2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 张旦旦, 窦文芳, 赵军, 史劲松, 许正宏
- ZHANG Dan-Dan, DOU Wen-Fang, ZHAO Jun, SHI Jin-Song, XU Zheng-Hong
- 重组瑞替普酶在毕赤酵母中的表达
- Expression of recombinant reteplase in Pichia pastoris
- 微生物学通报, 2017, 44(9): 2145-2152
- Microbiology China, 2017, 44(9): 2145-2152
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170194
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文章历史
- 收稿日期: 2017-03-08
- 接受日期: 2017-05-22
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2017-06-02
2. 江南大学生物工程学院 江苏 无锡 214122
2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China
血栓性疾病，如急性心肌梗塞(AMI)、深静脉血栓、脑血栓等，发病率很高且呈逐年上升的趋势，此类疾病具有很高的致残率和致死率，而溶栓治疗是主要疗法。组织纤溶酶原激活物(tissue type plasmenogen activator，tPA)又称血管纤溶酶原激活物或外激活物，是由血管内皮细胞产生的一种蛋白质，由527个氨基酸残基组成，相对分子质量为65 kD，可特异性地溶解血凝块中不溶的纤维蛋白[1-2]。tPA作为第2代溶血栓药物的代表，具有人体内天然的蛋白质结构，对人体无明显的免疫原性，且具有良好的溶血栓活性与特异性，但其在血液中的半衰期只有5 min，临床治疗所需剂量高达50−100 mg，大剂量注射和反复注射tPA，不仅使患者经济负担沉重，而且有颅内出血、周身纤溶性出血倾向等副作用[3-4]。
为延长tPA半衰期、降低出血性等副作用，德国Boehringer Mannheim公司针对tPA的特点，利用定点突变技术研制出tPA的突变体，即重组瑞替普酶(Reteplase，rtPA)，包含了原tPA序列中的1−3位及176−527位氨基酸，相对分子量为39 kD。与tPA相比，rtPA与纤维蛋白的亲和力减弱[5]，与血凝块表面的结合可逆，因此在某个部位发生作用后，还可作用于其他部位，且rtPA删除了可与肝细胞结合的EGF区，使其可在血液循环中保留更长的时间而不被清除。rtPA在治疗血栓时，具有半衰期长、溶栓效率高、副作用小等优点，被认为是第三代安全、有效的溶栓药物[6]。
大肠杆菌体系具有遗传背景成熟、生长速率快、周期短、生产成本低等特点，目前对rtPA表达体系的研究多集中于大肠杆菌表达体系。本研究室前期构建了rtPA原核表达体系Escherichia coli BL21(DE3) pET28a-rtPA，但大肠杆菌是原核生物，表达外源蛋白时，不能对蛋白质进行翻译后修饰，使得重组蛋白的生物学活性较低，且复性和纯化工艺复杂、回收率低、成本较高。胡立强等[7]在大肠杆菌(表达载体pET28a)和毕赤酵母(表达载体pPIC9K)中表达可溶性重组蛋白RC28时发现，重组毕赤酵母所得目标蛋白得率较重组大肠杆菌低，但抗病毒活性却是重组大肠杆菌的2倍，与天然蛋白接近，表明毕赤酵母体系虽然操作略显繁琐，培养周期略长，但毕赤酵母作为真核表达体系，可以对重组蛋白进行表达、加工、折叠和翻译后修饰等，可大大提高所表达重组蛋白的生物学活性。邹敏等[8]以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115为表达体系，对重组瑞替普酶进行了较为系统的研究，发现宿主细胞本身分泌蛋白酶，导致目标蛋白有不同程度的降解；方曙光等[9]在研究温度对rtPA表达的影响时发现，乙醇脱氢酶(AOX)和蛋白酶活性直接关系到rtPA的表达强度和降解程度。本研究以3种不同表型的毕赤酵母为表达宿主(蛋白酶缺陷菌株P. pastoris SMD1168、弱AOX菌株P. pastoris KM71、强AOX菌株P. pastoris GS115)，构建rtPA表达体系，探索不同表达体系中rtPA的表达活性，分析蛋白酶和AOX对rtPA表达的影响，寻找最佳表达体系。
1 材料与方法 1.1 菌种和质粒所用的菌株和质粒如表 1所示。
| Strains or plasmids | Characteristics | Source |
| E. coli JM109 | Stored in this lab | |
| E. coli BL21(DE3) pET28a-rtPA | KanR, lac, rtPA-expression | Stored in this lab |
| P. pastoris GS115 | His−, Mut+ | Stored in this lab |
| P. pastoris KM71 | His−, Muts | Stored in this lab |
| P. pastoris SMD1168 | His−, Mut+, protease-deficient | Stored in this lab |
| P. pastoris GS115/pPIC9K-rtPA | His+, Mut+, rtPA-expression | This study |
| P. pastoris KM71/pPIC9K-rtPA | His+, Muts, rtPA-expression | This study |
| P. pastoris SMD1168/pPIC9K-rtPA | His+, Mut+, protease-deficient, rtPA-expression | This study |
| pMD19-T vector | T-vector, AmpR, lacZ, 2.7 kb | TaKaRa |
| pPIC9K | AmpR, KmR, Mobilizable E. coli vector, 9.3 kb | Stored in this lab |
| pPIC9K-rtPA | pPIC9K with rtPA fragment, 10.4 kb | This study |
T4 DNA连接酶、ExTaq DNA聚合酶、限制性内切酶，宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)；小量质粒提取试剂盒及琼脂糖凝胶回收及纯化试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司(上海生工)；凝血酶、纤维蛋白原、tPA抗体，上海源叶生物科技有限公司；纤溶酶原、rtPA标准品(stPA)，中国药品生物制品检定所；蛋白定量检测试剂盒、SDS-PAGE试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；其他试剂为进口或国产分析纯生化试剂。凝胶成像系统、电穿孔仪、基因扩增仪、电泳仪，Bio-Rad公司；台式高速冷冻离心机、移液器，德国eppendorf公司。
1.3 培养基MD培养基(g/L)：葡萄糖20.0，不含氨基酸的酵母氮基(YNB) 13.4，生物素0.000 4。固体培养基添加20 g/L琼脂粉，1.0 mol/L山梨醇，4.0 mg/mL G418，用于毕赤酵母基因工程菌的筛选。BMGY培养基(g/L)：蛋白胨20.0，酵母粉10.0，100 mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)，YNB 13.4，甘油10 mL，生物素0.000 4，用于毕赤酵母基因工程菌的培养。BMMY培养基：BMGY培养基添加20 g/L甲醇，用于毕赤酵母基因工程菌的诱导表达。大肠杆菌培养用LB培养基，酵母培养用YPD培养基[10]。
1.4 DNA操作大肠杆菌DNA操作参考文献[11]，大肠杆菌感受态的制备采用上海生工超级感受态制备试剂盒；毕赤酵母感受态制备和转化方法参考文献[10]。
1.5 rtPA毕赤酵母表达体系的构建方法 1.5.1 目的基因rtPA扩增: 根据rtPA的基因序列，设计上下游引物P1、P2。引物由上海生工合成。P1：5′-GGGGTACGTAGAGAAAAGAATGT CTTATCAGGGAAAC-3′ (SnaB Ⅰ)；P2：5′-GGGGGCGGCCGCTCACGGTCGCATGTTGTC-3′ (Not Ⅰ)。以质粒pET28a-rtPA为模板，P1、P2为引物，扩增rtPA基因，PCR反应体系(50 μL)：10×ExTaq DNA聚合酶缓冲液5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，上游引物(100 μmol/L) 2 μL，下游引物(100 μmol/L) 2 μL，模板2 μL，10×ExTaq DNA polymerase (5 U/μL) 0.5 μL，ddH2O 34.5 μL。PCR反应条件：95 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，57 ℃ 60 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。所得目的片段两端带SnaB Ⅰ和Not Ⅰ限制性酶切位点。
1.5.2 克隆质粒pMD19-T-rtPA的构建: 将扩增得到的rtPA基因连接至pMD19-T载体，连接体系及条件参考Takara pMD19-T Vector Cloning Kit说明书；将连接产物转化至E. coli JM109中，经蓝白斑筛选、SnaB Ⅰ和Not Ⅰ双酶切验证，获得阳性转化子；提取重组质粒pMD19-T-rtPA，送上海生工测序。 1.5.3 重组表达质粒pPIC9K-rtPA的构建: 提取重组质粒pMD19-T-rtPA和穿梭质粒pPIC9K，分别利用限制性内切酶SnaB Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切，应用上海生工的胶回收试剂盒回收并纯化线性片段rtPA和pPIC9K，将rtPA连接至质粒pPIC9K，连接体系及条件参考Takara T4 DNA连接酶说明书。连接产物转化至E. coli JM109中，经抗性筛选，SnaB Ⅰ和Not Ⅰ双酶切验证，获得阳性转化子E. coli JM109 pPIC9K-rtPA。 1.5.4 重组毕赤酵母的构建: 提取重组质粒pPIC9K-rtPA，Sal Ⅰ酶切使质粒线性化，反应体系(100 μL)：乙酰化BSA 10 μL，10×buffer H 10 μL，重组质粒pPIC9K-rtPA 40 μL，Sal Ⅰ (10 U/μL) 3 μL，ddH2O 37 μL。37 ℃恒温4 h，反应液经电泳、回收、纯化得到线性化片段pPIC9K-rtPA，应用电击转化法分别转化至P. pastoris GS115、KM71、SD1168感受态细胞中，转化液涂布于MD-G418平板，30 ℃恒温培养48−72 h，挑取单菌落，经PCR验证获得阳性转化子，即重组菌P. pastoris GS115/pPIC9K-rtPA、P. pastoris KM71/ pPIC9K-rtPA、P. pastoris SD1168/pPIC9K-rtPA。 1.6 重组菌的诱导表达方法挑取MD-G418平板上的阳性转化子，划线分离3次以上获得纯菌落；取单菌落接种于50 mL BMGY培养基，30 ℃、200 r/min振荡培养36 h左右至对数中后期；取种子液5 000 r/min离心5 min，去上清，加入15 mL BMMY培养基重悬细胞；将重悬细胞转移至无菌的三角瓶中，于30 ℃、200 r/min下进行诱导培养；每24 h补加甲醇至终浓度1%，使甲醇总添加浓度为5%，持续诱导培养96 h。培养液经12 000 r/min离心2 min，取上清为粗蛋白液。
1.7 发酵液中rtPA的检测(1) 发酵液中蛋白总量的检测采用上海碧云天生物技术有限公司的蛋白定量检测试剂盒；(2) 按照试剂盒方法配制12%的SDS-PAGE，进行发酵样品的非还原性电泳，每孔上样量为10 μL，电泳结束后对表达产物进行Western blot鉴定[12]；(3) rtPA活性鉴定采用改良的纤维蛋白平板溶圈法[3]，取制好的纤维蛋白平板(1.0%琼脂糖凝胶、1 mg/mL纤维蛋白原、0.1 U/mL凝血酶)，按需在平板上打孔(Ф=2 mm–4 mm)，每孔内注入0.04 U (4 μL)纤溶酶原、10 μL发酵上清或rtPA标准品并以PBS补足20 μL；将平板置恒温培养箱内，37 ℃温育20 h。分别测量溶圈相互垂直的两直径D1与D2，以其乘积的对数(lgD1D2)为纵坐标，以stPA单位活性(0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 U)的对数为横坐标，绘制标准曲线，并线性拟合得y=0.399 6x+2.705，其相关系数为0.981 2。
2 结果与分析 2.1 重组质粒pMD19-T-rtPA和pPIC9K-rtPA的构建质粒pPIC9K为毕赤酵母分泌型表达载体，重组表达质粒构建过程如图 1所示，经SnaB Ⅰ和Not Ⅰ双酶切验证，克隆质粒pMD19-T-rtPA (图 1B)和表达质粒pPIC9K-rtPA (图 1C)构建成功。将重组质粒pPIC9K-rtPA送上海生工测序，rtPA基因序列与预期完全一致，表明表达载体pPIC9K-rtPA构建成功。
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| 图 1 重组质粒pMD19-T-rtPA和pPIC9K-rtPA的构建与验证 Figure 1 Construction and verification of recombinant plasmid pMD19-T-rtPA and pPIC9K-rtPA Note: M1: DL5000 marker; M2: λ-Hind Ⅲ marker; M3: DL2000 marker; 1: rtPA; 2: Digestion bands of pMD19-T-rtPA; 3−5: Digestion bands of pPIC9K-rtPA. |
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为探索rtPA的最佳毕赤酵母表达体系，以3种不同表型的P. pastoris GS115、SMD1168和KM71为表达宿主，以分泌型表达质粒pPIC9K为载体，构建3种毕赤酵母分泌表达体系。以限制性内切酶Sal Ⅰ消化重组质粒pPIC9K-rtPA，使其线性化(目的条带约10.3 kb)，并将其分别电击转化至3株毕赤酵母的感受态细胞中，转化物涂布于MD-G418平板，于30 ℃培养48−72 h至长出单菌落；挑取单菌落，以P1、P2为引物进行菌落PCR验证(图 2)，结果表明重组菌构建成功。挑取阳性菌落在MD-G418平板上分离纯化3次以上得到纯菌落。
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| 图 2 重组菌的菌落PCR验证 Figure 2 PCR verification of recombinant strains Note: M: DL5000 DNA marker; 1: P. pastoris GS115; 2−6: Transformant of P. pastoris GS115; 7: P. pastoris SMD1168; 8−12: Transformant of P. pastoris SMD1168; 13: P. pastoris KM71; 14−17: Transformant of P. pastoris KM71. |
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3种重组菌按1.6中的方法进行诱导表达，取发酵上清液，以Western blot验证蛋白合成情况(图 3)，结果显示目标蛋白质分子量约为43 kD，较理论分子量(39 kD)大，可能为糖基化所致；重组菌P. pastoris GS115/pPIC9K-rtPA和KM71/pPIC9K-rtPA均在39 kD处出现特异性条带，可能为未经糖基化的目标蛋白或糖基化后又降解的蛋白条带，前者在32 kD处有轻微降解条带，而后者并无此现象，由此可见，前者的表达量和降解程度均较后者大，说明在宿主自有蛋白酶的作用下，降解程度与表达量成正比；而重组菌P. pastoris SMD1168/pPIC9K-rtPA表达产物无降解现象，说明宿主蛋白酶缺失可有效避免目标蛋白的降解。
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| 图 3 重组菌发酵液的Western blot鉴定 Figure 3 Western blot of recombinant strains fermentation supernatant Note: M: Marker; 1: stPA (39 kD); 2: Fermentation supernatant of P. pastoris KM71/pPIC9K-rtPA; 3: Fermentation supernatant of P. pastoris SMD1168/pPIC9K-rtPA; 4: Fermentation supernatant of P. pastoris GS115/pPIC9K-rtPA. |
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重组菌P. pastoris GS115/pPIC9K-rtPA、SD1168/pPIC9K-rtPA、KM71/pPIC9K-rtPA诱导表达所得重组蛋白分别为rtPA-GS115、rtPA-SD1168、rtPA-KM71，表达量分别为256、174、105 mg/L (表 2)。采用纤维蛋白平板法半定量检测表达产物活性，结果如图 4所示：纤维蛋白平板上均出现溶圈反应，表明重组菌所表达产物均有溶栓活性，其中rtPA-GS115与rtPA-SD1168的溶圈半径相近，生物活性也相近，分别为2.99×104 U/L和2.60×104 U/L，而后者比活性较前者高27% (表 2)，分析原因为重组蛋白降解导致rtPA-GS115的部分失活，说明目标蛋白的完整性直接决定了其生物活性；rtPA-KM71表达量和活性均为最低，说明强AOX启动子更有利于目标蛋白的表达。
| Strains | Total protein (mg/L) | rtPA activity (×104 U/L fermentation supernatant) | rtPA activity (U/mg protein) |
| P. pastoris GS115/pPIC9K-rtPA | 256±16 | 2.99±0.21 | 117±0.7 |
| P. pastoris SMD1168/pPIC9K-rtPA | 174±23 | 2.60±0.18 | 149±9.3 |
| P. pastoris KM71/pPIC9K-rtPA | 105±12 | 1.12±0.19 | 90±5.4 |
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| 图 4 rtPA的溶圈反应 Figure 4 Fibrin agarose plate assay of rtPA Note: A1−A5: stPA (0.5, 0.25, 0.125, 0.062 5, 0.031 25 U); B1: Fermentation supernatant of P. pastoris GS115; B2−B3: Fermentation supernatant of P. pastoris GS115/pPIC9K-rtPA; B4−B5: Fermentation supernatant of P. pastoris SMD1168/pPIC9K-rtPA; B6−B7: Fermentation supernatant of P. pastoris KM71/pPIC9K-rtPA. |
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近年来，对于rtPA的研究多集中于E. coli表达体系，众多的自由巯基使该蛋白在E. coli中表达时极易发生二硫键的错配，造成目标蛋白错误折叠，以不溶且无活性的包涵体形式存在于细胞内，需要通过体外重折叠复性来恢复其天然构象[13-14]。王俊雄等[14]构建了E. coli rtPA表达体系，包涵体产量达到1.7 g/L，在800 μg/mL蛋白复性液中，目标蛋白复性收率仅为13%，即目标蛋白的实际产量仅为221 mg/L，王伟等[15]研究了原核表达体系中rtPA包涵体的复性方法，最优条件下复性收率也仅为20%；禚孝发等[16]引入二硫键异构酶DsbC介导rtPA折叠过程中错配二硫键的异构，从而使其在E. coli中的可溶性蛋白表达率提高到60%，但重组蛋白产量仅为70 mg/L。相较E. coli表达系统，P. pastoris基因表达系统能使产物有效分泌至细胞外并适当糖基化，蛋白表达量及活性表现较好[17]，邹敏等[8]构建了P. pastoris GS115表达体系，高密度表达条件下rtPA的最高产量可达487 mg/L，且为可溶性表达，经一步亲和层析即得到高纯度目标蛋白[18]，纯化路径短、收率高，更有利于控制生产成本和生产效率。目前已经有400多种外源蛋白在毕赤酵母系统得到有效表达，被认为是最安全有效的酵母表达系统。
本研究中所用的P. pastoris均为目前常用的表达系统，其中P. pastoris GS115含有AOX1和AOX2两个启动子，能够在含有甲醇的培养基上快速生长(Mut+，methanol utilization plus phenotype)；菌株P. pastoris KM71的AOX1启动子被S. cerevisiae ARG4基因插入失活，因此，只能利用较弱的AOX2进行甲醇的代谢，在甲醇作为碳源时生长缓慢(Muts，methanol utilization slow phenotype)；菌株P. pastoris SMD1168为蛋白酶缺陷型(protease-deficient)，该表达系统可防止外源蛋白被宿主蛋白酶降解，从而保持完整的生物学活性[19]。本研究通过分泌型表达载体pPIC9K，在上述3种不同表型的P. pastoris中成功构建rtPA表达体系，经鉴定rtPA蛋白分子量约为43 kD，rtPA-GS115和rtPA-KM71均在39 kD处有特异性条带，可能为未经糖基化的目标蛋白或糖基化后又降解的蛋白条带，具体来源尚有待研究；rtPA-GS115在32 kD处有轻微降解条带，而rtPA-SMD1168无降解现象，且rtPA-SMD1168比活性较rtPA-GS115高27%，说明宿主蛋白酶缺失可有效避免目标蛋白的降解，保持产物的生物活性；rtPA-KM71表达量和活性均为最低，说明强AOX启动子更有利于目标蛋白的表达，但高表达也加速了产物的降解。
综上所述，从产物活性角度分析，P. pastoris SD1168可作为rtPA的最佳表达体系；邹敏等[8, 20]通过改变P. pastoris GS115的诱导培养条件，抑制蛋白酶活性，有效控制了rtPA的降解，因此，在控制宿主蛋白酶活性、减少产物降解的前提下，P. pastoris GS115也是rtPA表达的优选体系。
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