苯系物是苯及其衍生物的总称，被广泛用于油漆、纺织、合成橡胶等行业，是人类活动排放的常见污染物，代表性的有苯(benzene)、甲苯(toluene)、苯乙烯(styrene)等。由于苯系物有较强的挥发性，其生产和运输过程易造成大气污染，形成光化学烟雾^[1]。许多苯系物对人体有较大毒性，如苯、甲苯、苯乙烯不仅有遗传毒性还能够对中枢神经系统产生麻痹作用，引起急性中毒，其中苯、苯乙烯已经是明确的致癌物^[2]。

生物法处理苯系物废气的工艺简单，成本低廉，无二次污染，因此受到广泛关注。段传人等^[3]筛选到的真菌Aspergillus versicolor 8 d内对439.3 mg/L苯的降解率达78.56%。Jiang等^[4]从工业石油废水中筛选到的细菌Comamonas sp.能够在32 h内将150 mg/L的BTEX (benzene，toluene，ethylbenzene和o-，m-，和p-xylene)完全降解。Reardon等^[5]的研究显示，Pseudomonas putida F1能够在15 h内将15 mg/L的苯和甲苯完全降解。已报道文献中，菌种对较高浓度苯系物的降解周期偏长，处理效率偏低，菌株对苯系物的吸附、摄取鲜有研究。因此从典型工业现场筛选高效苯系物降解菌，分析菌株的降解特性具有重要意义。本文以苯系物中具有代表性的苯、甲苯和苯乙烯为唯一碳源，从石化公司废水处理系统中筛选出一株苯系物降解菌，研究其对苯系物的降解特性，探讨底物间相互作用对降解情况的影响，为苯系物的生物处理提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

苯、甲苯和苯乙烯，国药集团化学试剂有限公司。GC-2010气相色谱仪，岛津企业管理(中国)有限公司。

1.2 菌株和培养基

菌株筛选自中国石油辽阳石化分公司动力厂450#污水处理系统的污水。

无机盐培养基(g/L)：K₂HPO₄ 1.550，NaH₂PO₄ 0.825，NH₄Cl 1.340，MgSO₄·7H₂O 0.500，CaCl₂ 0.075，1 mL微量元素溶液(g/L，FeSO₄·7H₂O 4.500，ZnSO₄·7H₂O 0.148，MnSO₄·H₂O 0.258，CoCl₂·6H₂O 0.024，NiCl₂·6H₂O 0.022，CuCl₂ 0.013，Na₂MoO₄·2H₂O 0.100，H₃BO₃ 0.062)，1×10⁵ Pa灭菌30 min，灭菌后添加经0.22 μm微孔滤膜过滤的苯、甲苯、苯乙烯的混合物(体积比为1:1:1) 作为碳源。无机盐固体培养基在液体培养基的基础上添加2%琼脂。LB培养基配方参考於建明等^[6]的研究。

1.3 菌株的分离纯化

污水摇匀后以5% (体积比)的接种量转接至含200 mg/L苯系混合物的无机盐培养基，30、170 r/min条件下每2 d转接一次进行驯化培养。培养过程用封口膜密封瓶口，防止苯系物挥发。驯化中的菌液稀释涂布无机盐固体培养基，挑选单菌落进行平板划线分离。

1.4 菌株的鉴定

菌株的形态及生理生化特性的鉴定参考《常见细菌系统鉴定手册》^[7]。分子生物学鉴定以菌株基因组为模板，采用通用引物27F (5′-AGAGTTTGA TCMTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTG TTACGACTT-3′)扩增16S rRNA基因^[8]。扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测得结果在GenBank中进行同源性比对，利用MEGA 5.0软件构建系统发育树。

1.5 菌株对单一底物和混合底物的降解情况

向盛有50 mL无机盐培养基的250 mL锥形瓶中分别加入适量的单一底物苯、甲苯、苯乙烯以及等比例互相混合的苯、甲苯和苯乙烯，使每个锥形瓶中的底物浓度为200 mg/L，定时测定培养液中残留的底物，计算降解率。

1.6 菌株吸附、摄取苯的机理

采用BATH法^[9]测定细胞的疏水性。乳化能力和排油圈直径的测定参考文献[10]。

以代表性的苯为研究对象考察SW-3对苯系物的吸附量及胞内储存量。菌悬液接种于含200 mg/L苯的无机盐培养基，分别在2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50 min时离心菌体(4 000 r/min，10 min)，无机盐培养基清洗1次，乙醇/丁醇/氯仿(体积比10:10:1) 清洗2次，再用无机盐培养基清洗2次，合并清洗液(清洗液中的苯含量即为细胞表面吸附的苯含量)；对收集的菌体进行超声破壁并离心，上清液中的苯含量即为胞内的苯富集量^[10]。

1.7 分析方法

1.7.1 苯系物浓度的测定: 称重法取5 g培养液于20 mL的顶空瓶中，采用顶空气相色谱法测定苯、甲苯和苯乙烯的含量。顶空条件：炉温80，定量环温度90，传输线温度100，平衡时间30 min，GC循环时间31 min。色谱条件：色谱柱：HP-INNOWAX (30 m×0.25 mm×0.25 mm)；柱温：40保持3 min，之后15升温到90，保持3.5 min；进样口温度：220；FID检测器温度：250；载气(N₂)流量2 mL/min；H₂流量30 mL/min；空气流量300 ml/min；分流比10:1。在该气相色谱条件下，苯、甲苯和苯乙烯的出峰时间分别在2.797、4.142和6.975 min。

1.7.2 降解率计算方法: 降解率=(苯系物减少量-苯系物挥发量)/(苯系物初始量-苯系物挥发量) ×100%。

1.7.3 菌体生物量的测定: 采用可见分光光度法测定不同浓度培养液在600 nm下的吸光值(OD₆₀₀)，同时测定不同浓度培养液对应的菌体干重，每个浓度做3个平行，绘制吸光值与细胞干重标准曲线，根据不同吸光值计算细胞干重^[6]。

1.7.4 菌体的透射电镜观察: 将SW-3分别接种于LB培养基和含200 mg/L苯的无机盐培养基，培养32 h，菌液经适当稀释后滴在铜网膜上，待样品干燥后，通过透射电镜观察不同培养条件下菌体的形态结构。

2 结果与分析 2.1 苯系物降解菌的分离和鉴定

经3次纯种分离纯化，从工业石油废水筛得一株苯系物降解菌SW-3。在LB固体培养基培养36 h可形成表面光滑、边缘整齐的浅黄色圆形菌落(图 1B)。观察LB培养基中菌体的透射电镜图(图 1C和1D)可知，SW-3为杆菌，大小约为0.5 μm×1.6 μm，具有单端鞭毛和不规则荚膜。菌株SW-3的具体生理生化特性如表 1所示，接触酶阳性、淀粉水解和甲基红试验阴性，与於建明等^[6]报道的苯乙烯降解菌P. putida的生理特性一致。

对菌株SW-3的16S rRNA基因测序得到1 398 bp序列，上传至NCBI获得GenBank登录号为KU170625。系统发育树如图 2所示，菌株SW-3与Pseudomonas putida D15 (EU046322.1) 的序列相似性达100%，D15是来源于土壤的铁载体产生菌，菌落呈圆形、表面光滑且有一定黏性，显微镜下细胞呈短杆状，革兰氏染色阴性^[11]。结合16S rRNA基因分析和生理生化鉴定确定SW-3为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida。

2.2 最适条件下P. putida降解苯系物的动力学特性

将菌悬液以5%的接种量投加到苯系物总浓度为200 mg/L无机盐培养基，以预实验确定的最适降解条件(30、pH 7.0、170 r/min、底物浓度200 mg/L)进行培养。如图 3所示，苯的降解速率最高，接种后32 h降解率达到87.87%；其次是甲苯，48 h达最大降解率81.56%；苯乙烯的降解在初始的24 h较为缓慢，随后迅速增加，在40 h时达最大降解率72.81%。SW-3最大比生长速率出现在第7.5 h，最大值为0.195 0 h^-1，单位菌体(干重)对苯、甲苯和苯乙烯的最大降解速率分别为0.072、0.035、0.019 g/(L·h)。随着底物的消耗逐渐进入稳定期，在40 h时菌体量的积累达最大值0.145 g/L。

2.3 底物间相互作用对降解情况的影响

2.3.1 菌株对单一底物的降解: 苯、甲苯、苯乙烯分别作为唯一碳源的降解情况如图 4A所示，苯为唯一碳源的降解速度最快，没有明显滞后期，在接种24 h后降解率达85.66%。甲苯为唯一碳源的降解经历了滞后期，在接种后36 h内菌体量及甲苯降解率均较低，之后迅速增加，在72 h时达到最大降解率42.70%。苯乙烯作为唯一碳源的降解率明显低于苯和甲苯的降解率，接种80 h后降解率不足20%，菌体量的积累也明显少于苯和甲苯为唯一碳源的情况，接种60 h后菌体干重仅为0.1 g/L。

2.3.2 菌株对混合苯系物的降解: 将SW-3分别接种于以苯、甲苯和苯乙烯的双混合物和三混合物为碳源的培养基中，考察底物间的相互作用^[12]。与单一底物时的降解情况相比，甲苯与苯作为混合底物时(图 4B)，甲苯的降解受到促进，不再出现明显的滞后期，接种72 h降解率达85.89%；甲苯与苯乙烯作为混合底物时(图 4C)，甲苯的降解受到抑制，而苯乙烯的降解则受到轻微的促进；苯乙烯与苯作为混合底物时(图 4D)，苯乙烯的降解受到较强促进作用。由于苯系物降解酶系活性的高低大多受降解产物的诱导，易降解底物形成的中间产物能对其他底物的降解形成诱导^[13]。因此，在苯、甲苯和苯乙烯混合底物的降解实验中(图 3A)，甲苯和苯乙烯的降解率由于易降解底物苯的存在而明显提高。Jiang等^[4]研究的Comamonas sp.能够降解150 mg/L混合苯系物，Reardon等^[5]研究的Pseudomonas putida F1能够降解15 mg/L的苯和甲苯，而SW-3能够高效降解200 mg/L混合苯系物，此外，与高浓度苯系物降解真菌Aspergillus versicolor^[3]相比，SW-3的降解时间更短。

2.4 SW-3吸附、摄取苯的机理

2.4.1 SW-3对底物的摄取方式: 乳化性和排油圈的大小可衡量培养液是否含表面活性物质，疏水性则表征细胞对底物的黏附性，高的疏水性使菌体更易与底物接触。从图 5可以看出，SW-3的乳化效果较好，48 h后乳化性达54.65%，排油圈直径达5 cm。通常排油圈大于3 cm即可认为菌液中有表面活性物质。随着反应进行，菌株的疏水性不断上升，最高达48.94%。综上分析，SW-3在利用苯系底物的过程中产生表面活性物质，表面活性剂促进了底物的溶解，更利于菌体的摄取。

2.4.2 菌株对苯系物的吸附规律: 实验考察50 min内菌体吸附苯的变化。从图 6A可以看出，初期菌株对苯的吸附浓度较低，随后逐渐增加，10 min后达到最大吸附浓度2.1 mg/L，30 min后吸附量趋于稳定。这与菌株对底物的摄取方式有关，在接种初期菌体代谢水平低，表面活性剂产量少，菌株疏水性不高，所以对苯的吸附浓度较低。菌株适应新环境后产生更多的表面活性剂分泌至胞外，分散乳化底物，使其更易被吸附，因此菌体对苯的吸附浓度不断增加。受底物和菌体量的限制，表面活性剂不会持续产生，所以苯的吸附浓度也保持基本稳定。

2.4.3 菌株对苯系物的运输方式: 以200 mg/L苯为唯一碳源，比较50 min内SW-3吸附和富集苯浓度的区别。如图 6A所示，在同一时间点吸附在菌体表面的苯浓度均少于富集于菌体内的，说明SW-3沿着逆浓度梯度向胞内运输苯。参考刘音颂^[10]的研究，采用氧化磷酸化抑制剂NaN₃阻止ATP的生成来进一步验证苯的运输方式。在含不同浓度NaN₃的培养基中培养30 min后测定细胞内的苯浓度。结果如图 6B所示，少量NaN₃的添加即能显著减少菌体内苯的富集量，添加量越大，菌体内的苯富集量越少。该结果暗示SW-3对苯的运输过程是耗能的。

2.4.4 菌株的透射电镜分析: 利用TEM观察以苯为碳源培养32 h的菌体，结果如图 7所示。与LB培养基培养的菌体(图 1C，1D)相比，菌株的细胞状态有较大改变，由原来的长杆状变为椭球形或锥形，荚膜增厚，菌体内出现了透明的包含物^[14]。Rocha等^[15]对柴油和烷烃降解菌的研究也观察到类似包含物，并推测其可能与有机底物的代谢废物或未降解底物的储存有关。培养过程中菌体周围黏附许多黏性物质，可能为细胞分泌的表面活性剂和被表面活性剂乳化的底物。

3 结论

(1) 以苯、甲苯和苯乙烯为唯一碳源，筛选到一株苯系物降解菌。经鉴定，该菌为Pseudomonas putida，命名为SW-3菌株。

(2) 在苯系物最佳降解条件下，SW-3的最大比生长速率为0.195 0 h^-1；单位菌体(干重)对苯、甲苯和苯乙烯的最大降解速率分别为0.072、0.035和0.019 g/(L·h)，接种40 h降解率分别达86.83%、80.32%和72.81%。

(3) 菌SW-3能够降解单一底物的苯、甲苯和苯乙烯，且对苯的降解效果最佳。在双底物降解实验中，甲苯的降解能够被苯乙烯抑制，而苯乙烯的降解在有苯和甲苯存在时显著提高。

(4) 乳化性、排油圈、细胞疏水性和透射电镜观察等分析表明SW-3在自身分泌的表面活性剂的协助下以耗能的方式运输苯。