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文章信息
- 易叔红, 张留辉, 孙雪松
- YI Shu-Hong, ZHANG Liu-Hui, SUN Xue-Song
- 金属蛋白质组学研究锌离子匮乏对肺炎链球菌的影响
- Effect of zinc depletion on Streptococcus pneumoniae revealed by metalloproteomics
- 微生物学通报, 2017, 44(9): 2161-2171
- Microbiology China, 2017, 44(9): 2161-2171
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170215
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文章历史
- 收稿日期: 2017-03-15
- 接受日期: 2017-06-16
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2017-06-26
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是革兰氏阳性致病菌,能引起肺炎、中耳炎、败血症和脑膜炎等疾病[1]。由于该细菌的强大毒力及对抗生素的抗性,这种感染的预防和治疗成为困扰国际医学界的一大难题。
肺炎链球菌对生长环境要求比较高,尤其是金属离子浓度,但是对于在感染过程中金属离子是如何改变以及金属离子是通过什么方式影响其毒力所知甚少。锌离子是金属离子中较重要的一种离子,是细菌必需的微量元素,对于细菌的生长代谢非常重要,它们通过与相应蛋白结合,尤其是与生物代谢催化剂——酶结合,共同在细菌体内发挥生物作用。锌离子对细菌的粘附力和毒力也有重要影响。在宿主中,锌离子在免疫系统中起着非常重要的角色,它是一些免疫细胞必不可少的成分之一[2-3]。Strand等在老鼠身上做了实验,发现如果体内缺少锌离子,将会增加其感染肺炎和导致死亡的危险[4]。Kloosterman等通过使用高浓度的锌离子去培养肺炎链球菌,结果发现高浓度的锌离子能够增强该菌编码毒力相关蛋白的基因表达[5]。Manzoor等采用转录组学阐明镍离子通过依赖锌离子的阻遏蛋白AdcR来直接参与AdcR调节子的去阻遏作用[6]。Eijkelkamp等通过定量的方法进行研究,结果显示在肺炎链球菌中外部锌离子竞争性抑制锰离子的吸收来应对氧化应激[7]。Martin等通过构建锌离子结合位点的突变株,结果发现锌离子泵出激活子SczA保护了肺炎链球菌免受细胞内部锌离子的毒性[8]。
由此可见,锌离子对于肺炎链球菌的生长及对宿主的感染非常重要。但是因为锌离子代谢系统中蛋白的数量比较多而且结构复杂等因素,到目前为止,还有许多机制不是很清楚[9],比如细菌如何从宿主环境中获取锌离子并传递给膜蛋白进而到细胞内部。本研究采用基于双向电泳的蛋白组学方法,结合本课题组建立的金属亲和层析技术[10]鉴定肺炎链球菌在无锌环境下引起的特定蛋白质的变化,以期揭示锌离子在宿主中的调控机制,这将为基于锌蛋白的疫苗开发以及以其为靶向的抑菌剂的研发起到非常大的推动作用。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株: S. pneumoniae D39菌株来源于英国国家标准菌种收藏中心(伦敦),在37 ℃、5% CO2条件下,THY培养基[10](Todd-Hewitt broth 36.4 g/L,Yeast extract 5 g/L)中进行培养至OD600约为0.6。 1.1.2 主要试剂和仪器: Todd-Hewitt broth、Yeast extract、ZnSO4、MgCl2、MnCl2、CaCl2、尿素、硫脲、3-乙胺-1-丙磺酸(CHAPS)、二硫苏糖醇(DTT)、蛋白酶抑制剂(PMSF)、咪唑、Chelex-100等购自Sigma公司(USA);IPG缓冲液、2D Clean-Up Kit等购自Amersham Biosciences公司(瑞典);胰蛋白酶购自Promega公司(美国);固定化亚氨基二乙酸(Immobilized iminodiacetic acid,IDA)购自Thermo公司(美国);Poly-prep层析柱购自Bio-Rad公司(美国);SDS、Tris-base等购自广州展晨生物公司(中国);NaCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4等购自广州化学试剂厂(中国)。ABI 4800 MALDI-TOF/TOF串联飞行时间质谱仪,Applied Biosystems公司(美国);IPGphor等电聚焦仪、EttanDALT垂直电泳槽、Image Scanner扫描仪,GE公司(美国);垂直电泳仪,Bio-Rad公司(美国)。
1.2 方法 1.2.1 细菌培养: 配制THY培养基,加入5% (质量体积比) Chelex-100螯合并连续搅拌8 h,然后用双层滤纸过滤两次,分别加入100 μmol/L CaCl2、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L MnCl2,得到螯合培养基,其中一组培养基不加锌离子,一组培养基加入最适合细菌生长的锌离子浓度,1×105 Pa高温灭菌30 min,备用。将肺炎链球菌D39分别接种到上述不加锌离子的螯合培养基及加入最适合细菌生长的锌离子浓度的螯合培养基中,于37 ℃、5% CO2、220 r/min下振荡培养,分别按对应时间取出,测定OD600值。 1.2.2 细菌的收集和总蛋白的提取: 测定细菌生长到OD600为0.6时,将样品低温离心(4 ℃,5 000 r/min) 20 min,弃上清,用预冷的无菌PBS (1×PBS,pH 7.2−7.4,Na2HPO4·12H2O 2.830 g,KH2PO4 0.272 g,NaCl 8.700 g,加水至1 L),低温离心(4 ℃,5 000 r/min)洗涤3次,每次10 min,弃PBS,得到菌体。采用超声裂解提取法提取总蛋白,裂解液为:15 mmol/L Tris-HCl、7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% (质量体积比) CHAPS,使用前现加2% (体积比) IPG缓冲液(pH 4.0−7.0)、1% (质量体积比) DTT和1% (质量体积比) PMSF混合物,冰上放置,每隔2 min涡旋10 s,充分振荡,放置液氮中,10 min后取出放入37 ℃恒温箱至解冻,如此反复冻融3次后,将样品超声30 min,加入1% (体积比)核酶,冰上放置30 min,低温离心(4 ℃,12 000 r/min) 10 min,取上清即为总蛋白,Bradford法测蛋白浓度,−80 ℃分装冻存。用2D Clean-Up Kit纯化蛋白样品[11-12]。 1.2.3 Zn-IMAC: 金属亲和层析(IMAC)是一种有效的分离具有金属离子螯合能力的蛋白质或肽的手段,其原理是利用Zn2+、Cu2+等过渡金属离子与蛋白质表面的组氨酸或半胱氨酸配位结合,由于蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同,因而与金属螯合物的亲和力大小不同,从而可选择性地加以分离纯化。Zn-IMAC是将蛋白样品先除盐,然后用固定化亚氨基二乙酸、ZnSO4和Poly-prep层析柱等进行一系列处理得到锌离子结合蛋白样品,具体操作参考文献[10]。 1.2.4 双向凝胶电泳: 加锌组和不加锌组细菌全蛋白样品以80 μg上样,计算样品体积及操作步骤参照文献[12-13]。 1.2.5 图像扫描与分析: 所有银染后的分析胶均用Image Scanner扫描仪同一参数扫描并保存。扫描参数为300 dpi,扫描后存为TIFF格式,然后用ImageMaster 2D Platinum进行图像分析比较实验组和对照组的双向凝胶电泳图谱。将加(不加)锌离子的银染凝胶图谱用图像分析软件ImageMaster 2D Platinum进行比较,选择P < 0.01且差异近2倍及以上的蛋白质点作为候选差异表达蛋白质点进行后续胶内酶解以及质谱分析[14]。 1.2.6 胶内酶解: 用刀片切下胶上目标蛋白点,分组进行脱色、脱水和吸胀操作;加入胰蛋白酶和覆盖液37 ℃水浴酶解16−18 h;转移上清。超声萃取,并将萃取液吸出与之前的上清液对应合并,在真空干燥仪中冻干[11, 15]。 1.2.7 质谱鉴定: 冻干样品用2 μL样品溶解液(30% ACN,0.1% TFA)充分溶解,然后与基质溶解液1:1各0.4 μL点于384孔AnchorChip板上,结晶后采用ABI 4800 MALDI TOF/TOF串联飞行时间质谱仪进行质谱鉴定,然后进行IPI数据库搜库[16]。 1.2.8 差异表达蛋白的功能分类和蛋白质相互作用网络图: STRING是一个预测蛋白质-蛋白质相互作用的数据库,主要用来收集、预测和统计大部分类型的蛋白质-蛋白质关系。用STRING (基因/蛋白质相互作用检索工具)来绘制蛋白质相互作用网络图(http://string-db.org)。参数设置如下:物种:肺炎链球菌;可信度:0.40;相互作用蛋白:不超过10个。 2 结果与分析 2.1 培养基中各金属离子浓度利用电感耦合等离子体发射光谱仪,测定配制好的THY培养基中各种金属离子的浓度,测得的浓度如表 1所示:除了细菌生长必需的钙、镁元素外,锌离子浓度是最高的,其次是铁元素,证实了锌离子对细菌生长的重要性。
金属离子 Metal ion |
浓度 Concentration (μmol/L) |
Mg2+ | 1 667.000 |
Ca2+ | 1 055.000 |
Fe3+ | 13.634 |
Mn2+ | 0.519 |
Zn2+ | 19.308 |
Cu2+ | 0.229 |
Ni2+ | 0.077 |
基于测定的培养基中的锌离子浓度,向经过Chelex-100螯合后的培养基中(已补加细菌生长必需的钙镁离子)加入锌离子,配制不同锌离子浓度的限制性培养基来培养细菌,每隔1 h测量细菌生长情况。每个浓度3个重复样品,3个样品的平均值即为细菌的生长情况,绘制其生长曲线。由图 1可知,当培养基中缺乏锌离子时,细菌生长受到抑制;当向培养基中补加锌离子时,细菌的生长状态得到不同程度的恢复;并且当向螯合培养基中加入锌离子浓度为10 μmol/L时,细菌的生长状况最好。因此,后续实验选取10 μmol/L锌离子作为S. pneumoniae D39的培养条件。
2.3 有无锌离子培养条件下S. pneumoniae D39的2-DE结果为研究S. pneumoniae D39对缺锌环境的适应性生长机制,利用无锌和加入10 μmol/L锌离子的培养基分别培养S. pneumoniae D39,收集对数中期的菌体,提取细菌总蛋白,进行双向凝胶电泳分离,银染显色后得到背景清晰、分辨率高的2-DE图谱(图 2)。使用ImageMaster 2D Platinum软件进行图像分析。经过与有锌组相比,在无Zn2+培养的细菌中发现96个差异表达蛋白斑点,对应67个蛋白,其中35个表达上调,32个表达下调。
2.4 锌离子调控蛋白的功能分类利用质谱对67个特异的差异表达蛋白进行鉴定,通过GO注释,对这些蛋白根据功能进行了分类(表 2)。结果显示这些差异表达蛋白质主要参与翻译作用、乙酰化、多肽合成、核糖体合成、蛋白质折叠、蛋白水解、细菌生长周期调节蛋白、DNA复制或转录、氨基酸代谢、糖代谢、核酸代谢和氧化作用。从表 2中各类的蛋白数量上看,锌离子缺失主要影响了肺炎链球菌的碳水化合物代谢,其次是核酸代谢和氧化作用。另外,发现差异倍数较大的蛋白主要集中在蛋白质翻译和折叠。这些都说明锌离子的缺失对细菌多个重要的代谢通路都有影响(图 3)。
Spot No.a) | Protein Nameb) | Accession No.c) | Protein MW | Protein PI | Protein score | F.D.d) |
Translation | ||||||
66 | Translation elongation factor Tu | gi116075932 | 43 943.4 | 4.86 | 256 | −3.60 |
41 | Translation elongation factor P | gi116076755 | 20 587.4 | 4.86 | 237 | −1000 000 |
77 | Ribosomal protein L10 | gi116077226 | 17 468.5 | 5.08 | 346 | −2.22 |
112B | Translation elongation factor G | gi116077328 | 76 782.8 | 4.86 | 229 | 1 000 000 |
38 | Ribosomal protein S2 | gi116077704 | 28 880.0 | 5.20 | 53 | −1000 000 |
tRNA aminoacylation | ||||||
94B | Alanyl-tRNA synthetase | gi116076189 | 96 465.1 | 5.04 | 243 | 1 000 000 |
103B | Nucleotidyltransferase | gi116076308 | 85 187.1 | 5.11 | 299 | 1 000 000 |
14 | GMP synthase, C-terminal domain | gi116077050 | 57 436.4 | 4.94 | 610 | −1 000 000 |
18 | Lysyl-tRNA synthetase | gi116077666 | 56 645.8 | 5.32 | 291 | −1 000 000 |
Peptide | ||||||
20 | UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase | gi116076748 | 49 397.3 | 5.30 | 95 | −1 000 000 |
Ribosome biogenesis | ||||||
77 | Ribosomal protein L10 | gi116077226 | 17 468.5 | 5.08 | 346 | −2.22 |
Protein folding | ||||||
8 | Chaperone protein DnaK | gi116077074 | 64 772.3 | 4.63 | 78 | −1 000 000 |
Proteolysis | ||||||
111B | Dipeptidase PepV | gi116076357 | 50 718.3 | 4.77 | 335 | 1 000 000 |
121B | Methionine aminopeptidase, type Ⅰ | gi116077102 | 31 629.5 | 4.90 | 278 | 1 000 000 |
81B | Aminopeptidase C | gi116077489 | 50 224.1 | 5.09 | 458 | 2.16 |
Cell cycle or regulation | ||||||
25 | Transcription-repair coupling factor r | gi116076727 | 134 717.8 | 5.45 | 49 | −1 000 000 |
20 | UDP-N-acetylglucosaminepyrophosphorylase | gi116076748 | 49 397.3 | 5.30 | 95 | −1 000 000 |
Carbohydrate metabolism | ||||||
36 | L-lactate dehydrogenase | gi116076178 | 35 333.3 | 5.09 | 80 | −1 000 000 |
5 | Alcohol dehydrogenase, iron-containing | gi116076462 | 97 224.4 | 6.11 | 54 | −1 000 000 |
20 | UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase | gi116076748 | 49 397.3 | 5.30 | 95 | −1 000 000 |
118B | UDP-glucose 4-epimerase | gi116076912 | 37 401.9 | 4.82 | 338 | 1 000 000 |
30 | Phosphoglucomutase/phosphomannomutase family protein | gi116076998 | 48 092.6 | 4.65 | 159 | −1 000 000 |
95B | Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, type Ⅰ | gi116077018 | 35 833.4 | 5.29 | 163 | 4.21 |
27 | Phosphoglycerate kinase | gi116077161 | 41 913.0 | 4.92 | 124 | −1 000 000 |
28 | Phosphopyruvate hydratase | gi116077344 | 47 073.8 | 4.7 | 659 | −1 000 000 |
97B | Thioredoxin | gi116077356 | 11 469.9 | 4.75 | 317 | 5.64 |
40 | Triosephosphate isomerase | gi116077374 | 26 533.3 | 4.75 | 294 | −1 000 000 |
110B | Pyruvate kinase | gi116077446 | 54 720.2 | 5.04 | 157 | −4.18 |
123B | 1-phosphofructokinase, putative | gi116077448 | 32 630.9 | 4.82 | 305 | 1 000000 |
104B | Conserved hypothetical protein | gi116077568 | 60 161.0 | 4.47 | 141 | 1 000 000 |
86B | Deoxyribose-phosphate aldolase | gi116077733 | 22 945.9 | 5.17 | 326 | 2.38 |
48 | dTDP-4-dehydrorhamnose 3, 5-epimerase, putative | gi116077761 | 22 307.3 | 5.17 | 262 | −1 000 000 |
101B | Formate acetyltransferase | gi116077764 | 87 766.6 | 5.10 | 617 | 3.85 |
DNA replication or transcription | ||||||
25 | Transcription-repair coupling factor | gi116076727 | 134 717.8 | 5.45 | 49 | −1 000 000 |
Amino acid metabolism | ||||||
14 | GMP synthase, C-terminal domain | gi116077050 | 57 436.4 | 4.94 | 610 | −1 000 000 |
Nucleotide metabolism | ||||||
80B | Dihydroorotase | gi116076386 | 45 296.2 | 5.29 | 142 | 2.15 |
79 | Adenylate kinase | gi116076453 | 23 706.2 | 4.96 | 99 | −2.12 |
17 | Nicotinate phosphoribosyltransferase, putative | gi116076457 | 55 093.1 | 5.12 | 114 | −1 000 000 |
126B | Dihydroorotate dehydrogenase electron transfer subunit | gi116076552 | 28 864.6 | 5.00 | 362 | 1 000 000 |
92B | Phosphopentomutase | gi116076924 | 44 127.2 | 5.04 | 336 | 3.22 |
90B | Orotidine 5'-phosphate decarboxylase | gi116076925 | 25 420.9 | 5.14 | 75 | 2.81 |
124B | Aspartate carbamoyltransferase | gi116077395 | 34 684.5 | 5.1 | 413 | 1 000 000 |
96B | Dihydroorotate dehydrogenase, catalytic subunit | gi116077633 | 33 146.2 | 5.12 | 186 | 4.29 |
86B | Deoxyribose-phosphate aldolase | gi116077733 | 22 945.9 | 5.17 | 326 | 2.38 |
Oxidation | ||||||
91B | Oxidoreductase, pyridine nucleotide-disulfide, class Ⅰ | gi116075996 | 47 145.6 | 4.83 | 227 | 3.02 |
82B | 6-Phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating | gi116076029 | 52 546.4 | 4.92 | 638 | 2.23 |
36 | L-lactate dehydrogenase | gi116076178 | 35 333.3 | 5.09 | 80 | −1 000 000 |
5 | Alcohol dehydrogenase, iron-containing | gi116076462 | 97 224.4 | 6.11 | 54 | −1 000 000 |
76 | UDP-glucose 6-dehydrogenase, putative | gi116076609 | 46 584.9 | 5.04 | 84 | −2.31 |
95B | Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, type Ⅰ | gi116077018 | 35 833.4 | 5.29 | 163 | 4.21 |
98B | Alcohol dehydrogenase, zinc-containing | gi116077095 | 35 727.4 | 4.95 | 431 | 7.15 |
73 | NADH oxidase | gi116077245 | 50 223.5 | 4.99 | 576 | −2.47 |
96B | Dihydroorotate dehydrogenase, catalytic subunit | gi116077633 | 33 146.2 | 5.12 | 186 | 4.29 |
Other | ||||||
26 | Conserved hypothetical protein | gi116075946 | 25 659.7 | 6.34 | 48 | −1 000 000 |
109 | FeS assembly protein SufB | gi116076250 | 52 643.1 | 4.94 | 260 | 1 000 000 |
122 | Pyridoxine biosynthesis protein | gi116076328 | 31 720.4 | 5.23 | 389 | 1 000 000 |
74 | Aspartate kinase | gi116076370 | 50 176.9 | 5.78 | 48 | −2.41 |
88B | Non-heme iron-containing ferritin | gi116076391 | 19 273.8 | 4.59 | 191 | 2.63 |
75 | Acetate kinase | gi116076433 | 43 315.3 | 5.09 | 62 | −2.35 |
17 | Nicotinate phosphoribosyltransferase, putative | gi116076457 | 55 093.1 | 5.12 | 114 | −1 000 000 |
99B | Galactose-6-phosphate isomerase, LacA subunit | gi116076466 | 15 234.7 | 5.35 | 394 | 48.01 |
129 | LemA protein | gi116076579 | 20 620.8 | 5.66 | 462 | 1 000 000 |
125 | Glucose-1-phosphate thymidylyltransferase | gi116076627 | 32 219.5 | 4.79 | 512 | 1 000 000 |
13 | Metallo-beta-lactamase superfamily protein domain protein | gi116076736 | 61 023.9 | 5.67 | 301 | −1 000 000 |
128 | S-ribosylhomocysteine lyase (autoinducer-2 production protein luxS) (AI-2 synthesis protein) | gi116076775 | 17 912.1 | 5.31 | 322 | 1 000 000 |
31 | N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase | gi116076809 | 41 670.7 | 5.11 | 160 | −1 000 000 |
46 | Glycosyl transferase, group 2 family protein | gi116076827 | 36 143.5 | 5.93 | 140 | −1 000 000 |
115 | Diaminopimelate decarboxylase | gi116076879 | 46 619.4 | 5.15 | 227 | 1 000 000 |
89B | Conserved hypothetical protein | gi116077084 | 19 803.2 | 4.79 | 330 | 2.66 |
67 | Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, NADP-dependent | gi116077099 | 51 044.9 | 5.20 | 172 | −3.50 |
85B | Phosphomethylpyrimidine kinase | gi116077129 | 28 304.6 | 5.97 | 479 | 2.33 |
45 | Cmp-binding-factor 1 | gi116077170 | 36 278.4 | 6.07 | 168 | −1 000 000 |
49 | Hypoxanthine phosphoribosyltransferase | gi116077257 | 20 199.4 | 5.26 | 285 | −1 000 000 |
124 | Aspartate carbamoyltransferase | gi116077395 | 34 684.5 | 5.10 | 413 | 1 000 000 |
127 | Ribosomal subunit interface protein | gi116077494 | 21 086.1 | 5.08 | 452 | 1 000 000 |
50 | Prevent-host-death family protein | gi116077525 | 9 930.0 | 5.14 | 49 | −1 000 000 |
87B | Conserved hypothetical protein | gi116077709 | 37 881.6 | 5.10 | 265 | 2.55 |
102 | Leucyl-tRNA synthetase | gi116077781 | 94 307.5 | 4.92 | 71 | 1 000 000 |
39 | FeS assembly ATPase SufC | gi116077784 | 28 387.5 | 4.67 | 571 | −1 000 000 |
注:a):Spot No.编号对应于图 2A、B上箭头指定的蛋白质点;b):Protein Name来自S. pneumoniae D39数据库;c):Accession No.来自S. pneumoniae D39数据库;d):F.D.是指无Zn2+培养的细菌全蛋白中某蛋白表达量相对有Zn2+培养下同一个蛋白表达量的变化倍数.正值表示蛋白在无Zn2+组中表达上调;负值则表示蛋白在无Zn2+组中表达下调; −1 000 000表示仅在有Zn2+组测得该点;1 000 000则表示仅在无Zn2+组测得该点. Note: a): Spot No. is according to the arrows in the maps marking the position of differentially expressed proteins; b): Protein name is according to S. pneumoniae D39 database; c): Accession No. is according to S. pneumoniae D39 database; d): F.D. represents change fold of proteins altered upon zinc depletion; Positive values mean up-regulated proteins in Zn2+ depletion condition; Negative values mean down-regulated proteins in Zn2+ depletion condition; −1 000 000 means proteins only detected in the condition with Zn2+; 1 000 000 means proteins only detected in Zn2+ depletion condition. |
2.5 锌离子调控蛋白的相互作用网络
登录STRING网站(http://string-db.org),在数据库输入鉴定到的差异表达蛋白的基因名,自动生成蛋白质相互作用图。从图 4可得出,锌离子调控蛋白之间的相互作用比较紧密,图中比较核心的位置的基因所编码的都是与糖代谢相关的蛋白,可知锌离子调控蛋白在细菌的生长代谢中起着重要作用。
2.6 有无锌离子培养条件下S. pneumoniae D39中锌离子结合蛋白的2-DE结果根据以前我们建立的方法[16],用无锌离子和加锌离子的培养基分别培养S. pneumoniae D39提取总蛋白,经过Zn-IMAC分离后,获取锌离子结合蛋白,因为所获蛋白数量较少,将双向电泳的上样量降为30 μg,银染显色后得到两种背景清晰、分辨率高的2-DE图谱(图 5)。胶上显示的蛋白约为200个,对于明显差异的10个胶点进行质谱鉴定,共鉴定出7个蛋白,6个上调,1个下调。
2.7 锌离子结合蛋白的功能分类对这些差异表达的锌离子结合蛋白进行进一步的生物信息学分析,发现这些蛋白主要位于细胞质,分子功能分析发现,这些蛋白具有离子结合功能,包括结合锌离子(bifunctional acetaldehyde-CoA/alcohol dehydrogenase)和镁离子(Lysyl-tRNA synthetase) (表 3和表 4)。
Spot No.a) | Protein Nameb) | Accession No.c) | Protein Mw | Protein pI | Protein score | F.D.d) |
1 | Bifunctional acetaldehyde-CoA/alcohol dehydrogenase | gi116515886 | 97 224.4 | 6.11 | 166 | −2.04 |
3 | Trigger factor | gi116516755 | 47 268.8 | 4.43 | 59 | 1 000 000 |
4 | Elongation factor Tu | gi116515356 | 43 943.4 | 4.86 | 63 | 2.45 |
5 | Elongation factor Tu family protein | gi116516567 | 68 141.0 | 4.81 | 775 | 1 000 000 |
6 | Lysyl-tRNA synthetase | gi116517090 | 56 645.8 | 5.32 | 415 | 1 000 000 |
7 | Beta-galactosidase precursor, putative | gi116515472 | 246 631.6 | 5.81 | 372 | 1 000 000 |
8 | Ornithine carbamoyltransferase | gi116516173 | 37 887.2 | 5.23 | 195 | 2.31 |
注:a):Spot No.编号对应于图 5A、B上箭头指定的蛋白质点;b):Protein Name来自S. pneumoniae D39数据库;c):Accession No.来自S. pneumoniae D39数据库;d):F.D.是指无Zn2+培养的细菌全蛋白经过Zn-IMAC分离后某蛋白表达量相对有Zn2+培养下同一个蛋白表达量的变化倍数.正值表示蛋白在无Zn2+组中表达上调;负值则表示蛋白在无Zn2+组中表达下调; 1 000 000表示仅在无Zn2+组测得该点. Note: a): Spot No. is according to the arrows in the maps marking the position of differentially expressed proteins; b): Protein name is according to S. pneumoniae D39 database; c): Accession No. is according to S. pneumoniae D39 database; d): F.D. represents change fold of proteins altered upon zinc depletion; Positive values mean up-regulated proteins in Zn2+ depletion condition; Negative values mean down-regulated proteins in Zn2+ depletion condition; 1 000 000 means proteins only detected in Zn2+ depletion condition. |
Protein | Function | Location |
Bifunctional acetaldehyde-CoA/alcohol dehydrogenase | Zinc ion binding | Unknown |
Trigger factor | Protein transition | Unknown |
Elongation factor Tu | GTP-binding | Cytoplasm |
Elongation factor Tu family protein | GTP-binding | Cytoplasm |
Lysyl-tRNA synthetase | Magnesium ion binding | Cytoplasm |
Beta-galactosidase precursor, putative | Carbohydrate metabolic process | Cell wall or membrane |
Ornithine carbamoyltransferase | Amino acid binding | Omithine carbamoyltransferase complex |
锌(Zn)是生命代谢中重要的微量金属元素,它是多种生物酶类的重要辅基,如碱性磷酸酶、乙醇脱氢酶、氨基肽酶等;它还参与了糖类、脂类、蛋白质的合成和降解等重要的新陈代谢过程。目前,利用蛋白质组学手段来研究锌离子对肺炎链球菌锌离子调控机制的研究几乎没有。
利用蛋白质组学结合金属亲和层析技术,系统分析锌离子缺失对肺炎链球菌蛋白质表达的影响,得到了一系列不同功能类别的差异表达蛋白。GO功能分析显示锌离子缺失对肺炎链球菌多个代谢通路中的蛋白造成影响,这些锌离子调控蛋白质中占比例最大的是碳水化合物代谢即糖代谢,其次是氧化作用和核酸代谢。我们发现在锌离子匮乏条件下,参与糖代谢的关键酶L-lactate dehydrogenase、phosphoglycerate kinase、triosephosphate isomerase等的表达大大降低。值得注意的是,蛋白相互作用的网络图表明上述几个蛋白在所鉴别的蛋白中处于中心位置(图 4)。下调表达参与糖代谢的这些蛋白中,大部分都属于酶类,在糖代谢中起着非常重要的作用,说明锌离子匮乏阻碍肺炎链球菌的糖代谢;有趣的是,锌离子缺失后导致Aspartate carbamoyltransferase的表达大大上调,促进氨甲酰磷酸与天冬氨酸结合形成氨甲酰天冬氨酸。氨甲酰天冬氨酸通过可逆的环化脱水作用转变成二氢乳清酸。由于蛋白Dihydroorotate dehydrogenase electron transfer subunit和蛋白Dihydroorotate dehydrogenase catalytic subunit的表达上调,又促进催化了二氢乳清酸被氧化成乳清酸,最终促进了尿嘧啶核苷酸的合成。而蛋白Nicotinate phosphoribosyltransferase的表达大大下调,Adenylate kinase的表达也下调,这将影响嘌呤核苷酸的合成。由此表明,锌离子缺失干扰了肺炎链球菌的核酸代谢。
另外,我们发现一些差异表达倍数较高的蛋白主要参与蛋白翻译和合成及正确折叠。在锌离子匮乏条件下,Translation elongation factor P的表达急剧下降,在蛋白质合成中,它是刺激蛋白合成的第一个肽段的关键蛋白[17-18]。同时,Translation elongation factor G的表达大大上调,它在蛋白翻译的两个步骤中起作用,在延伸阶段时,EF-G/GTP与tRNA结合到核糖体的位点A和P,然后促使tRNA结合到位点P和E[19]。并且,Chaperone protein DnaK的表达急剧下降,该蛋白对折叠起着关键作用,防止蛋白在压力条件下降解[20]。由此可知,锌离子匮乏对肺炎链球菌的蛋白翻译和正确折叠有很大影响。
4 结论采用双向凝胶电泳技术,结合金属亲和层析和质谱技术鉴定蛋白,进而通过生物信息学分析蛋白质相互关系,探讨细菌适应锌离子匮乏条件下的关键代谢通路和蛋白。研究结果表明,锌离子缺乏主要调控糖代谢、核酸代谢和氧化还原作用等通路,并且对蛋白质翻译、合成及正确折叠等方面有较大影响。这说明肺炎链球菌为在宿主金属离子限制的条件下生存下来,系统调整多个代谢通路,以保证自身存活并对宿主形成感染。本研究为揭示细菌在宿主环境,特别是金属离子匮乏条件下的适应性生长机制提供理论基础。
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