热试验筛选出高能量代谢率表型组(HEU)和低能量代谢率表型组(LEU)山羊各5只。分别采集HEU、LEU组每只山羊瘤胃内容物,提取微生物总DNA,用细菌通用引物对细菌16S rRNA基因的高可变区进行PCR扩增,利用Illumina MiSeq平台对扩增子进行高通量测序,并用QIIME等软件对测序序列进行生物信息学分析。【结果】 拟杆菌门(44.20%±9.39%)、厚壁菌门(16.40%±5.44%)和变形菌门(11.30%±7.42%)在两组山羊瘤胃微生物中均为优势菌门,其中厚壁菌门是两组中共享的优势菌门。LEU组(6.71%±2.47%)中芽孢杆菌纲相对丰度显著高于HEU组(P < 0.05)。两组相对丰度最高的目均为乳酸杆菌目,LEU组(4.98%±1.88%)乳酸杆菌目相对丰度显著高于HEU组(P < 0.05)。在科水平,有7个科的相对丰度在组间差异性显著(P < 0.05)。拟杆菌科在两组中均为相对丰度最高的科,LEU组(3.64%±1.32%)拟杆菌科的相对丰度显著高于HEU组(P < 0.05)。在属水平,有9个属的相对丰度在组间差异性显著(P < 0.05)。HEU组(0.61%±0.36%)仅有普雷沃氏菌属的相对丰度显著高于LEU组(0.16%±0.07%),其他8个属的相对丰度均显著低于LEU组(P < 0.05)。其中瘤胃球菌属在HEU组(2.53%±0.62%)和LEU组(4.19%±1.43%)中均为相对丰度最高的属。【结论】 不同能量代谢率的山羊瘤胃微生物结构与组成存在显著性差异。
关键词山羊     能量代谢率     Illumina MiSeq     微生物    
Differences of microbial structure and composition in goat rumens with different energy metabolism efficiency
JIN Lei, ZHOU Mei-Li, WANG Lu-Lu, LIU Kai-Zhen, WANG Li-Zhi     
Animal Nutrition Institute, Sichuan Agricultural University, Ya'an, Sichuan 625014, China
Received: March 03, 2017; Accepted: May 26, 2017; Published online (www.cnki.net): June 29, 2017
Foundation item: International Science and Technology Cooperation Program of China (2013HH0043)
*Corresponding author: WANG Li-Zhi, E-mail:wanglizhi08@aliyun.com.
Abstract: [Background] Energy metabolism efficiency was an important component of measuring the utilization rate of the diet. Improving the digestion and metabolism efficiency of the energy contained in different nutrients by ruminants was helpful to improve the energy use efficiency of ruminants. [Objective] The objective of this study was to compare the structure and composition of ruminal microbiome of goats with different energy metabolism efficiency using Illumina MiSeq sequencing technology. [Methods] In total 19 goats were used as experimental animals, among them 5 goats with high energy metabolism efficiency were selected as HEU group and 5 goats with low energy metabolism efficiency as LEU group. Rumen fluid from each goat of HEU and LEU was collected and then total genomic DNA was extracted from the rumen fluids. High variable region of bacterial 16S rRNA genes was amplified by PCR using bacterial universal primers. Analyzing amplicon sequence data on the Illumina MiSeq sequencing platform and biological information analysis using QIIME software were done. [Results] Bacteroidetes (44.20%±9.39%), Firmicutes (16.40%±5.44%) and Proteobacteria (11.30%±7.42%) were the dominant bacteria in the rumen microorganisms of goats, among them Firmicutes was the dominant bacteria shared by the two groups. The relative abundance of Bacilli from LEU group (6.71%±2.47%) was significantly higher than that from HEU (P < 0.05). The relative abundances of Lactobacillales of the two groups were the highest at the order level, and the relative abundance from LEU (4.98%±1.88%) was significantly higher than that from HEU (P < 0.05). At the family level, the relative abundances of 7 families were significant differences in the two groups (P < 0.05). The relative abundance of Bacteroidaceae was highest in the two groups, and Bacteroidaceae from group LEU (3.64%±1.32%) was significantly higher than that of group HEU (P < 0.05). At the genus level, the relative abundances of 9 genus were significant differences (P < 0.05). Only the relative abundance of Prevotella sp. from HEU (0.61%±0.36%) was higher than that in LEU (0.16%±0.07%), but the relative abundances of other 8 genus were significantly lower than LEU (P < 0.05). The relative abundance of Ruminococcaceae sp. was the highest in HEU group (2.53%±0.62%) and LEU (4.19%±1.43%). [Conclusion] There are significant differences about structure and composition of rumen microorganisms among goats with different energy metabolism rate.
Key words: Sheep     Energy metabolism efficiency     Illumina MiSeq     Microorganism    

能量是动物体内一切生产和代谢活动的基础,要提高反刍动物对能量的利用效率,关键是提高它们对不同营养物质所含能量的消化代谢率[1]。瘤胃是反刍动物各种营养物质消化代谢的重要场所,其中的瘤胃微生物在营养物质消化代谢过程中发挥着重要作用。饲料中的三大供能物质(碳水化合物、蛋白质、脂肪)在瘤胃的消化直接影响宿主对饲料能量的利用效率,尤其是饲料中的碳水化合物和蛋白质,70%以上的消化代谢发生在瘤胃,而瘤胃的消化完全依赖于微生物的消化。已有的研究表明,瘤胃微生物在营养物质的消化过程中有着明确的分工。例如,参与纤维素消化的微生物主要有产琥珀酸丝状杆菌、溶纤维丁酸弧菌和瘤胃球菌属等[2];参与淀粉消化的微生物主要有普雷沃氏菌属、嗜淀粉瘤胃杆菌等[3];参与蛋白质消化的微生物主要有普雷沃氏菌属、溶纤维丁酸弧菌等[4]。不同微生物消化营养素以及能量利用的效率存在差异。因此,反刍动物瘤胃微生物的结构和组成与宿主对饲料能量的代谢效率密切相关。以往受研究技术的限制,研究者采用传统的培养技术[5]和小规模测序技术[6]仅明确了小部分瘤胃微生物在能量物质消化利用中的作用,但全面揭示宿主能量代谢率与瘤胃微生物结构与组成关系的研究还未见报道。针对这一问题,本研究拟从遗传背景相同的山羊群体中,通过代谢试验和呼吸测热试验筛选出能量代谢率不同的山羊,采用高通量测序技术比较不同能量代谢率的山羊瘤胃微生物结构与组成的差异性。研究结果将促进人们更清晰地认识瘤胃微生物与宿主能量代谢效率之间的关系,为通过调控瘤胃微生物区系来改善山羊的能量利用效率提供试验依据。

1 材料与方法 1.1 试验动物与饲粮

选取19只遗传背景一致、年龄1.5岁、平均体重41.60±2.63 kg、阉割的肉用波尔山羊公羊作为试验动物。整个试验期试羊单笼饲养、自由饮水。饲粮的配制参照National research council (NRC)肉羊饲养标准(2007)和中国肉羊饲养标准(2004),饲粮配方和营养水平见表 1。每日饲料(干物质)按体重3.5%限制饲喂。

表 1 饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 The composition and nutritional ingredient of the diet (dry matter basis)
项目Items 含量Content (%)
原料Ingredients
    苜蓿草粉Alfalfa meal 34.00
    稻草Rice straw 36.00
    玉米Corn 2.80
    大米Rice 8.40
    豆粕Soybean meal 4.90
    小麦麸Wheat bran 12.90
    预混料Premix1 0.50
    食盐NaCl 0.50
营养水平Nutrition levels2
    代谢能Metabolic energy (MJ/kg) 8.10
    粗蛋白质Crude protein 10.63
    粗纤维Crude fiber 24.55
    钙Calcium 0.95
    总磷Total phosphorus 0.35
注:1:预混料是由同一类的多种添加剂或不同类的多种添加剂按一定配比制作而成的匀质混和物,预混料为每千克饲粮提供:Fe 30 mg,Cu 10 mg,Zn 50 mg,Mn 60 mg,VA 2 937 IU,VD 343 IU,VE 30 IU. 2:营养水平是指饲粮中营养成分的含量,代谢能为计算值,其余为实测值.
Note: 1: Premix is a homogeneous mixture made from a variety of additives of the same class or a variety of additives of different kinds according to a certain proportion, Premix provides the following per kg of the diet: Fe: (as ferrous sulfate) 30 mg, Cu: (as copper sulfate) 10 mg, Zn: (as zinc sulfate) 50 mg, Mn: (as manganese sulfate) 60 mg, VA: 2 937 IU, VD: 343 IU, VE: 30 IU. 2: Nutrition level refers to the content of nutrients in the diet, ME is a calculated value and others are measured values.
1.2 试验设计与样品采集

整个试验期由14 d预饲期、6 d代谢试验期和2 d呼吸测热试验期组成。代谢试验期间山羊单笼饲养,每日收集山羊排泄的全部粪便和尿液,取粪和尿总量的10%,用10%盐酸固氮后贮存于−20。代谢试验结束后,将羊转入呼吸测热笼中,运用开放式呼吸测热系统测定每只山羊48 h氧耗量、CO2和CH4排放量。呼吸测热试验结束的次日晨饲前1 h采用胃管法抽取山羊瘤胃内容物,主要过程为:将10 mm直径聚氯乙烯管连接到一个真空泵(7 mbar),用开口器打开羊的口腔,将聚氯乙烯管从羊口腔缓慢插入,直至瘤胃。打开真空泵电源,抽取瘤胃内容物,弃去混入大量唾液的初始瘤胃内容物,然后再抽取瘤胃内容物约50 mL装入充满氮气的样品袋中,置于冰上。反复拍打样品袋以确保固相微生物充分进入液相,然后用4层纱布过滤得到瘤胃液,编号分装后迅速将其贮存于−80用于提取微生物总DNA。计算19只山羊每个个体及群体平均的能量代谢率,计算公式:能量代谢率(%)=(总能−粪能−尿能−甲烷能)/总能×100[7]。将能量代谢率大于群体平均值+0.5倍标准差的5只山羊作为高能量代谢率表型组(High energy metabolism rate group,HEU),能量代谢率小于群体平均值−0.5倍标准差的5只山羊作为低能量代谢率表型组(Low energy metabolism rate group,LEU)。

1.3 主要试剂和仪器

QIAampH DNA提取试剂盒、PCR纯化和回收试剂盒,德国Qiagen公司;Nanodrop 8000原子分光光度计,澳大利亚Thermo Scientific公司;Taq DNA聚合酶,北京全式金生物技术有限公司。QuantiFluor™-ST Fluorometer,北京普洛麦格生物技术有限公司;PCR仪,美国ABI公司;Illumina MiSeq测序系统,上海美吉生物医药科技有限公司。

1.4 DNA提取

分别取各瘤胃液样品2 mL置于5 mL离心管中,加入1 mL ASL缓冲液,振荡混匀,用QIAampH DNA提取试剂盒提取瘤胃内容物中菌体总DNA,具体提取步骤参照试剂盒说明书进行。用1%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 8000原子分光光度计检测提取的DNA。提取的DNA送往上海美吉公司进行后续的PCR扩增及高通量测序。

1.5 PCR扩增和高通量测序

用细菌通用引物对515F (5′-GTGCCAGCMGC CGCGGTAA-3′)和806R (5′-GGACTACVSGGGTA TCTAAT-3′),以瘤胃内容物菌群总DNA为模板,针对细菌16S rRNA基因的V4区进行PCR扩增。PCR反应体系(50 μL):Taq酶(5 U/μL) 0.25 μL,10×Buffer 5.0 μL,dNTPs (10 mmol/L) 1.0 μL,引物(10 μmol/L)各1.25 μL,模板DNA (50 ng/μL) 1.0 μL,补ddH2O至50 μL。PCR反应条件:95 2 min;95 30 s,55 30 s,72 30 s,循环30次;72 5 min。

PCR产物用含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,并用PCR纯化试剂盒纯化和回收。回收的PCR产物用QuantiFluor™-ST fluorometer定量。送上海美吉生物医药科技有限公司,利用Illumina MiSeq测序平台构建文库及MiSeq测序。

构建文库过程:连接“Y”字形接头;使用磁珠筛选去除接头自连片段;利用PCR扩增进行文库模板的富集;氢氧化钠变性,产生单链DNA片段。

MiSeq测序流程:DNA片段的一端与引物碱基互补,固定在芯片上;另一端随机与附近的另一个引物互补,也被固定住,形成“桥”;PCR扩增,产生DNA簇;DNA扩增子线性化成为单链;加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP,每次循环只合成一个碱基;用激光扫描反应板,读取每个模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类;将“荧光基团”和“终止基团”化学切割,恢复3′端粘性,继续聚合第2个核苷酸;统计每轮收集到的荧光信号结果,获知模板DNA片段的序列。

1.6 数据统计分析

试验测序得到的原始数据以Fastq文件格式保存,先用QIIME 1.8.0软件[8]对原始数据进行初次质控,去除序列平均碱基质量值< Q20、未知碱基数 > 6及同聚物太大的序列,只保留240−500 bp长度的序列。去除Barcode和引物序列,然后用Mothur[9]拼接质控后的序列,再在QIIME软件中按照序列相似性大于97%的标准,使用Uclust[10]聚类算法将序列聚类为OTU (Operational taxonomic units),从中挑选出每个OTU的相对丰度最高的序列作为代表序列。利用PyNAST法[11],将代表序列与基因数据库(Green genes)中的参考序列进行比对,用QIIME软件剔除嵌合体和Singletons,并使用RDF分类器[12]对代表序列从门到属进行物种注释。基于OTU table和rep_set. tree文件及抽样的最大深度,绘制OTU稀释曲线并比较α多样性指数的组间差异性;结合各个样品的OTU种类及其丰度进行计算,获得样品间Unweighted unifrac距离矩阵,并利用加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析,然后绘制PCoA聚类图;根据属水平上物种的结构和组成,用R x64 3.0.2软件绘制核心菌群的聚类热图。用SPSS 18.0软件,对HEU和LEU组山羊菌群相对丰度的差异性进行独立性样本t检验,以P < 0.05表示差异显著,P < 0.01表示差异极显著,结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析 2.1 不同能量代谢率的山羊对饲粮营养物质的消化

19只山羊对饲粮的平均能量代谢率为48.91%±2.67%,变异系数(CV)为5.46。由表 2可知,HEU组的DM、OM和CP的表观消化率极显著(P < 0.01)高于LEU组,NDF的表观消化率显著(P < 0.05)高于LEU组,EE和ADF的表观消化率在组间差异不显著(P > 0.05)。

表 2 饲粮营养物质的表观消化率 Table 2 Apparent digestibility of dietary nutrients (%)
项目Items HEU (n=5) LEU (n=5)
干物质Dry matter (DM) 59.75±1.06 55.99±1.27
有机物Organism (OM) 62.67±1.66 58.56±1.50
粗脂肪Crude fat (EE) 75.25±9.47 71.27±5.56
粗蛋白Crude protein (CP) 66.09±1.89 61.13±0.72
酸性洗涤纤维
Acid detergent fiber (ADF)
55.73±6.20 48.73±11.91
中性洗涤纤维
Neutral detergent fiber (NDF)
58.59±1.87 54.00±3.31
注:同行数据无字母表示差异不显著(P > 0.05),不同小写字母表示差异显著(P < 0.05),不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01).下同.
Note: In the same row, values with no letter superscripts mean no significant difference (P > 0.05); while with different small letter superscripts mean significant difference (P < 0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P < 0.01). The same as below.
2.2 不同能量代谢率的山羊对饲粮能量的代谢

表 3可知,HEU组的GE、DE和ME极显著(P < 0.01)高于LEU组,FE极显著(P < 0.01)低于LEU组;HEU组的DE/GE、ME/GE极显著(P < 0.01)高于LEU组,FE/GE极显著(P < 0.01)低于LEU组,其他指标在组间差异不显著(P > 0.05)。

表 3 HEU和LEU组山羊对饲粮能量的代谢 Table 3 Dietary energy metabolism of goats in high and low energy utilization capacity group
项目Items HEU (n=5) LEU (n=5)
能量的采食和排泄Energy intake and output (MJ/d)
  总能Gross energy (GE) 18.39±0.16A 18.04±0.19B
  粪能Fecal energy (FE) 7.06±0.44A 7.93±0.24B
  尿能Urine energy (UE) 0.46±0.11 0.50±0.09
  甲烷能Methane energy (ECH4) 1.26±0.16 1.17±0.16
  消化能Digestible energy (DE) 11.33±0.47A 10.12±0.19B
  代谢能Metabolic energy (ME) 9.55±0.45A 8.37±0.25B
能量利用率Energy utilization (%)
DE/GE 61.62±2.39A 56.07±1.12B
ME/GE 51.94±2.43A 46.40±1.21B
FE/GE 38.38±2.39A 43.93±1.12B
UE/GE 2.50±0.58 2.79±0.52
ECH4/GE 6.85±0.86 6.51±0.94
2.3 不同能量代谢率的山羊瘤胃微生物多样性分析

2.3.1 样品序列及OTU统计

测序共获得602 481条有效序列,平均每个样品含有60 248±23 334条序列。基于相似性大于97%的原则,将获得的有效序列进行聚类,共获得19 526个OTU,不考虑处理效应,平均每个样品含5 181±1 014个OTU。其中HEU组有10 726个OTU,LEU组11 243个,两组间共享的OTU有2 443个(图 1)。经计算,HEU组和LEU组的序列覆盖度(Coverage)分别为77.22%和78.27%。

图 1 OTU维恩图 Figure 1 OTU venn diagram

样品稀释曲线如图 2所示,在试验的测序深度下,各条曲线最终均趋于平缓,说明试验的测序量足以覆盖各样品的大多数微生物。在相同测序深度下,OTU数由高到低的HEU组内样品依次为HEU2、HEU1、HEU5、HEU4和HEU3,而LEU组内各样品OTU数由高到低分别为LEU2、LEU5、LEU3、LEU4和LEU1。

图 2 各样品的稀释曲线 Figure 2 Rarefaction curves of each sample

2.3.2 Alpha多样性分析

表 4列出了HEU组和LEU组样品的PD_whole_tree指数、Chao1指数和Shannon指数,Alpha多样性指数主要用于评价样品中微生物的丰富性和均匀性。由表 4可以看出,在同一测序深度下(16 501条序列),LEU组的Alpha多样性指数在数值上均大于HEU组,但差异不显著(P > 0.05)。

表 4 组间α多样性指数的差异性比较 Table 4 Comparison of alpha diversity indices between groups
α多样性指数
Alpha diversity indices
HEU (n=5) LEU (n=5)
    PD_whole_tree 203.42±14.26 218.05±6.87
    Chao1 5 251.32±486.57 5 526.24±267.18
    Shannon 8.45±0.45 8.60±0.41

2.3.3 Beta多样性分析

根据样本OTU的种类及其相对丰度,通过计算各个样本间加权遗传距离矩阵绘制PCoA聚类图。由图 3可知,HEU组的样品依据所处组别而相互聚类到一起,表明HEU组内相似性比组间相似性高;LEU组样品并没有依据其组别而表现出明显的组内聚集。HEU组组内个体聚集度相对高于LEU组,说明HEU组组内个体间微生物结构与组成的相似性高于LEU组。

图 3 Principal coordinate analysis聚类分析 Figure 3 Cluster analysis by principal coordinate analysis

2.3.4 不同分类水平上的物种组成分析

将试验所得有效序列在不同分类水平上进行物种注释和统计,结果表明,在门水平上共注释得到48个菌。厚壁菌门(Firmicutes,16.40%±5.44%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,44.20%±9.39%)和变形菌门(Proteobacteria,11.30%±7.42%)在两组中均为优势菌门,其在HEU组和LEU组中的相对丰度依次为13.59%±2.36%、45.27%±8.17%、10.35%±9.11%和19.00%±6.25%、42.59%±11.11%、12.46%±6.29%。厚壁菌门是两组中共享的优势菌门。两个处理组中,相对丰度大于0.1%的门共有19个,在组间的差异性均不显著(P > 0.05),其在门水平上的菌群组成见图 4

图 4 门水平上的菌群组成 Figure 4 Composition of microbial at phylum level

在纲水平上共注释得到150个菌,相对丰度大于0.1%的有34个,HEU组芽孢杆菌纲(Bacilli)相对丰度显著低于LEU组(P < 0.05)。在目水平上共注释得到300个菌,相对丰度大于0.1%的菌有47个。其中,HEU组中隶属于厚壁菌门(Firmicutes)的乳酸杆菌目(Lactobacillales)、芽孢杆菌目(Bacillales)和嗜酸菌门下的RB41目的相对丰度均显著低于LEU组(P < 0.05) (表 5)。

表 5 HEU和LEU组从纲到属水平上相对丰度差异性显著的菌群分布 Table 5 Distribution of microbes whose relative abundance is significant different between HEU and LEU from class to genus level (%)
分类单元Taxa 相对丰度Relative abundance P value
HEU (n=5) LEU (n=5)
纲Class Bacilli 2.83±1.38 6.71±2.47 0.015
目Order Lactobacillales 2.17±1.09 4.98±1.88 0.020
Bacillales 0.65±0.34 1.72±0.73 0.018
RB41 0.15±0.11 0.29±0.15 0.031
科Family Enterobacteriaceae 1.27±0.44 2.43±0.86 0.027
Bacillaceae 0.51±0.26 1.57±0.73 0.016
Clostridiaceae 0.18±0.04 0.27±0.05 0.020
Sinobacteraceae 0.08±0.04 0.21±0.09 0.018
Shewanellaceae 0.07±0.04 0.24±0.12 0.035
Lactobacillaceae 0.71±0.59 2.23±1.11 0.020
Bacteroidaceae 1.84±0.60 3.64±1.32 0.025
属Genus *Enterococcaceae (Other) sp. 1.13±0.38 2.15±0.75 0.025
Lactobacillus sp. 0.71±0.59 2.23±1.02 0.020
Bacillus sp. 0.49±0.25 1.49±0.71 0.018
Clostridium sp. 0.09±0.04 0.15±0.04 0.043
*Ruminococcaceae sp. 2.53±0.62 4.19±1.43 0.044
Shewanella sp. 0.07±0.04 0.24±0.12 0.035
Bacteroides sp. 0.75±0.27 1.43±0.52 0.031
*Bacteroidaceae sp. 0.46±0.19 1.11±0.45 0.017
(Prevotella) sp. 0.61±0.36 0.16±0.07 0.027

在科水平上,共注释得到300个菌,相对丰度大于0.1%的有47种。共有7个科的相对丰度在组间存在显著性差异(P < 0.05),详见表 5。其中厚壁菌门下有4个科存在较大的组间差异性,HEU组中肠球菌科(Enterococcaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)和梭菌科(Clostridiaceae)的相对丰度显著低于LEU组(P < 0.05)。

属水平上共注释得到857种菌,限于属种类多且部分属的相对丰度较低,几乎没有研究价值或培养技术等的限制无法对其功能进行研究,因而仅对相对丰度大于0.1%的69个属进行多样性研究。分析得知,共有9个属的相对丰度在组间存在显著性差异(P < 0.05),详见表 5。其中HEU组中厚壁菌门下的5个属[肠球菌科的Other属、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、梭菌属(Clostridium sp.)和*Ruminococcaceae sp.]、隶属于变形菌门(Proteobacteria)的希瓦氏菌属(Shewanella sp.)和拟杆菌门的2个属[拟杆菌属(Bacteroides sp.)和*Bacteroidaceae sp.]共8个属的相对丰度均显著低于LEU组,HEU组(0.61%±0.36%)仅有属于拟杆菌门的普雷沃氏菌属[(Prevotella) sp.]相对丰度显著(P < 0.05)高于LEU组(0.16%±0.07%)。

2.3.5 共享属分析

HEU组和LEU组组间共有69个共享属,相对丰度大于0.5%的共享属有30个,占共享属总菌群相对丰度的84.54%,针对30个共享属绘制聚类热图。由图 5可知,除LEU3和HEU1外,其他各个样品依据所处组别的不同而相互聚类到一起,表明组内共享菌群相似性比组间高。由系统发育树可以看出,HEU组中HEU3和HEU4聚为一簇,LEU组中LEU1和LEU5聚为一簇,它们的菌群相似性相对高于同组内其他样品。整体上,共享属的相对丰度在各个样品间存在较大差异。

图 5 共享菌群在属水平上的聚类热图 Figure 5 Log-scaled percentage heatmap of bacteria community structure at the shared-genus level 注:越偏红色表示相对丰度越高,越偏蓝色表示丰度越低.对于不能分类到属水平,但仍然出现在各样品中的共享序列,用其最高分类水平表示. Note: The closer to red, the higher of their relative abundance, while the closer to blue, the lower of their relative abundance. The shared sequences, which could not be classified to any genus but still existed in samples, were expressed using the highest classification level that can be assigned to them.
3 讨论

以往研究表明,反刍动物的能量代谢效率主要受饲粮精粗比、饲草种类、饲料添加剂等因素的影响[13-16]。但本试验结果表明,即使饲喂同一饲粮并且遗传背景相同的山羊,其能量代谢率也存在显著的个体差异。这在以往的研究中还未见正式的报道。但前人的研究曾发现,给具有相同遗传背景的肉牛提供相同饲粮时,肉牛对饲粮的利用效率存在显著的个体差异[17];这种现象在猪、禽的研究中也有相关报道[18-19],这说明饲粮利用效率的个体差异现象是普遍存在的。因此,能量代谢率作为衡量饲粮利用效率的一个重要因素,其存在显著的个体差异也应该是一种正常现象。

在本研究中,HEU组山羊能量的代谢率极显著高于LEU组。通过能量代谢分析发现,导致HEU组能量代谢率较高的原因主要是由于HEU组粪能极显著低于LEU组,这就意味着导致两组山羊能量代谢率出现差异的原因是HEU组山羊提高了对饲粮能量的消化率。进一步分析发现,HEU组山羊能量消化率的提高主要是由饲粮中粗蛋白质和中性洗涤纤维等有机物消化率的提高贡献的。对于反刍动物而言,瘤胃是其营养物质消化利用的主要场所,饲粮中70%以上的蛋白质和纤维是在瘤胃中被消化的。反刍动物瘤胃自身不能分泌消化酶,营养物质在瘤胃中的消化完全依赖于其中共生的微生物。因此,导致本研究中两组山羊能量代谢率出现差异的根本原因可能是由于瘤胃微生物结构与组成的差异造成的。根据这个思路,我们采用高通量测序技术对比了两组山羊瘤胃微生物的差异。

本研究发现,LEU组山羊瘤胃内乳酸杆菌属(Lactobacillus sp.)的相对丰度显著高于HEU组。以往的研究发现,瘤胃内乳酸杆菌的相对丰度与瘤胃乳酸的浓度呈正相关[20],而瘤胃内乳酸的浓度又与瘤胃的功能密切相关。瘤胃内乳酸浓度过高会导致瘤胃微生物菌群失衡、反刍停滞、瘤胃酸中毒等,而且会降低瘤胃对营养物质的消化利用效率[21-22]。LEU组有机物消化率低的原因,可能正是与其瘤胃中过高的乳酸杆菌丰度有关。但本研究没有检测瘤胃乳酸的浓度,这种推测正确与否还需要进一步研究证实。

前人研究认为,瘤胃球菌属(Ruminococcaceae sp.)是瘤胃中主要的纤维降解菌,该属所含的白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌能分泌大量的纤维素酶和半纤维素酶[23-24],其丰度的提高能显著促进瘤胃内营养物质的消化利用。但是,本研究中HEU组山羊对饲粮中性洗涤纤维的消化率显著高于LEU组,瘤胃球菌属的相对丰度却显著低于LEU组,这与以往人们的认识不一致。造成这种差异的原因,可能是因为以往研究瘤胃微生物只能采用纯培养技术和小规模测序技术,由于技术的限制,瘤胃球菌属在纤维中降解的作用被过分夸大了。因为瘤胃中的纤维降解菌除瘤胃球菌外,还有产琥珀酸丝状杆菌、溶纤维丁酸弧菌和梭菌等。已有大量研究表明,瘤胃球菌属的相对丰度在瘤胃微生物中仅占很小的比例[5, 25],并且Kobayashi等[26]通过实时定量PCR分析发现最主要的纤维降解菌是产琥珀酸丝状杆菌,而不是瘤胃球菌。

本研究中HEU组山羊的能量消化率显著高于LEU组,还可能与其瘤胃中普雷沃菌属(Prevotella sp.)的相对丰度较高有关。Avguštin等[27]研究表明,普雷沃菌属主要包括布氏普雷沃氏菌、短普雷沃氏菌和栖瘤胃普雷沃氏菌,普雷沃菌属虽然不能降解纤维素,但其中的栖瘤胃普雷沃氏菌却是瘤胃中主要的蛋白降解菌之一;布氏普雷沃氏菌和栖瘤胃普雷沃菌均能降解淀粉、木聚糖等营养物质[28];短普雷沃氏菌能以葡萄糖、乳糖和纤维二糖等作为发酵底物[27]。由此可见,反刍动物瘤胃内的普雷沃菌属对多种营养物质的降解都有着极其重要的作用。可能正是因为HEU组山羊瘤胃内的普雷沃菌属丰度较高,提高了饲粮中蛋白质、淀粉和半纤维素等有机物的消化率,从而提高了HEU组山羊的能量消化率。

本研究发现厚壁菌门(Firmicutes)在两组山羊瘤胃中均为优势菌门。研究表明,动物胃肠道中厚壁菌门的相对丰度与饲粮中干草含量呈显著正相关[29]。本研究的山羊饲粮中含有大量的苜蓿草粉和稻草,这可能是导致厚壁菌门是两组山羊瘤胃中共有的优势菌门的重要原因。以往的研究还发现,拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)在很多草食动物胃肠道微生物中均为优势菌门[30-33],这与本研究结果一致。

4 结论

能量代谢率不同的两组山羊瘤胃微生物,在门水平上,拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门在两组山羊瘤胃微生物中均为优势门,厚壁菌门是两组共有的优势菌门;从纲到属水平,有1个纲3个目7个科和9个属在组间差异性显著;在组间差异显著的菌群中,HEU组仅有普雷沃氏菌属的相对丰度显著高于LEU组,其他菌群相对丰度均显著低于LEU组。

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