海洋环境具有高盐、高压、低温、缺氧和寡营养等极端自然条件，这种特殊而又复杂的生境赋予海洋放线菌种类、遗传和生态功能的多样性，也奠定了海洋放线菌次级代谢产物丰富多样的物质基础^[1]。海洋放线菌因其能产生结构新颖、活性显著的次级代谢产物，成为新药开发的重要战略新资源，这推动其在海洋生命科学领域的发展。

近年来，科研人员从海洋来源的放线菌中发掘大批次具有复杂的立体结构、广泛的抗癌以及酶抑制活性等的新型骨架天然产物，如大环内酯类、内酰胺类及含卤素次级代谢产物等^[2]。据宋永相等统计，截至2014年从海洋放线菌中发现和描述的新化合物达到708个^[3]。中国科学院南海海洋研究所自2006年起全面开展海洋微生物天然产物及其组合生物合成研究，共分离鉴定了海洋微生物源天然产物1 000多个，其中新化合物近300个，具有代表性的新型活性产物如从印度洋深海环境发现的海洋链霉菌Streptomyces sp. SCSIO 03032^[4]中分离获得了Spiroindimicins、Piericidin、Heronamides和Indimicins等多个类别的20多个次级代谢产物，含15个新化合物，其中4个新型双吲哚生物碱Spiroindimicins A−D，具有罕见N-N螺环结构，Spiroindimicins B−D对多株癌细胞株有抑制性。从一株深海来源的链霉菌S. lusitanus SCSIO LR32中发现了系列新的聚酮苷(蒽环)类化合物，体外抗肿瘤活性测试表明其中的Grincamycin B (GCNB)能够选择性抑制白血病细胞系NB4的增殖(IC₅₀=0.24 μmol/L)^[5]。还从海洋链霉菌Streptomyces sp. SCSIO 10355中获得一种新型笼状倍半萜化合物Strepsesquitriol^[6]，对巨噬细胞RAW264.7中脂多糖诱导的TNFα具有温和抑制活性。从另外一株海洋链霉菌S. rutgersensis SCSIO 11720中发现耐热型血红蛋白降解酶PA720^[7]，70 ℃，pH 10.5条件下仍表现出显著抗菌活性，可作为基于血红蛋白抗菌肽的一种工具酶。从海洋链霉菌菌株S. rutgersensis SCSIO 11594中发现两个新的C-糖基化角环素类新化合物Marangucycline A和B^[8]。这些研究成果极大地丰富了南海海洋生物资源结构，为后续的先导药物开发打下扎实基础。

然而，基于传统的活性追踪结合分析鉴定的方法有很多的局限性、菌株存在大量沉默基因簇、活性化合物产量低、潜在新型化合物结构难以预测以及功能活性无法实现高通量筛选等问题，使得传统筛选活性天然产物的方法面临诸多挑战。与此同时，基于组合生物合成方法开展海洋放线菌次级代谢产物的生物合成机制研究，能够提升菌株的次级代谢能力，分离获得更多活性中间体和代谢产物，有效突破传统技术的瓶颈，越来越受到研究人员的重视。2016年张长生统计已经阐明海洋来源天然产物合成基因簇有54个，其中海洋放线菌来源的有37个^[9]。迄今南海海洋研究所鉴定了其中8种海洋放线菌来源的次级代谢产物生物合成基因簇，揭示了这些次级代谢产物的生物合成途径与机制，包括来源于M. thermotolerans的核苷类化合物A201A，生物碱类化合物Marinacabolines和非核糖体肽途径合成的海沟霉素以及其他海洋放线菌来源的萜类化合物Xiamycin^[7]，聚酮途径合成的Lobophorin^[10]和Grincamycin^[11]，聚酮/非核糖体肽杂合途径合成的Tirandamycin^[12]和Caerulomycin^[13]。随着分子生物学技术的不断开展，基因测序技术的不断提高和生物信息数据的爆炸式增长，利用生物信息学分析海洋放线菌基因组序列中特定酶和保守序列，预测酶的功能和基因簇编码产物的结构，从中发现和激活功能活性次级代谢产物等^[14]，为利用组合生物合成技术构建结构新颖化合物及其衍生物提供可能，为指导激活新颖的活性化合物提供新思路。

Marinactinospora属是我国科学家在深海发现的经典放线菌新属之一，也是全球海洋环境发现的14个放线菌新属之一，对其系统研究获得的丰富成果，能够直接反映出近年来我国科学家在海洋放线菌研究领域的趋势、方向和水平以及海洋放线菌资源的开发价值和规律。本文主要从属种的分类鉴定，具有生物学和药理活性的新颖次级代谢产物及其生物合成机制的发现，以及该菌株的全基因组生物信息学分析共四个方面对前期在南海深海环境发现的海洋放线菌新属新种M. thermotolerans的研究进展进行综述。系统地阐述海洋放线菌M. thermotolerans的研究状况，展示我国在海洋放线菌研究领域的最新成果，为我国全面开展海洋放线菌研究提供一个全面的参照。

1 M. thermotolerans菌株分类鉴定及其分布

Marinactinospora属于放线菌门，放线菌纲，链孢囊菌目(Streptosporangiales)，拟诺卡氏菌科(Nocardiopsaceae)，目前该科共包含了11个属级类群，代表属是Nocardiopsis。拟诺卡氏菌科内属种生境来源不同，环境耐受力和适应力较好。该类群微生物通常能形成长的或短的孢子链或孢子囊，孢子链或孢子囊上富含孢子，有利于耐受极端环境。Marinactinospora和Spinactinospora类群是从海洋沉积环境中发现的；Nocardiopsis和Thermobifida是嗜热放线菌，可以在高温(40−50 ℃)环境下生存，Nocardiopsis菌株也有报道发现于高盐环境、南极冰川和深海沉积环境等；Haloactinospora、Streptomonospora、Lipingzhangella和Salinactinospora具有喜盐的生长特性；Actinorugispora、Allosalinactinospora、Murinocardiopsis和Thermobifida类群报道少，生境来源不一，分别来源于南韩胡萝卜、新疆拉普尔撑柳根际土壤和德国柏林霉壁。

海洋产孢放线菌属(Marinactinospora)是Tian等^[15]2008年从中国南海北部3 865 m的深海沉积物中发现，目前有效发表种有2个，另一个种M. endophytica1^[16]最初在2015年从新疆药用植物沙柳茎中发现。根据形态学研究发现，M. thermotolerans菌株能产生白色气生菌丝和黄白色基质菌丝。生理生化鉴定结果显示，该菌株G⁺，好氧，不产色素，是能够耐受55 ℃高温的经典丝状放线菌；16S rRNA基因序列BLAST比对结果显示菌株SCSIO 00652与菌株Nocardiopsis trehalosi VKM Ac-942^T具有96.5%的相似性，重建系统发育树(图 1)显示该菌株处于该科最深处，形成独立分支；化学分类鉴定结果显示，该菌株的优势醌[MK-11(H₈，H₁₀)和MK-10(H₈)]、主要磷脂组分(双磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、卵磷脂、磷脂酸肌醇甘露醇、磷脂酸肌醇和未知磷酸糖脂)和主要脂肪酸组分[10-甲基-C_18:0(24.5%)、i-C_16:0(24.5%)、i-C_16:1G(10.9%)和ai-C_17:0(9.5%)]，与该科中其它属均显示出差异。综合形态学、生理生化、化学分类法和16S rRNA基因系统发育学等多相分类结果，最终确定了Marinactinospora的新属和新物种的地位。

Tian等^[15]在180 m水深的海洋沉积环境中发现了另外一株16S rRNA基因序列与M. thermotolerans相似性大于99%的菌株SCSIO 00606，说明该属的菌株能适应深海和浅海的海洋环境。截止至2016年12月，在NCBI和RDP数据库中该属有6株菌，分别来源于痰液(菌株CNM646-09)、硝尔库勒湖(菌株41251)、红树林土壤环境(菌株OAct609) 和海洋沉积物(菌株TPS16) 等，显示出该属菌株较强的环境适应性。

2 M. thermotolerans产生的新颖次生代谢产物

课题组近几年对M. thermotolerans典型菌株SCSIO 00652和野生菌株00606进行了系统的天然产物分析研究，通过不同发酵培养基、发酵条件优化和操作调节基因等手段，发现一系列结构新颖的活性天然产物和已知的活性显著的化合物。

核苷类抗生素A201A是M. thermotolerans SCSIO 00652突变株Ju3001的发酵产物，该化合物结构(图 2)包含一个3ʹ-氨基-3ʹ脱氧腺苷部分，一个对羟基-α-甲基肉桂酸部分，一个特殊不饱和六呋喃糖基团和一个3, 4-双氧甲基-β-D-鼠李糖部分。A201A通过抑制蛋白质中肽键合成，能够高效抑制G⁺和G^–好氧细菌生长，如Staphylococcus aureus，同时对卤虫(Artemia salina)具有致死性^[17]。通过敲除多个基因获得一系列mtd基因突变型菌株能够产生8个A201A的系列化合物，均具有良好的抗菌活性。

菌株SCSIO 00652的发酵产物中发现了5个β-咔啉化合物命名Marinacarbolines A−E (图 3)^[18]、两种新的九元环吲哚内酰胺化合物甲基海沟霉素的衍生物(图 4)^[18]和一个四噻唑环肽化合物，命名为Marthiapeptide A (图 5)^[19]。Marinacarbolines A−E含有三环吡啶结构，这种杂环骨架使得β-咔啉具有抗过敏、抗病毒、抗炎、抗菌和抗肿瘤等活性，并且能够与受体相互作用发挥神经毒素和神经保护剂作用；β-咔啉化合物A−D是在已知化合物EC-3位上分别被4-甲氧基苯丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸脱羧后取代而来，是新的化合物，它们对人恶性疟原虫药物敏感株Plasmodium falciparum 3D7和多药耐药株Dd2具有良好生长抑制作用，其中Marinacarbolines A的IC₅₀达到2 μmol/L，具有制备抗疟疾药物的可能。

13-N-脱甲基甲基海沟霉素(5) 和甲基海沟霉素-14-O-α-糖基(6) 均是甲基海沟霉素的衍生物，这类抗生素显示广泛的生物活性。海沟霉素^[20]能抑制癌细胞株表皮生长因子诱导的磷脂酰肌醇信号转化，抑制癌细胞生长达到抗肿瘤的效果，甲基化的海沟霉素^[21]能通过解除佛波醇对Fas诱导的细胞凋亡的抑制作用，达到抑制癌细胞增长的作用；新发现的两种衍生物对人恶性疟原虫药物敏感株Plasmodium falciparum 3D7和多药耐药株Dd2具有生长抑制作用，IC₅₀达到5 μmol/L，为治疗疟疾提供新的药物选择。

化合物Marthiapeptide A是一个新的含四噻唑内酰胺化合物，含有四个连续的噻唑环、恶唑环和环肽结构，该类多肽类化合物具有广泛的生物活性，尤其含有噻唑环和恶唑环的环肽具有很强的细胞毒活性^[22]。化合物Marthiapeptide A对黄色微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌有抑制作用，其最小抑制浓度在2.0−8.0 μg/mL；同时具有细胞毒性，能显著抑制人神经胶质瘤株SF-268、人乳腺癌细胞株MCF-7、人肺癌细胞株NCI-H460和人肝癌细胞株HepG2，其IC₅₀达到0.38−0.52 μmol/L^[23]。

海洋放线菌SCSIO 00606菌株发酵产物与SCSIO 00652有较大的差异，从中分离得到3种新的吡喃酮类化合物Marinactinones A−C (图 6)，3种化合物均含有γ-吡喃酮结构和甲基己基侧链，γ-吡喃酮类化合物具有广泛的生物学活性。3种化合物对人胰腺癌SW1990细胞株和人肝癌HepG2、SMCC-7721细胞株具有不同程度的细胞毒活性，其IC₅₀最小达37 μmol/L，其中Marinactinones B具有抑制拓扑异构酶Ⅱ作用，能积累DNA超螺旋，阻碍DNA聚合酶前行，从而抑制癌细胞生长^[24]。

3 M. thermotolerans来源化合物的合成机制

基于M. thermotolerans SCSIO 00652菌株全基因组测序和生物信息学分析，分别发现一个Marinacarbolines (MCB)的生物合成基因簇和一个负责甲基海沟霉素和海沟霉素生物合成的基因簇，通过一系列基因工程手段和体外酶学手段阐明了二者的生物合成机制。

β-咔啉生物碱合成关键途径在植物、动物和微生物中研究较多，但负责β-咔啉生物碱母核形成的关键生物合成酶尚未被发现。Chen等^[25]的研究发现，Marinacarbolines的生物合成基因簇全长4 kb，由mcbABC三个基因组成，其生物合成的前体是来自于初级代谢的色氨酸和乙酰辅酶A。在Marinacarbolines生物合成途径中，McbA是一个新的酰胺合成酶，依赖ATP，参与催化1-乙酰基-3-羧基-β-咔啉、β-苯乙胺和色胺之间的酰胺键形成，Ji等^[26]利用McbA催化合成了10种新的β-咔啉类似物。McbB是一个催化β-咔啉母核形成、具有Pictet-Spengler功能的新颖生物催化酶，E97是催化活性关键位点。McbC主要负责苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的脱羧作用。至此，Marinacarbolines的生物合成过程中3个关键酶全部被发现，合成机制首次被阐明，为利用组合生物合成的方法构建其新的结构衍生物奠定了基础。

甲基海沟霉素和海沟霉素是一类九元环吲哚内酰胺类抗生素，其生物合成基因簇全长14.3 kb，由mpnABCDEFG七个基因参与合成过程。其中MpnB是一种非核糖肽合成酶，能分别结合异亮氨酸和缬氨酸，参与合成甲基海沟霉素和海沟霉素分子。MpnC是一种少数能有效催化N-芳化的功能催化酶，解决传统合成法不容易实现N-芳化过程。而MpnD负责催化色氨酸来源化合物C-7位上的逆异戊烯化过程^[27]。研究发现，蛋白质异戊烯化是在翻译后修饰并参与细胞调节过程，次级代谢产物异戊烯化通常表现生物学和药理活性。异戊二烯基转移酶催化的异戊二烯转移反应是生物合成中的关键步骤，能促进化合物的结构新颖性和生物学多样性^[28]。深入研究甲基海沟霉素和海沟霉素的生物合成机制，为将来合成含色氨酸天然产物或色氨酸衍生物提供重要支撑。

4 M. thermotolerans的基因组概况

我国学者及Doe Joint Genome Institute (JGI)分别对菌株M. thermotolerans SCSIO 00652^T(=DSM 45154^T=CCTCC AA 208041^T)进行基因组扫描测序，其中JGI测序结果已经公布在GenBank (Seq Project ID 1008532)。基因组序列组装显示，染色体总长度为5 663 781 bp，有0.1%的gap，36个Scaffold，G+C%含量为72%，预测共有4 965个蛋白编码基因以及大量的调控基因；随后我国学者基于三代PacBio测序平台，对菌株SCSIO 00652^T前期的基因组精细图进行完善、补gap等操作，完成了0 gap的基因组完成图，并最终确定菌株的基因组大小为5.693 Mb。进一步分析发现该菌株具有多个rRNA拷贝数，且拷贝序列间存在差异。包含5个16S rRNA基因拷贝，全长1 521 bp，这些序列与M. thermotolerans发表的序列EU698029之间最大存在1%的差异，而这5条序列之间存在最多10个bp差异；6个5S rRNA基因拷贝，长度均为116 bp，它们之间最大有5个bp差异；以及5个23S rRNA基因拷贝，序列间的相似性差异最大达1.4%。16S rRNA基因的多拷贝对原核微生物的鉴定将产生一定的影响，造成这种差异的原因有待深入研究。

antiSMASH (3.0.5版本)基因组注释预测显示共含有18个生物合成基因簇(表 1)，包括5个非核糖体肽合成酶(NRPS)基因簇，4个杂合基因簇，包括Ⅰ型PKS/NRPS杂合、Ⅰ型PKS/寡糖杂合基因簇，细菌素/羊毛硫肽杂合基因簇和Nrps-Indole-Lassopeptide杂合基因簇，2个Ⅰ型聚酮类合成酶(PKS)基因簇，其余羊毛硫肽杂合基因簇，Ⅱ型PKS基因簇，四氢嘧啶合成基因簇，Fused基因簇和烯萜类基因簇各1个，未知合成基因簇2个。化合物甲基海沟霉素和海沟霉素的生物合成基因簇已被鉴定并储存在GenBank中，其登录号为JN634585。海洋放线菌能通过NRPS和PKS合成途径生成结构新颖、功能多样性的次级代谢产物，是天然活性小分子的重要来源。NRPS基因簇由腺苷酰化结构域、缩合结构域和肽酰载体蛋白结构域组成，β-内酰胺类、多肽类和糖肽类等由NRPS途径合成^[29]；PKS基因簇^[30]一般由酮基合成酶编码区、酰基转移酶编码区和酰基载体蛋白编码区组成，根据聚酮合酶的结构及其他性质分型，PKS途径能合成四环素、大环内酯类、安莎类、聚醚类等结构新颖的活性化合物。

5 M. thermotolerans的研究展望

海洋放线菌因其独特的生存环境而具有与陆源放线菌不同的生理生化特征，能产生多种活性的次级代谢产物。新发现的M. thermotolerans能产生抗生素A201A、抗疟原虫活性的Marinacarbolines A−D、潜在抗癌活性的甲基海沟霉素和海沟霉素、抗菌且具细胞毒性的噻唑环肽类化合物Marthiapeptide A以及抗肿瘤活性的吡喃类化合物Marinactinones A–C等多种新型活性产物，表明海洋放线菌是发现新型抗生素和新型药物的优良微生物资源，为研制新的抗肿瘤或抗菌药物提供了新的先导化合物。

通过前期对海洋放线菌M. thermotolerans的研究，后期在以下几个方面需要加强：(1) 新海洋放线菌资源的发掘。M. thermotolerans新菌株的发现是后续研究工作的前提和契机，是新的化合物、新功能基因及新型代谢途径等发现的关键。此外，极端海洋环境中难培养或未培养微生物资源也具有产新颖化合物的巨大潜力。因此，加强稀有菌种资源的挖掘，有利于展开新物种、新产物、新机制、新应用等方面的研究。(2) 化合物分离新方法开发。由于传统化合物分离手段的局限性，分离过程中产量较低化合物的难以分离，急需开发反应灵敏而检测方便的新型分离检测方法，配合全面的生物信息学分析能够有效从目标菌株中挖掘未知的活性次级代谢产物。(3) 发酵条件的“极端化”。首先，海洋放线菌在实验室的最适生长条件下，能够产生种类丰富的次级代谢产物。而如果适当增大发酵条件的压力，如高温、高盐、酸碱条件下对目标菌株进行胁迫发酵、固体发酵、静置液体发酵、大规模发酵等多种发酵措施，能够极大程度上提升菌株代谢产物的出新率。如鞠建华等^[23]针对M. thermotolerans采用60 L大规模发酵体系成功分离获得具有抗感染活性的噻唑环肽类化合物Marthiapeptide A。(4) 调控因子的编辑和沉默基因的激活。菌株基因组上含有大量的沉默基因簇，而基因簇内存在许多潜在的调控因子和功能基因。通过对这些调控因子和潜在沉默基因进行遗传操作，能够有效激活沉默基因簇的表达而生产新颖活性化合物。例如通过敲除负调控因子mtdA基因，得到高产抗生素A201A的SCSIO 00652突变株Ju3001^[31]，其产量是野生型的25倍，达到312.5 mg/L。抗生素A201A高产菌株M. thermotolerans SCSIO 00652突变株Ju3001的成功构建使抗生素A201A的产业化成为可能。另外，从海洋放线菌SCSIO 00652中重新发现抗生素A201A，也引起同行的高度重视，完成了对其的全合成^[32]。以上工作使抗生素A201A的产业化成为可能，这也为该抗生素入药打下了基础，对开发中国海洋药物资源具有重要意义。此外，信号分子的级联信号传递过程中也能激活化合物的合成和释放，如链霉素合成过程中需要一些级联信号分子A-factor的介导。新颖化合物基因簇的发现既可以指导海洋放线菌活性化合物的定位，还能通过调控因子的功能研究提高活性化合物的产量，为开发中国海洋药物资源提供新思路。

目前海洋放线菌菌种资源挖掘有限，单个菌株的化合物发现有限，微生物全基因组信息解析程度有限，国家投入的人力物力仍然有限，因此，海洋放线菌新颖药源活性化合物的发现还需要在研究方法上有突破，才能有更好的发展。