2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 朱睿, 李震, 董世娟, 于瑞嵩, 朱于敏
- ZHU Rui, LI Zhen, DONG Shi-Juan, YU Rui-Song, ZHU Yu-Min
- B细胞表位作图研究进展
- Progresses on B cell epitope mapping
- 微生物学通报, 2017, 44(9): 2172-2183
- Microbiology China, 2017, 44(9): 2172-2183
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170234
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文章历史
- 收稿日期: 2017-03-22
- 接受日期: 2017-05-24
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2017-06-06
2. 上海市农业科学院畜牧兽医研究所 上海 201106;
3. 上海农业遗传育种重点实验室 上海 201106
2. Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China;
3. Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding, Shanghai 201106, China
抗体，特别是中和性抗体，可以与靶抗原特异性结合并中和入侵病原，因此，抗原-抗体特异性相互作用在机体清除各种感染源的体液免疫反应中发挥关键作用。抗体特异性识别抗原分子上称为抗原性决定区或表位的特定区域[1]。B细胞表位就是抗原分子表面能够被抗体特异性识别结合的氨基酸簇；B细胞表位可以被分泌的抗体或B细胞受体识别，诱导宿主产生细胞免疫反应和体液免疫反应[2]。B细胞表位鉴定具有许多重要的生物学意义，如可以深化对免疫反应和自身免疫疾病的认知，为表位疫苗的研发或疾病诊断方法的建立提供候选表位肽，有助于治疗性抗体的作用机制的揭示等[3-4]。同时，单抗药物识别表位的鉴定也有助于自主知识产权的伸张和保护。
根据其空间结构的不同，B细胞表位可分为线性(连续性或顺序性) B细胞表位和构象性(非连续性或非线性) B细胞表位。线性B细胞表位一般由3−8个抗原分子一级结构上连续的氨基酸残基构成。然而，我们在进行小反刍兽疫病毒(PPRV)核衣壳蛋白(N蛋白)和血凝素蛋白(H蛋白)的B细胞表位作图研究中也鉴定到由9个或10个氨基酸残基构成线性B细胞表位[5](和作者未发表的数据)。构成构象性B细胞表位的氨基酸残基在抗原分子的一级结构中并不连续，它们在正确折叠的抗原蛋白的表面彼此靠近，形成能够被抗体特异性识别并结合的构象性B细胞表位[6]。在天然蛋白中，构象性B细胞表位的正确折叠形成所需的氨基酸残基数从20个到400个不等。一般认为，大多数的B细胞表位并不是线性表位，而是具有特定空间构象的构象性表位。然而，线性B细胞表位与构象性B细胞表位之间并不存在严格的界限[7]。构象性B细胞表位常常由数量不等的、由几个连续的氨基酸残基组成的短肽构成，而这些短肽中的有些短肽单独也可以被相应的抗体特异性识别结合(据此也可以被称为线性B细胞表位)。因此，大多数目前鉴定到的线性B细胞表位可能只是构象性B细胞表位的一部分。甚至有研究者认为，大于70%的构象性B细胞表位皆由1−5个包含1−6个氨基酸残基的线性B细胞表位组成[8]。
广义的B细胞表位作图不仅包括抗体特异性识别并结合的B细胞抗原表位基序的准确定位(即确定抗原分子上被B细胞表面受体或抗体特异性识别并结合的氨基酸残基及其在抗原蛋白初级和高级结构上的定位)，还涉及绘制出抗原蛋白的全部或接近全部B细胞表位基序在其初级和高级结构上的分布图谱的过程。目前，研究抗原与抗体特异性相互作用的实验方法已从利用ELISA筛选线性抗原性片段的方法发展到可以鉴定构象性B细胞表位的突变体库筛选技术；质谱、核磁共振、X-射线晶体学分析和冷冻电镜等现代生物物理技术与方法也被用于抗原-抗体间直接相互作用的氨基酸残基或原子的精确定位研究。根据表位作图时所采用的抗体类型的不同，可以将B细胞表位作图的实验方法分为两类：(1) 利用单克隆抗体的B细胞表位作图，依据所采用的具体表位作图方法的不同，得到的抗原表位可以是线性B细胞表位，也可以是构象性B细胞表位。(2) 利用多克隆抗体的B细胞表位作图，此方法往往只能得到线性B细胞表位。近年来，组学(如基因组学、蛋白组学、转录组学)研究数据的积累和表位作图实验技术的发展为B细胞表位数据库的建立和B细胞表位计算机预测方法的开发提供大量的数据基础。目前，已建立的B细胞表位数据库包括多功能数据库、单病原微生物数据库等；基于计算机软件的B细胞表位预测方法也得到迅速发展[2]。虽然B细胞表位的计算机预测可以大大减少后续B细胞表位鉴定研究的工作量，从而节约表位作图的时间、降低作图的成本，但是已有的B细胞表位的预测方法常常只能预测出抗原分子中的免疫原性或表位样区域。而且，虽然可以通过采用多个B细胞表位预测方法提高表位预测的准确性，B细胞表位的预测结果仍存在相当比例的假阳性和假阴性结果，对于构象性B细胞表位的预测，其准确性更低。鉴于最近国内外研究者对B细胞表位的计算机预测方法和B细胞表位数据库进行了详细的综述[2, 9]，本文仅对目前常用的B细胞表位作图实验方法进行综述，以期为研究者的B细胞表位作图方案的设计提供参考。
1 利用单克隆抗体的B细胞表位作图 1.1 生物物理技术X-射线衍射、冷冻电镜(cryo-EM)、核磁共振(NMR)、质谱(MS)和表面等离子体共振(SPR)等生物物理技术在利用单抗的B细胞表位作图研究中均发挥了重要作用。利用这些技术，不仅可以鉴定到构象性B细胞表位，也可以鉴定线性B细胞表位。
抗原-单抗复合物的X-射线晶体学分析是目前最准确的B细胞表位鉴定方法。它可以精确地确定抗原分子中与单抗发生相互作用的氨基酸残基，甚至可以定位抗原上被单抗识别并结合的氨基酸残基的主链或侧链原子[3]。不论被单抗识别的是构象性B细胞表位，还是线性B细胞表位，都可以通过抗原-单抗复合物的X-射线晶体学分析得到解析。由于抗原-单抗复合物的X-射线晶体学分析涉及抗原和单抗的纯化、抗原-单抗复合物的形成与纯化以及复合物的晶体学解析等，需要专业技术和大量资金支持；这对于一些可溶性的简单抗原来说就常常是一项难以完成的任务，而对于许多复杂抗原(如膜蛋白)而言则更加困难。因此，虽然目前已经鉴定到成千上万的单克隆抗体，但只有少数B细胞表位通过抗原-抗体复合物的X-射线晶体学分析方法得到解析[10-13]。
由于需要对样品进行衍生和干燥，电子显微镜不适于研究抗原-单抗间的相互作用[14]。但自2013年冷冻电镜技术的建立使电镜技术研究抗原-单抗复合物的结构成为可能[15-16]。由于冷冻电镜技术仅需要少量抗原-单抗复合物，不需要高纯度蛋白，也不用对复合物进行结晶，可以用于分析其它方法(如X-射线晶体学技术)无法解析的大分子复合物的结构，因此，冷冻电镜技术在表位作图方面比X-射线晶体学技术更具优势。目前，冷冻电镜技术常与X-射线晶体学技术相结合应用于B细胞表位作图研究。单独或与X-射线晶体学技术相结合，冷冻电镜技术已经用于HIV、HPV等病毒结构蛋白的B细胞表位作图研究[17]。
第三种应用于利用单抗的B细胞表位作图研究的生物物理技术是核磁共振技术。核磁共振技术的分辨率恰好适合在原子水平解析抗原-抗体复合物中相互作用界面的结构信息，即B细胞表位鉴定。该方法通过分析抗原本身与抗原-单抗复合物核磁共振信号的差异，可以快速、准确地确定抗原的B细胞表位氨基酸基序。基于核磁共振技术的B细胞表位作图可以提供比突变体肽库或肽库筛选技术更详细的表位信息，同时又比X-射线晶体学技术更加快速。但是，利用核磁共振技术解析抗原的B细胞表位需要首先确定抗原中每个氨基酸残基的核磁共振信号，这对于大分子抗原来说是一个很大的挑战。核磁共振技术单独或者与其他方法相结合已成功用于多种病原微生物结构蛋白的B细胞表位作图研究[3, 17-19]。
质谱也以其快速的优点而广泛用于B细胞表位的鉴定。在该方法中，首先在抗体存在或不存在条件下，以蛋白酶酶解抗原蛋白，然后利用质谱分析经分离纯化的酶切产物，从而确定被抗体保护的抗原蛋白的边界(表位区域)[20-21]。这种B细胞表位作图方法的不足之处在于其只能鉴定到30−60个氨基酸残基的表位片段，不能进行表位的精确定位。虽然氕/氘交换-质谱技术提高了其表位作图的精确度[22-23]，但仍低于基于X-射线晶体学技术和冷冻电镜技术的表位作图方法的精确度。经过25年的发展，随着样品处理技术的提高和先进质谱仪的问世，基于质谱技术的B细胞表位作图所需的样品量更低，可以在不降低准确性的前提下分析更加复杂的抗原样品。基于质谱技术的B细胞表位作图方法不再仅限于利用单克隆抗体的表位鉴定，已经扩展到利用多克隆抗体的B细胞表位作图[24]。
表面等离子共振技术近年来迅速发展并应用到生物分子相互作用的研究领域。该技术不仅具有无需标记、特异性强、灵敏度高、样品用量小的优点，而且可实现在线连续实时检测[25-26]。基于表面等离子共振技术的B细胞表位作图类似于ELISA技术，虽然其B细胞表位作图的分辨率低于基于X-射线晶体学技术和冷冻电镜技术的表位作图方法的分辨率，但其可以快速、高通量地进行系列抗原突变体或片段与单抗的结合能力的分析。表面等离子共振技术单独或与噬菌体展示技术等其它B细胞表位作图技术结合已经用于多种抗原分子的B细胞表位作图研究[27-29]。
综上所述，基于生物物理技术的利用单抗的B细胞表位作图虽然都可以进行B细胞表位鉴定，但这些方法都需要昂贵的仪器，有的还需要抗原-抗体复合物的晶体结构信息或者需要专业技术人员的辅助才能完成。因此，X-射线晶体学技术、冷冻电镜技术和核磁共振技术更多地用于重要病原的中和性单抗识别的B细胞表位鉴定，它们都是B细胞表位作图方法的重要组成部分。
1.2 生物化学技术与基于生物物理技术的利用单抗的B细胞作图需要昂贵的仪器不同，基于生物化学技术的利用单抗的B细胞表位作图几乎可以在所有从事生物学研究的实验室进行。利用生物化学技术的B细胞表位作图一般通过分析生物或化学合成的抗原片段、随机肽片段(包括与各种高通量抗原展示技术结合)与单抗的结合能力来确定B细胞表位。抗原肽通常被固定在固体支持物上，然后以斑点杂交、Western blot或ELISA方法检测其与单抗的结合能力。B细胞表位作图的生物化学技术大多可以定量分析抗原-单抗的结合能力，从而确定B细胞表位中每个氨基酸残基对结合力的贡献[1]。根据所采用的具体生物化学技术的不同，得到的B细胞表位可以是构象性B细胞表位，也可以是线性B细胞表位。大部分的生物化学技术可以同时鉴定到线性B细胞表位和构象性B细胞表位。
在利用单抗的B细胞表位作图的常规生物化学技术方法中，斑点杂交由于需要将纯化的抗原或多肽固定到杂交膜上，主要用于抗原-单抗结合能力的定性或半定量检测[18]。Western blot (WB)具有方法简单、可靠、灵敏的优点，且不需要事先对抗原肽进行纯化；因此，非常适合分析各种重组表达系列截短抗原肽与单抗的结合能力，以确定相应的B细胞表位。WB可以用于包括病毒、细菌、真菌、寄生虫在内的各种病原微生物结构蛋白的B细胞表位作图。虽然WB主要用于线性B细胞表位的鉴定，但也可以用于部分空间表位的鉴定[30-31]。WB在B细胞表位鉴定的独特作用还在于其能够经济有效地鉴定线性B细胞表位的最小基序。ELISA由于需要以纯化的抗原或多肽包被96孔ELISA板，通常用于利用化学合成多肽的B细胞表位作图，以发挥其高通量的优势。以纯化的重组表达的系列抗原截短肽包被ELISA板，也可以用于包含B细胞表位的抗原片段的初步鉴定。
现代生物技术，特别是新一代高密度蛋白芯片的出现大大提高了基于ELISA的B细胞表位作图的效率，也克服了合成肽法只能用于线性B细胞表位鉴定的缺点。目前，利用商业化的蛋白芯片可以迅速、准确地进行线性B细胞表位或构象性B细胞表位作图的研究(https://www.pepscan.com/precision-epitope-mapping )。利用高密度蛋白芯片的B细胞表位作图技术具有高通量和所需样品量小的优点。但是，该技术需要高纯度的多肽，特别是高纯度的具有天然空间构象的多肽；另外，多肽在固体介质上的定位有时会屏蔽单抗的结合部位，从而造成表位的遗漏。
提高利用单抗的B细胞表位作图的效率和通量的另一项技术是抗原突变体库技术与抗原(肽)表面展示技术的有机结合。突变体库分析作为一种快速的B细胞表位作图方法，其原理是抗原分子中组成抗原表位的关键氨基酸残基(常为Trp、Arg或Tyr)的替换会导致其抗体结合能力的减弱或丧失[32]。蛋白突变库可以是随机突变体库或定点突变体库，而饱和突变技术将特定位置的氨基酸残基替换为20种天然氨基酸中的任意一种氨基酸残基，以确定该氨基酸残基对表位抗体结合能力的贡献[18]；在丙氨酸扫描突变法中每次将一个非丙氨酸残基替换为丙氨酸(导致其侧链截短为1个β碳，却不影响蛋白骨架的灵活性)以确定每一个残基的侧链对其与抗体结合能力的贡献[33]。组合突变则通过对非连续抗原性区域进行随机组合并对突变残基分组(初级序列的连续性)，最大可能地分析邻近氨基酸残基的组合效应[34-35]。最近报道的鸟枪突变技术(shotgun mutagenesis)中，每个细胞克隆表达一个正确折叠的、包含一个确定的氨基酸残基突变(如丙氨酸替换)的重组抗原；该技术能以每月20个表位的速度同时鉴定到单抗识别并结合的线性B细胞表位和构象性B细胞表位[4]。
展示技术(如噬菌体展示和酵母展示)成功解决了化学合成肽法和生物芯片法B细胞表位作图成本高的难题，为利用单抗的B细胞表位作图提供一个有力的平台。展示技术B细胞表位作图的原理是以单克隆抗体筛选一系列展示在宿主细胞(噬菌体、细菌、哺乳动物、昆虫或酵母细胞)表面的多肽，然后通过测序确定具有目标单克隆抗体结合能力的B细胞表位基序。B细胞表位作图最常使用的展示技术是噬菌体展示技术。随机肽噬菌体展示库和基因片段或基因组片段噬菌体库常常用于B细胞表位作图[36]。展示技术与其他B细胞表位作图技术(如突变体库技术)的有机结合大大提高了单抗B细胞表位作图的效率[3]。由于相对便宜且快速，展示技术在B细胞表位作图方面的应用日益广泛[18]。
2 多克隆抗体的线性B细胞表位作图B细胞抗原表位作图研究的另一个重要领域是利用多克隆抗体(免疫或感染康复血清)的线性B细胞表位作图。与利用单克隆抗体的B细胞表位作图可以同时鉴定到构象性B细胞表位和线性B细胞表位不同，多克隆抗体更多地用于线性B细胞作图研究，特别是抗原蛋白的全部的线性B细胞表位(IgG表位组)的鉴定。除了现在已几乎不用的化学切割法或部分酶解法之外，上述用于单抗B细胞表位作图的生物化学方法也可以用于利用多克隆抗体的线性B细胞表位作图研究，因此下文重点对化学合成肽法和最近建立的改良生物合成肽法进行介绍。
2.1 化学合成肽芯片扫描法与利用单克隆抗体的B细胞表位作图方法相似，化学合成肽芯片扫描法线性B细胞表位作图的第一步是化学合成覆盖目标抗原序列全长的一系列彼此重叠一定长度的多肽片段，并将这些肽段固定到芯片上，或者直接在芯片上合成设计的多肽；然后以抗原免疫血清(或多抗)与芯片上的多肽进行反应；最后通过荧光、化学发光或ELISA法对反应结果进行检测，从而确定能够与多抗发生特异性结合的多肽，即线性B细胞表位[3, 17]。化学合成肽芯片扫描法B细胞表位作图具有灵敏度高、通量高的优势，可以快速鉴定到多个抗原表位[37]。但该方法需要合成大量的多肽片段或购买多肽芯片，其昂贵的费用限制了它在线性B细胞表位作图中的广泛应用。
2.2 改良的生物合成肽法徐万祥课题组首先建立了线性B细胞表位作图和最小表位基序鉴定的“改良生物合成肽法”[38]，并用此方法和抗重组蛋白多抗绘制出了人乳头瘤病毒58型(HPV58) 三个结构蛋白的全部且精细的线性B细胞表位图谱[39]。该方法的特点包括：(1) 选用截断GST188蛋白作为短肽重组表达的融合标签，从而使表达的融合多肽片段大小在21.5−22.5 kD，便于SDS-PAGE和随后WB分析鉴定，也很容易与表达宿主-大肠杆菌自身蛋白条带区分。(2) 根据线性B细胞表位一般包含3−8个氨基酸残基的特点，首先将抗原蛋白分为彼此重叠8个氨基酸残基的16肽，可以基本完全地初步筛选到所有包含B细胞表位的16肽。(3) 利用彼此重叠7个氨基酸残基的系列8肽鉴定每个阳性16肽，可以准确鉴定每个线性B细胞表位的最小表位基序。对于少数表位基序大于8个氨基酸残基的表位的最小基序则采用系列N-端和C-端截短肽法进行鉴定，可以鉴定到每个线性B细胞表位的最小基序。(4) 对于序列比对发现的特异性表位，可以通过点突变技术构建系列表位基序的突变体，然后验证其与抗原免疫血清的反应性，从而鉴定出真正的株/型特异性的线性B细胞表位。改良的生物合成肽法线性B细胞作图流程如图 1所示。
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| 图 1 改良的生物合成肽法线性B细胞表位作图示意图 Figure 1 Diagram of linear B cell epitope mapping using modified biosynthetic peptides method |
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自2012年起，作者实验室利用改良的生物合成肽法开展了小反刍兽疫病毒(PPRV) N蛋白和H蛋白的线性B细胞表位作图的研究。利用抗重组N蛋白兔血清，鉴定到19个线性B细胞表位(包括10个保守性B细胞表位)以及它们的最小表位基序，绘制出PPRV N蛋白线性B细胞表位图谱[5]，如图 2所示。
相似地，利用抗PPRV H蛋白多抗血清，我们最近绘制出H蛋白的13个线性B细胞表位(包括两个保守性B细胞表位)在H蛋白上的分布图(作者未发表的数据)。与19个包含N蛋白线性B细胞表位的多肽都可以被PPRV弱毒疫苗免疫羊血清识别不同，13个包含H蛋白线性B细胞表位最小基序的8肽中只有9个可以被PPRV弱毒疫苗免疫羊血清识别。这表明将改良生物合成肽法B细胞表位作图得到线性B细胞表位用于多表位疫苗设计或疫苗检测抗原时需谨慎选择，需要对获得的表位进行疫苗免疫或感染康复血清可及性验证，或者直接利用疫苗免疫或感染康复血清进行线性B细胞表位作图。
改良的生物合成肽法具有操作简单(无需纯化表达的系列短肽融合蛋白)、经济(短肽生物合成费用约是化学合成费用的1/20)、结果可靠和无需特殊仪器的优点，适合在普通生物学实验室开展线性B细胞表位最小基序鉴定和线性B细胞表位精细作图研究。
3 B细胞表位作图在动物疫病防控中的应用B细胞表位作图已广泛应用于疫病检测方法的建立以及表位抗体药物和新型表位疫苗的研发等领域。抗体药物已成为目前最有前途的生物药物之一，在2015和2016年全球销售前10名的药物中，单抗药物占了一半以上(http://www.chyxx.com/industry/201611/471204.html；http://health.sohu.com/20161214/n475881159.shtml)。在动物疫病防控领域，B细胞表位作图被广泛应用于动物疾病的诊断、鉴别诊断方法的建立和多表位疫苗的研发等方面。
3.1 动物疾病诊断与利用完整重组蛋白建立的疾病诊断方法相比，基于多表位肽的诊断方法由于组合了来自病原微生物的多个抗原蛋白的优势性B细胞表位基序而具有更高的检测灵敏度，从而提高了感染临界值血清的检出率，它可以在疫病感染早期及时发现感染动物，以防止疫病的大规模暴发。马凡舒等[40]用水貂阿留申病病毒(AMDV) NS1蛋白的强B细胞表位肽(302−321 aa)建立了AMD间接ELISA检测方法，利用此方法可以检测出传统血清检测方法检测呈阴性的早期感染动物的血样。张小丽等[41]选取口蹄疫病毒(FMDV) 2C蛋白N-端和C-端的主要B细胞表位区和完整的3AB蛋白组合后作为抗原，建立了FMDV非结构蛋白抗体的ELISA检测方法。用此法对疫区的羊血清样品的检测结果表明：2C′3AB-ELISA方法检测的敏感性高于现有的3ABC-ELISA方法，提高了对可疑血清的检出率，这对于筛查隐性感染动物和持续感染动物以及早期发现FMD疫情有非常重要的意义。
B细胞表位作图在动物疾病诊断中的另一个重要应用是鉴别诊断方法的建立。这既包括区分自然感染带毒动物和疫苗免疫动物的鉴别诊断，也包括症状相似不同疾病的鉴别诊断。病毒反向遗传学技术的建立为病毒表位缺失/插入标记疫苗的构建提供了可能，这种标记疫苗与对应基于缺失/插入表位的检测方法相结合可以进行自然感染带毒动物和疫苗免疫动物的鉴别诊断。Muniraju等[42]利用上述策略构建了PPRV C77单抗表位缺失的弱毒疫苗，该表位缺失疫苗具有与缺失前疫苗相同的免疫效力；与商品化基于C77单抗的间接ELISA试剂盒相结合，实现了PRRV自然感染动物与疫苗免疫动物的鉴别诊断。Choi等[43]利用牛瘟病毒(RPV) N蛋白的C-端线性B细胞表位肽479PEADTDPL486建立鉴别RPV的ELISA检测方法可以检测RPV血清，而与同属的PPRV血清没有交叉反应。相似地，Dechamma等[44]在PPRV N蛋白的C-端鉴定到一个PPRV特异性线性B细胞表位(454−472 aa)，并利用抗此表位的抗体建立了鉴别PPRV和RPV的间接ELISA检测方法。
3.2 多表位疫苗研发多表位疫苗(multi-epitopes vaccine)是将优势B细胞抗原表位，特别是中和性B细胞表位以一定的方式串联构成的一种新型疫苗，它常同时携带来自于多个抗原的B细胞表位和辅助T细胞表位[45]。与弱毒疫苗和灭活疫苗相比，多表位疫苗免疫所产生的抗体针对靶病原的特异性更强。由于去除了对宿主有害而不影响免疫原性的非必需序列，多表位疫苗更加安全可靠。同时，同弱毒疫苗相比，多表位疫苗对温度不敏感，便于规模化生产[46-47]。目前，多表位疫苗的研究日益受到关注。用于动物疫病防控的表位疫苗主要包括3个方面：病毒表位疫苗、细菌表位疫苗、寄生虫表位疫苗。
3.2.1 病毒表位疫苗: 将病毒抗原的T、B细胞表位直接连接获得的联合多表位肽作为候选疫苗免疫动物，可诱导高水平的T细胞免疫应答及抗体的产生。动物病毒性疾病的多表位疫苗研究最早和最多的是口蹄疫(FMD)表位疫苗。国内外研究者对FMD合成肽疫苗、多表位疫苗、病毒样颗粒展示多表位疫苗、以自身蛋白质分子为载体的多表位疫苗的免疫原性以及改善FMD表位疫苗免疫原性的策略进行了大量的研究与探索，以期研制出高效、安全、多价的新型FMD表位疫苗[47-48]。随着对FMDV及表位疫苗研究的深入，相信目前FMD表位疫苗研究中所暴露出的问题会逐步得到解决，FMD表位疫苗一定会在未来FMD的防控与净化中发挥更加积极的作用。另外，其他重要动物病毒性疾病(如流感、猪繁殖与呼吸综合征、鸡传染性支气管炎等)的表位疫苗的研究也取得了一定的进展，并正在逐渐向临床应用阶段发展[49-51]。 3.2.2 细菌表位疫苗: 表位疫苗在动物细菌性疾病防控方面的应用也比较广泛。将病原菌的优势B细胞表位在体外进行重组拼接，然后在合适的宿主细胞中重组表达获得重组细菌多表位肽疫苗。陈建国等[52]构建并在真核细胞中表达了铜绿假单胞菌的MyD88蛋白多表位疫苗。小鼠免疫试验显示：该多表位疫苗可以刺激小鼠产生高度特异性的中和性抗体，疫苗气管接种后，攻毒小鼠肺组织匀浆中的细菌数明显低于阴性对照组。刘祥等[53]选取奶牛乳房炎3种主要致病菌的候选疫苗蛋白：金黄色葡萄球菌的Ebps与Clfa蛋白、大肠埃希菌的OmpA与OmpC蛋白和链球菌的SIP与PGK蛋白，获得每种蛋白的两个优势B细胞表位，设计拼接出了抗原性较好的三联表位疫苗的氨基酸序列，为下一步合成多表位肽疫苗的研究奠定了基础。 3.2.3 寄生虫表位疫苗: 寄生虫表位疫苗的研究相对较少，但关于寄生虫表位疫苗的研究和应用已经展开。目前，已经有一些寄生虫亚单位疫苗投入了临床使用。邓小昭等[54]将猪囊虫B细胞表位n1和n2插入乙肝病毒核心蛋白(HBc)序列的第78位和第79位之间，将猪囊虫B细胞表位n3接在第149位之后，利用大肠杆菌表达获得了猪囊虫多表位疫苗。免疫小鼠后通过ELISA检测到高滴度的抗体，WB结果表明在免疫鼠体内诱导出这3个表位的特异性抗体。以绦虫卵攻击免疫小鼠，试验结果表明：该多表位疫苗的相对保护率为89%，具有良好的免疫效果。于钦磊[55]选择隐孢子虫的主要表面蛋白CP12和CP21构建多表位核酸疫苗；小鼠免疫和攻毒试验表明：与阴性对照组相比，免疫组排卵囊数明显减少，排卵囊持续时间平均缩短3−4 d，最佳卵囊减少率达到84.1%。妊娠山羊免疫试验显示：母羊IgG和IgA抗体滴度逐渐增加，攻虫后卵囊排出量减少、排出时间缩短；而且母羊能够将免疫保护力传给后代。 4 展望B细胞表位作图经历了一系列演变和发展。生物物理方法用于B细胞表位作图早于生物化学方法，而生物化学方法目前更广泛地应用到B细胞表位作图研究中。各种B细胞表位作图方法仍存在不同程度的成本高、耗时、费力等问题，且并不能鉴定到全部的B细胞表位。因此，在实际应用中应根据不同的研究目的灵活选用，而且利用一种方法得到B细胞表位往往需要另外的方法进行功能验证或突变分析验证，以增加结果的可靠性。
近年来，制备单克隆抗体，特别是中和性单克隆抗体日益受到研究者的关注。大量的动物重要病原微生物的中和性单抗也相继得到分离鉴定。高通量的B细胞表位作图平台的建立为快速、有效地鉴定这些单抗识别并结合的线性B细胞表位和/或构象性B细胞表位提供了可能。然而，这些平台所依赖的突变体库的昂贵建库成本限制了其在动物病原微生物结构蛋白的B细胞表位作图中应用。目前，高通量B细胞表位作图仍面临以下挑战：(1) 构象性表位鉴定；(2) 表位基序中关键氨基酸残基定位以及残基中与抗体相互作用的原子或基团鉴定；(3) 构象复杂抗原(如膜蛋白、翻译后修饰或多聚化的蛋白)的B细胞表位作图。
B细胞表位作图虽然是建立特异性疾病诊断方法的最重要的一步，但它只是开发高效表位疫苗的第一步。由于游离抗体的结构与B细胞表面受体的结构并不总是一致，因此体外鉴定到可以与抗体发生相互作用的表位不一定会与体内的B细胞特异性受体结合，因此鉴定到中和抗体识别的B细胞表位免疫后有时并不能诱导机体产生中和抗体。另外，有些抗体在体外具有中和病原微生物的活性，而在体内并不具有中和活性[14-15]。因此，在分析各种方法获得表位信息时需要仔细斟酌。在设计多表位疫苗时，除了包含优势B细胞表位外，往往还需要包含一个或几个T细胞表位[17]，以增强其免疫保护效力。由于表位的合理优化和排列组合规律目前仍不清晰，在设计表位疫苗时还需摸索其最佳组合连接方式。如何选择安全高效的免疫佐剂也是设计高效多表位疫苗需要考虑的问题。相信随着科学技术的不断进步，这些问题都会逐步得到解决。多表位疫苗是未来疫苗研究的发展方向，将具有更加广阔的应用前景。
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