微生物学通报  2018, Vol. 45 Issue (1): 71−80

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王霏, 王绍琛, 曹明明, 冯治洋
WANG Fei, WANG Shao-Chen, CAO Ming-Ming, FENG Zhi-Yang
土壤微生物中新型β-葡萄糖苷酶的挖掘与鉴定
A novel β-glucosidase from soil microbes
微生物学通报, 2018, 45(1): 71-80
Microbiology China, 2018, 45(1): 71-80
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170153

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收稿日期: 2017-02-27
接受日期: 2017-05-17
优先数字出版日期(www.cnki.net): 2017-06-27
土壤微生物中新型β-葡萄糖苷酶的挖掘与鉴定
王霏 , 王绍琛 , 曹明明 , 冯治洋     
南京农业大学食品科技学院    江苏 南京    210095
摘要【背景】 通过培养微生物来获得新β-葡萄糖苷酶因只有少部分微生物可以被培养而受到限制,但宏基因组学技术可以挖掘非培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶资源。【目的】 利用宏基因组学技术挖掘土壤微生物来源的新型β-葡萄糖苷酶,并对其酶学性质进行初步分析。【方法】 构建土壤微生物的宏基因组文库,利用七叶苷平板显色法对所构建的文库进行筛选获得阳性克隆,并对阳性克隆所含的β-葡萄糖苷酶基因进行异源表达和生物化学特性分析。【结果】 通过筛选文库中的62万个克隆,获得一个具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆,其插入片段中包含一个2 301 bp的ORF (YNBG3),蛋白同源性分析显示其属于β-葡萄糖苷酶第三家族。对YNBG3酶的生化分析确定其最佳反应温度为53 ℃,最适pH为5.2,有较好的热稳定性,对一定浓度范围内的DMSO、丙酮、乙醇等有机试剂有较好的耐受性,EDTA和尿素可增加该酶的活性。【结论】 利用宏基因组学技术获得了一个有较好热稳定性及耐受一定浓度有机试剂和尿素的新β-葡萄糖苷酶。
关键词基因组学     功能性筛选     β-葡萄糖苷酶     酶学性质    
A novel β-glucosidase from soil microbes
WANG Fei, WANG Shao-Chen, CAO Ming-Ming, FENG Zhi-Yang     
College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu 210095, China
Received: February 27, 2017; Accepted: May 17, 2017; Published online (www.cnki.net): June 27, 2017
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (31370088)
*Corresponding author: FENG Zhi-Yang, Tel: 86-25-84399511; E-mail: zfeng@njau.edu.cn.
Abstract: [Background] Only a small proportion of microbes can be cultured in laboratories, thereby hampering the discovery of novel β-glucosidases from microbes. Novel microbial β-glucosidases can be discovered using culture-independent metagenomic approach. [Objective] Discovery of new β-glucosidase from soil microbes by metagenomic technology. [Methods] Screening a metagenomic library on esculin-containing Luria-Bertani agar plates and the putative β-glucosidase gene derived from the active clone was heterologously expressed for characterization. [Results] We found a β-glucosidase active clone by screening 620 000 clones in the library and an ORF (YNBG3) whose product is homologous with the third family of β-glucosidase was identified from the active clone. YNBG3 was heterologously expressed and characterized. Its optimum pH is 5.2, and optimal temperature is 53
Key words: Metagenomics     Functional screening     β-glucosidase     Enzymatic properties    

土壤中包含的多种多样的微生物是现代工业酶类的重要来源,微生物酶是通过微生物的分离、培养和发酵来获得的。然而微生物分子生态学研究表明,利用传统的纯培养技术仅有极少数的微生物可被培养,而超过99%的非培养性微生物才是土壤微生物多样性的主体[1],这极大地限制了实验室条件下对微生物资源的研究与利用。20世纪末Handelsman等提出的宏基因组学方法有效地解决了这一重大难题[2]。宏基因组学是以环境中全部微生物的基因组为研究对象,研究特定环境中所有微生物的生态结构和遗传表达的方法[3-4]。通过构建宏基因组文库,将微生物基因克隆到合适的载体上,再在宿主中进行功能表达,可以极大地开发非培养性微生物的基因资源[5-7]

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21,Beta-glucosidase),是纤维素分解酶系中一类重要的水解酶类[8-11],又名龙胆二糖酶、纤维二糖酶。β-葡萄糖苷酶能够催化水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键,同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。但纤维素酶组分中该酶含量最少、活力普遍较低,因此增加β-葡萄糖苷酶活性会有效提高纤维素酶解效率[12-13]。此外,β-葡萄糖苷酶在食品风味的改善[14]、植物防御[15]、疾病的检测[16]和生产制造业[17-18]等方面具有重大的应用价值。β-葡萄糖苷酶存在于细菌和真菌等微生物中[19-20],而宏基因组学方法可极大限度地挖掘土壤中的微生物资源,因此可成为挖掘具有优良特性的新型β-葡萄糖苷酶的有力工具。

宏基因组学技术可以挖掘非培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶资源,并可利用生长在不同环境中的微生物获得具有不同酶学特性优势的β-葡萄糖苷酶,如从动物肠道宏基因组文库中获得活性高且有较宽pH耐受性的β-葡萄糖苷酶[21],从海洋微生物宏基因组文库中获得具有明显耐盐和耐热特性的β-葡萄糖苷酶[22-23]。从宏基因组文库中挖掘到的β-葡萄糖苷酶与已知酶同源性较低,通常为新型酶。

本研究通过筛选云南土壤宏基因组文库中的62万个克隆,获得了一个具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆。通过构建阳性克隆插入片段亚克隆获得了一个β-葡萄糖苷酶功能基因,将该基因进行异源表达后获得了功能蛋白YNBG3。进而研究了YNBG3的最适pH、最适反应温度、耐盐性、葡萄糖耐受性,以及对不同有机溶剂、金属离子等的耐受性,为性质优异新型酶的发现研究提供参考。

1 材料与方法 1.1 实验材料

1.1.1 菌株和载体

E. coli EPI100、pWEB-TNCTM Cosmid Cloning Kit试剂盒,Epicentre公司;pTG-19T载体,上海捷瑞生物工程有限公司;pET-30a(+)载体和E. coli BL21(DE3)由本课题组保存。

1.1.2 主要试剂和仪器

Sau3A I、BamH I、Nde Ⅰ、Xho Ⅰ、CIAP、T4 DNA Ligase、Pfu DNA聚合酶,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;质粒提取试剂盒TIANpure Mini Plasmid Kit II和琼脂糖凝胶回收试剂盒TIANgel Midi Purification Kit,天根生化科技(北京)有限公司;4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPG),上海瑞永生物技术有限公司;柠檬酸铁铵、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠,生工生物工程(上海)股份有限公司;七叶苷,上海麦克林生化科技有限公司;氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素,上海捷瑞生物有限公司;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠,南京化学试剂有限公司。Multiskan FC型酶标仪,Thermo Scientific公司;FA2004N型精密天平,上海民桥精密科学仪器有限公司;Tpersonal型PCR仪,珠海黑马医学仪器有限公司。

1.1.3 LB培养基(g/L)

胰蛋白胨10.0,酵母提取物5.0,氯化钠10.0,pH 7.0;需要时添加氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素分别至100、15、30 mg/L;筛选培养基为固体LB培养基添加0.1%七叶苷、0.25%柠檬酸铁铵。

1.2 实验方法

1.2.1 β-葡萄糖苷酶活性克隆的筛选

将文库菌稀释后涂布在筛选培养平板上,37 ℃培养3−5 d后观察产生黑色水解圈的阳性克隆。将阳性克隆挑取后划线培养,再次在选择性平板上验证活性,验证正确的单克隆应用天根质粒提取试剂盒提取质粒。

1.2.2 亚克隆制备

用稀释1 000倍终浓度为0.01 U/μL的Sau3A Ⅰ限制性内切酶对产β-葡萄糖苷酶的文库质粒进行不完全酶切。随后琼脂糖凝胶电泳检测,将2−4 kb之间的酶切DNA产物进行切胶回收,回收的DNA片段与经BamH Ⅰ酶切的pWEB-TNC载体连接,连接产物电转化后涂布在筛选平板上,再次筛选具有β-葡萄糖苷酶活性的亚克隆菌株。对亚克隆中所含质粒的插入片段进行测序,并进行BLASTx比对分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov),获得β-葡萄糖苷酶的基因序列。

1.2.3 构建重组表达质粒

扩增β-葡萄糖苷酶基因YNBG3的引物为:

YNBG-F:5′-GGAATTCCATATGAGCAAGCT CAGAATTGCCCTC-3′;

YNBG-R:5′-CCGCTCGAGGCTTCTGGTCCG AGTAATCGA-3′。

上下游引物F、R下划线处表示Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点,粗体表示起始密码子。以重组质粒为模板,利用Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR反应体系(50 μL):ddH2O 35.0 μL,10×PCR缓冲液5.0 μL,dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 4.0 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2.0 μL,阳性亚克隆质粒(50 ng/μL) 1.5 μL,Pfu DNA聚合酶(2.5 U/μL) 0.5 μL。PCR条件:95 ℃ 3 min;94 ℃ 45 s,60 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,30个循环;72 ℃ 10 min。将PCR产物克隆至pTG-19T载体后,测序验证扩增产物序列。

将测序验证正确的重组质粒pTG-19T-YNBG3和pET-30a(+)表达载体进行Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切反应,用T4 DNA连接酶连接构建原核重组表达质粒pET-30a(+)-YNBG3。将pET-30a(+)-YNBG3电转化至制备好的E. coli EPI100克隆宿主中,验证正确后提取质粒再次电转化E. coli BL21 (DE3)表达宿主,进行后续诱导表达。

1.2.4 诱导表达蛋白及纯化

(1) 将含pET-30a(+)-YNBG3的重组菌划线至含卡那霉素的LB固体培养板上活化,挑取单克隆接种至对应抗性的液体培养基内,37 ℃、220 r/min培养过夜。(2)取400 μL过夜培养菌液转接至400 mL新鲜液体LB培养基内,37 ℃、220 r/min培养至菌体浓度OD600在0.6−0.8之间。(3)添加IPTG至终浓度为0.8 mmol/L,将温度、转速分别调至28 ℃、200 r/min后继续培养12 h诱导表达蛋白。

将诱导表达12 h的菌液12 000 r/min离心10 min,收集菌体沉淀。加入裂解液,超声破碎菌体20 min (6 mm超声探头,超声1.5 s,间隔2 s)后,离心取上清液。将上清液通过偶联镍离子的层析柱进行亲和纯化,5倍体积清洗液(NaCl 5.8 g,Tris 6.0 g,加800 mL蒸馏水溶解后调节pH至7.5,再加蒸馏水定容至1 000 mL)清洗后,利用洗脱液(含500 mmol/L咪唑的清洗液)将蛋白从柱上洗脱下来。根据预测的β-葡萄糖苷酶的蛋白分子量选择10%分离胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

1.2.5 酶反应体系

加入31 μg/mL的酶溶液和10 mmol/L的pNPG各10 μL到80 μL pH缓冲液中,在实验温度(20−80 ℃)反应10 min后,加入100 μL 1 mol/L的Na2CO3终止反应,测定OD405值。

1.2.6 确定YNBG3酶促反应的最适pH及pH对酶稳定性的影响

在50 ℃条件下,使用pH 3.0−11.0的缓冲液测定在不同pH条件下的酶活力,根据酶活值大小初步确定最适pH。缓冲液分别为50 mmol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0−6.0)、0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0−8.0)和50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0−11.0),初始pH为3.0−11.0,梯度设为1个pH单位,反应后得出酶的高活力pH范围。在此范围中,缩小pH梯度为0.2个pH单位,最终确定最适pH。

纯化的酶溶液用pH 4.0−7.0、梯度为1个pH单位的缓冲液稀释20倍,4 ℃放置4 h,在相同酶反应体系下测定剩余酶活力。每个反应4个平行,4个空白对照。

1.2.7 确定YNBG3酶促反应的最适温度及温度对酶稳定性的影响

在最适pH 5.2缓冲液体系下,加入31 μg/mL的酶溶液和10 mmol/L的pNPG各10 μL到80 μL缓冲液中,分别放置在20、30、40、50、60、70、80 ℃温度下反应10 min,加入100 μL 1 mol/L的Na2CO3终止反应,测定OD405值,以得出酶的高活力温度范围。再以42 ℃为起点,每隔2 ℃为一个温度梯度,测定不同温度下的酶活,确定最适温度。同时在相同反应体系下,将稀释20倍的纯酶溶液放置于40、50、60、70、80 ℃水浴中保温4 h,测定剩余酶活力。在随后的反应中,均在最适反应温度和最适条件下进行,每个反应4个平行,4个空白对照。

1.2.8 不同金属离子对YNBG3酶活的影响

反应体系内分别加入KCl、ZnCl2、MgCl2、CaCl2、NiCl2、FeCl2、FeCl3、LiCl、NaCl、ZnCl2、CoCl2、CuCl2、MnCl2金属离子溶液,使其在pH缓冲液中终浓度为1或10 mmol/L,在最适温度条件下检测金属离子对β-葡萄糖苷酶酶活的影响。以添加β-葡萄糖苷酶和金属离子作为实验组,添加金属离子而未加β-葡萄糖苷酶的反应体系作为空白对照,以添加β-葡萄糖苷酶而未加金属离子的反应酶活定为100%。

1.2.9 不同化合物对YNBG3酶活的影响

在反应体系中添加不同体积的DMSO、乙醇、EDTA、SDS等化合物,使其终浓度为1%、15%或30%,在最适温度和最适pH的条件下测定YNBG3酶活。以添加β-葡萄糖苷酶和化合物作为实验组,添加化合物而未加β-葡萄糖苷酶的反应体系作为空白对照,以添加β-葡萄糖苷酶而未加化合物的反应酶活定为100%。

1.2.10 葡萄糖对YNBG3的反馈抑制分析

β-葡萄糖苷酶水解β-1, 4-糖苷键生成葡萄糖和相应的配基,葡萄糖作为产物,对β-葡萄糖苷酶的活性会产生一定的反馈抑制作用,通过在反应体系中加入不同浓度的葡萄糖,测定葡萄糖对酶活力的影响。将酶与葡萄糖终浓度为0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L、pH 5.2的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液混合,4 ℃放置1 h后测定酶活,以未加入葡萄糖时的反应酶活定为100%。

1.2.11 YNBG3的耐盐性分析

在标准反应体系的基础上,加入NaCl溶液至终浓度为0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mol/L,测定酶活,以未添加NaCl溶液时反应酶活定为100%。

1.3 核苷酸序列登录号

YNBG3核苷酸序列在GenBank数据库中的登录号为KY654505。

2 结果与分析 2.1 阳性亚克隆目的基因序列分析

通过筛选已构建的云南土壤宏基因组文库[24]中的62万个克隆,在加了七叶苷和柠檬酸铁铵底物平板上得到一个产生黑色水解圈的克隆菌。经过亚克隆的筛选和序列分析发现了一个2 301 bp的ORF,其蛋白序列与来源于Cystobacter fuscus的β-葡萄糖苷酶(WP_002628458.1)具有58%的相似性,而与非培养菌株来源的某一β-葡萄糖苷酶(AGK74984.1)有80%的相似性。

将该β-葡萄糖苷酶YNBG3氨基酸序列和其它具有一定相似性的β-葡萄糖苷酶氨基酸序列构建近邻系统发育进化树(图 1)发现,参照β-葡萄糖苷酶家族分类标准[25],YNBG3可划分于β-葡萄糖苷酶第三家族。目前认为β-葡萄糖苷酶两个催化中心都含有酸性氨基酸Asp和Glu[26],而在第三家族成员中,则发现Asp为保守氨基酸。通过分析,YNBG3的保守氨基酸是Asp561

图 1 YNBG3的进化树分析 Figure 1 Neighbour-joining analysis of YNBG3 注:括号中的序号为不同来源酶的序列登录号;标尺指示遗传距离. Note: The numbers in parentheses indicate the accession numbers for different enzymes sequences; the scale bar represents the number of substitutions per site.
2.2 重组表达体系的构建与YNBG3的表达纯化

以阳性亚克隆重组质粒为模板,以YNBG3-F和YNBG3-R为引物进行PCR,扩增获得大小为2.3 kb的DNA片段(图 2),测序验证后与pET-30a(+)载体连接后获得pET-30a(+)-YNBG3,电转化至BL21(DE3)宿主菌中进行蛋白表达。

图 2 电泳检测YNBG3基因 Figure 2 Electrophoresis analysis of the PCR products of YNBG3 注:M:1 kb-Ⅲ DNA Marker;1、2:YNBG3 PCR产物. Note: M: 1 kb-Ⅲ DNA Marker; 1, 2: PCR product of YNBG3.

利用含pET-30a(+)-YNBG3的BL21(DE3)重组菌表达含有His-tag标签的YNBG3蛋白,用镍柱进行亲和分离纯化,SDS-PAGE电泳检测纯化后蛋白,其大小与之前按氨基酸组成预测加His-tag标签后的分子量84.7 kD大小相符(图 3)。

图 3 SDS-PAGE检测纯化的β-葡萄糖苷酶蛋白 Figure 3 SDS-PAGE detection of purified protein 注:1:纯化后蛋白;M:蛋白Marker. Note: 1: Purified protein; M: Protein Marker.
2.3 YNBG3酶促反应最适pH及pH对酶稳定性的影响

在pH 2.0−11.0条件下测定酶活性,发现pH 5.0时YNBG3具有较高的活性和稳定性,进一步缩小pH梯度后确定在pH 5.2的磷酸盐缓冲体系内酶活最高(图 4AB)。在pH 4.0、5.0、6.0、7.0的缓冲液条件下放置,其中pH 5.0−6.0时YNBG3放置4 h后仍能保持50%以上的酶活力,表明YNBG3在酸性条件下有良好稳定性(图 5)。

图 4 pH-活力曲线图 Figure 4 Effects of pH on activity of YNBG3 Note: A: pH 2.0−11.0; B: pH 4.6−6.6.

图 5 pH对酶的稳定性影响 Figure 5 Effects of pH on stability of YNBG3
2.4 YNBG3酶促反应最佳温度及其耐热性

在pH 5.2的磷酸盐缓冲体系下,分别检测20、30、40、50、60、70、80 ℃等温度下酶活,初步确定较高酶活温度范围是45−55 ℃。在45−55 ℃范围内以45 ℃为起点,每隔2 ℃为一个温度梯度,确定53 ℃时酶活最高,确定YNBG3最佳反应温度为53 ℃;在20−58 ℃范围内,酶活力随温度的升高而升高;过了60 ℃以后,酶活力会随着温度的升高急剧下降;到70 ℃几乎完全失活(图 6)。值得一提的是,该酶在50 ℃放置超过12 h以后,仍具有高于30%的酶活,具有较好的耐热性(图 7)。

图 6 温度-活力曲线图 Figure 6 Effects of temperature on activity of YNBG3 Note: A: 20−80 ℃; B: 45−57 ℃.

图 7 温度对酶稳定性的影响 Figure 7 Effects of temperature on stability of YNBG3
2.5 不同金属离子对YNBG3酶活的影响

在53 ℃、pH 5.2的磷酸盐缓冲液中,分别加入KCl、ZnCl2、MgCl2、CaCl2、NiCl2、FeCl2、FeCl3、LiCl、NaCl、CoCl2、CuCl2、MnCl2金属离子溶液,使其终浓度为1或10 mmol/L,在终浓度为1 mmol/L时,几乎所有的这些常见金属离子都表现出对酶活有一定的促进作用;而当终浓度为10 mmol/L时,发现Ca2+、Mg2+有明显的促进作用,而Zn2+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Mn2+则对酶活性表现出了抑制作用,但YNBG3酶活仍能保持在60%以上(图 8)。可见,YNBG3是不依赖于金属离子而又对常见金属离子有很好耐受性的酶。

图 8 不同金属离子对YNBG3酶活的影响 Figure 8 Effect of metal ions on activity of YNBG3
2.6 YNBG3对不同化合物的耐受性

在最适反应温度53 ℃、最适pH 5.2的磷酸盐缓冲条件下,在反应体系中添加DMSO、乙醇、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、尿素、SDS和EDTA,使其终浓度分别为1%、15%和30%,测定了不同反应条件下的酶活力。结果如图 9所示,SDS作为蛋白质的强力变性剂,在1%条件下,YNBG3仅剩60%的活性,当浓度到15%时,YNBG3完全失活;而作为蛋白变性剂的EDTA和尿素,在低浓度条件下对酶起到了促进作用,浓度达到15%时对酶活没有影响,YNBG3对这两种化合物表现出了很好的耐受性;在低浓度条件下(1%),有机试剂对YNBG3的酶活力基本无影响,但随着有机化合物浓度的增大,酶活逐渐降低。

图 9 YNBG3对不同化合物的耐受性 Figure 9 Effect of different solvents on activity of YNBG3
2.7 葡萄糖对YNBG3活性的抑制

葡萄糖作为β-葡萄糖苷酶酶促反应的产物,对β-葡萄糖苷酶酶促反应有明显的影响,一般会存在对β-葡萄糖苷酶的促进作用和反馈抑制作用[27]。通过在反应体系中加入不同浓度的葡萄糖,测定酶的相对活力,结果如图 10所示。由图 10可以看出,葡萄糖对YNBG3活性有较强的抑制作用,随着葡萄糖浓度的增加,酶活力迅速减弱。当葡萄糖浓度达到2.5 mol/L时,YNBG3活性完全被抑制。

图 10 葡萄糖对YNBG3酶活影响 Figure 10 Effect of glucose on activity of YNBG3
2.8 YNBG3的耐盐性分析

将YNBG3与不同浓度的NaCl溶液混匀,4 ℃放置1 h后测定酶活,结果如图 11所示。NaCl在0.5 mol/L以下时,对酶活力有显著的促进作用;浓度为0.1 mol/L时,YNBG3的相对酶活达到最高(141%);而当NaCl浓度超过0.5 mol/L后,对酶开始产生抑制作用。同时随着浓度的增加抑制作用愈显著,NaCl浓度为1 mol/L时,酶活力仅为对照的32%。

图 11 盐离子对YNBG3酶活的影响 Figure 11 Effect of NaCl on activity of YNBG3
3 讨论与结论

目前实际应用的β-葡萄糖苷酶的酶活普遍偏低,培养条件要求高且表达量低[28],很大程度上限制了β-葡萄糖苷酶在食品工业、农业、医药等领域的广泛应用。常规的克隆β-葡萄糖苷酶基因方法即从可培养微生物和植物等[29-30]筛选,而利用宏基因组学技术,能挖掘到具有优良特性和广泛应用潜力的新型β-葡萄糖苷酶基因。陆坚等[31]利用高糖土壤微生物宏基因组文库筛选到了两株编码新型β-葡萄糖苷酶的unbgl3A和unbgl3B,在核苷酸水平上,unbgl3A和unbgl3B与已知数据库中的β-葡萄糖苷酶基因没有任何相似性。侯亚会等[32]利用白蚁肠道宏基因组挖掘到编码新型β-葡萄糖苷酶的CfBG-Ib,其开放阅读框为1 692 bp,产物编码563个氨基酸。本研究利用基于宏基因组学技术的功能筛选方法,从土壤微生物宏基因组文库中筛选到一致性低的β-葡萄糖苷酶YNBG3,证明宏基因组学方法是筛选新型特异活性酶类的有力工具[33]

对YNBG3的基因进行PCR扩增、测序,并进行序列比对分析,得知YNBG3属于糖基水解酶第三家族。将YNBG3基因进行异源表达,最终纯化得到YNBG3,比活力为33.65 U/mg。分析其酶学性质,在50 ℃环境下能保持30%以上酶活超12 h,该酶的温度耐受性要高于文献[34]所报道,具有研究价值。值得一提的是,在含EDTA和尿素的反应缓冲体系内,该酶活性不仅没有被抑制而且还对酶产生了促进作用,这更是已报道[35-36]的众多β-葡萄糖苷酶所不具备的特性。同时,研究发现该酶对常见的金属离子和有机溶剂也有极好的耐受性,NiCl2、CaCl2、MgCl2对YNBG3有明显的促进作用。此外,YNBG3在低浓度盐离子环境中酶活能提高到140%,表明该酶还具有一定程度的嗜盐性,能抵抗较高浓度的盐离子,在实际的生化生产反应中是非常有利的因素[37]。这些特性有利于YNBG3在各类果汁、食品加工及洗涤工业生产等领域的应用。因此,热稳定性好且对EDTA、尿素和有机试剂有良好耐受性的新型β-葡萄糖苷酶YNBG3具有潜在的工业应用价值。同时,本研究也对基于宏基因组学技术挖掘新型功能基因和活性物质的研究具有一定的参考意义。

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