高山湖泊是指位于地势较高的由地表的洼地蓄水而成的水域^[1]。高山湖泊大多地处偏僻，较少受到人为活动的影响，而且长期处于低温寒冷和寡营养的状态^[2-4]。以中国云南、四川、青藏等5个省份为代表的西南地区分布着数量众多的的高山湖泊，该地区湖泊一般具有水深暗陡的形态特征，湖泊换水周期长，生态系统较脆弱^[5]。高山湖泊生态系统中的微生物是一个多元化群体生态系统的有机组成部分，参与湖泊生态系统中绝大多数生物活性元素的形态转化和地球化学循环，并与它们所处的环境互利共生、相互影响^[6]。高山湖泊生态系统中的微生物除了具有生物学意义外，也是全球气候变化、人类活动对生态环境影响的敏感指示器^[7]。研究表明，高山地区对全球气候变暖具有放大作用，高海拔地区的气温增长趋势明显高于低海拔地区^[8-9]。因此，对高山湖泊系统中可培养微生物的物种组成和生态特征进行研究具有重要意义。

早在20世纪末，美国、澳大利亚、英国等国家的微生物学者和地质学家开始对湖泊中的微生物群落特征、多样性与其水体化学特征的关系以及从湖泊微生物生态及水文等多方面研究了高山湖泊对工业化和气候变化的响应^[10-16]。Zwart等^[17]对世界各地11个湖泊和2个河流的细菌16S rRNA基因序列研究表明，淡水中细菌主要由α-、β-Proteobacteria和CFB、Actinobacteria、Verrucomicrobia组成。与其他国家相比，国内对高山湖泊中微生物的研究还在起步阶段，并且研究领域较有限，研究最多的地区主要集中在青藏高原。近年来，关于青藏高山湖泊微生物多样性及所产胞外分泌物的研究工作表明，其高山湖泊中含有很高的细菌群落多样性，主要包括α-、β-、γ-Protobacteria和Actinobacteria、Cyanobacteria、CFB等^[18]。青藏高山湖泊的细菌与其它高山湖泊有相同的优势菌群β-Proteobacteria^[18-20]。另外，从高山湖泊中也分离、筛选出了大量可培养的嗜冷菌及其所产的胞外嗜冷酶和胞外多糖等^[7]。细菌胞外酶的种类有很多，如蛋白酶和纤维素酶等。微生物分泌的胞外蛋白酶在氮代谢和氮循环过程中扮演了重要角色^[21]。纤维素酶是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，在分解纤维素时起生物催化作用。在各种水生环境中，细菌可以通过产生纤维素酶降解水中的纤维素为自身提供葡萄糖等各种碳源。胞外多糖(EPS)是各类微生物常分泌的一种胞外高分子有机聚合物。胞外多糖在帮助细菌的黏附以及在低温和寡营养的水生环境中存活和生长具有重要的作用^[22]。因此，对高山湖泊极端环境分泌的胞外分泌物进行系统研究有助于发现新型蛋白酶、纤维素酶和胞外多糖，也为解析微生物及其胞外分泌物与环境之间的相互影响提供了科学依据。

由于西南地区山地地形复杂，经向、纬向跨度和垂直高差均很大，且常年受亚热带季风和高原气候影响，西南地区湖泊历来都是研究者们进行气候演化和地质活动及湖泊生态系统等方面研究的热点所在。然而对高山湖泊中微生物的多样性及其所产胞外分泌物的研究较少，特别是对可培养细菌的物种组成与环境之间的关系方面的报道更为有限。对该生态条件下的微生物进行系统深入的研究，有助于对西南地区气候、地质演化及与人类活动影响关系的认识。本文选取了西南地区海拔高于1 100-4 200 m之间的4个湖泊为研究对象，通过对这4个高山湖泊中可培养细菌的分离纯化及16S rRNA基因序列分析，探讨各个高山湖泊中可培养细菌的组成情况，并对它们分泌的胞外蛋白酶、纤维素酶和胞外多糖进行了系统的比较研究，揭示了4个不同西南高山湖泊的可培养细菌及产胞外分泌物的多样性与生存环境之间的关系，为揭示微生物在该环境中可能的作用提供了重要的理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

1.1.1 样品采集: 从云南雷波的马湖(103°15′36.5″E，28°6′36.1″N)、中缅边境的凯邦亚湖(97°37′12.4″E，24°37′24.4″N)、沙德的莲花湖(101°12′36.4″E，29°26′24.9″N)和四川腾冲的青海湖(98°22′12.3″E，24°35′24.4″N) 4个湖泊采集水样(图 1)，4个湖泊的海拔高度分别为1 100、1 312、4 200和1 950 m。样品放置4 ℃保存，然后进行菌株的筛选。

1.1.2 主要试剂和仪器: 刚果红染色液(1 g/L)、1 mol/L NaCl溶液、3, 5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、四水酒石酸钾钠、重蒸苯酚、无水亚硫酸钠、葡萄糖均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Biospin基因组提取试剂盒购自杭州博日公司；PCR产物纯化试剂盒购自美国Omega公司。PCR仪，北京东胜创新生物科技有限公司；高压蒸汽灭菌锅，上海华线医用核子仪器有限公司；恒温振荡培养箱，太仓市豪诚实验仪器制造有限公司；凝胶成像仪、电泳仪，Bio-rad公司。

1.1.3 分离培养基: (1) LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母提取液5.0，氯化钠10.0，pH 7.0。98 kPa灭菌30 min。

(2) LB琼脂培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母提取液5.0，氯化钠10.0，琼脂20.0，pH 7.0。98 kPa灭菌30 min。

1.1.4 筛选培养基: (1) 蛋白酶筛选培养基(g/L)：脱脂牛奶10.0，蛋白胨5.0，酵母提取液1.0，琼脂20.0，pH 7.0。98 kPa灭菌30 min。

(2) 纤维素酶筛选培养基(g/L)：羧甲基纤维素钠20.0，蛋白胨5.0，酵母提取液1.0，琼脂20.0，pH 7.0。98 kPa灭菌30 min。

(3) 胞外多糖筛选培养基(g/L)：葡萄糖30.0，蛋白胨5.0，酵母提取液1.0，琼脂20.0，pH 7.0。68 kPa灭菌20 min。

1.1.5 发酵培养基: (1) 蛋白酶和纤维素酶发酵培养基(g/L)：玉米粉20.0，麸皮10.0，豆粕10.0，Na₂HPO₄ 1.0，KH₂PO₄ 0.3，CaCl₂ 1.0，Na₂CO₃ 1.0，pH 7.0。98 kPa灭菌30 min。

(2) 胞外多糖发酵培养基(g/L)：葡萄糖30.0，蛋白胨5.0，酵母提取液1.0，pH 7.0。68 kPa灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集和分离纯化: 采集的水样分别稀释成10^-4、10^-5和10^-6 3个梯度直接涂布在基础培养平板上，18 ℃培养2-3 d长出单菌落，挑取单菌落划线进行分离纯化，直到得到纯培养菌株。用4 ℃固体斜面和-80 ℃甘油管两种方式保存菌种。

1.2.2 菌株的外观特征及部分生理生化指标检测: 平板划线方法接种细菌于固体基础培养基上，18 ℃培养2-3 d，观察单菌落的形态、颜色、大小、透明度、边缘及表面特征等。通过形态观察及镜检确定菌株种类，然后依据《常见细菌系统鉴定手册》^[23]和《伯杰氏细菌鉴定手册》^[24]进行生理生化指标检测。

1.2.3 细菌总DNA提取、16S rRNA基因扩增和系统进化分析: 使用Biospin基因组提取试剂盒提取细菌总DNA，以细菌总DNA为模板，采用16S rRNA基因通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′)进行PCR扩增。20 μL反应体系：10×Taq buffer 2.0 μL，dNTPs (10 mmol/L) 0.4 μL，MgCl₂ (25 mmol/L) 1.2 μL，ddH₂O 15.4 μL，50 μmol/L 27F和1492R各0.25 μL，Taq DNA polymerase (5 U/μL) 0.2 μL，模板DNA 0.3 μL。反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，再按照PCR产物纯化试剂盒回收目的DNA，通过连接、转化过程，经菌落PCR验证的转化子送交至华大基因公司测序。测序得到的16S rRNA基因序列通过BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行序列比对。

1.3 产胞外蛋白酶、纤维素酶和胞外多糖菌株的筛选

1.3.1 产胞外蛋白酶菌株的筛选: 在蛋白酶筛选培养基中采用系列划线方法获得单克隆菌落，18 ℃培养2-3d后观察有无透明圈出现。

1.3.2 产纤维素酶菌株的筛选: 在纤维素酶筛选培养基上采用系列划线方法获得单克隆菌落，18 ℃培养2-3d后在平板中加入1g/L的刚果红染色液反应30min，再加入1mol/LNaCl溶液脱色10min后，观察有无透明圈出现。

1.3.3 产胞外多糖菌株的筛选: 在胞外多糖筛选培养基上采用系列划线方法获得单克隆菌落，18 ℃培养2-3d后进行拉丝实验。

1.4 细菌产蛋白酶、纤维素酶和胞外多糖的发酵培养方法

1.4.1 细菌产蛋白酶和纤维素酶的发酵培养方法: 取OD₆₀₀值是0.8的对数生长期的新鲜菌液1mL加入到50mL蛋白酶和纤维素酶发酵培养基中，18 ℃、180r/min培养5d。收集发酵液在4℃、11000r/min离心30min后得到的上清液即为粗酶液。

1.4.2 细菌产胞外多糖的发酵培养方法: 取对数生长期的新鲜菌液1mL加入到50mL胞外多糖发酵培养基中，18 ℃、180r/min培养5d。收集发酵液在4℃、11000r/min离心30min后得到的上清液即为粗糖液。

1.5 酶活性测定方法

1.5.1 蛋白酶活性测定方法: 采用Folin-酚法测定细菌发酵液中的蛋白酶活性，结合胞外酶谱法确定蛋白酶的组成和活性^[25]。

1.5.2 纤维素酶活性测定方法: 采用羧甲基纤维素钠盐酶活性法测定细菌发酵液中的纤维素酶含量，结合胞外酶谱法确定纤维素酶的组成和活性^[26]。

1.5.3 胞外多糖活性测定方法: 通过无水乙醇沉淀法分离发酵液中的细菌胞外多糖，离心后重溶，再采用硫酸-苯酚法测定其中的胞外多糖含量^[27]。

2 结果与分析 2.1 菌株的分离鉴定及部分生理生化性质的鉴定

对4个不同地区的高山湖泊水样进行涂布，从3个不同剂量涂布的平板中挑选出涂布均匀且单菌落较多的平板，从中挑取单菌落接种于基础培养基，置于18 ℃培养2-3 d，通过形态观察确定菌株种类，共获得细菌41株。其中雷波(LB) 15株，中缅边境(ZM) 13株，沙德(SD) 7株，腾冲(TC) 6株。分离得到的单菌落经16S rRNA基因序列测序分析显示，雷波马湖中分离的15株菌中包括芽孢杆菌9株，假单胞菌3株，气单胞菌2株，微杆菌1株；中缅边境凯邦亚湖中分离得到芽孢杆菌2株，假单胞菌和气单胞菌各4株，类芽孢杆菌3株；沙德莲花湖中得到假单胞菌2株，鞘氨醇杆菌、不动杆菌、贪噬菌、黄杆菌和成团泛菌各1株；腾冲青海湖中分离得到的全部是芽孢杆菌共6株(图 2)。最后将分离得到的菌株进行生理生化指标检测(表 1)。

从4个湖泊中分离的菌株隶属于10个不同的种属类群，其中芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株最多，其次是假单胞菌属(Pseudomonas)和气单胞菌属(Aeromonas)。通过观察4个地区的可培养细菌丰度组成，发现不同地区存在明显差异，其中雷波马湖和中缅边境凯邦亚湖分离得到的细菌均较常见，而且芽孢杆菌是优势菌株，类似的细菌种类组成也出现在其他地区的淡水湖泊中^[28-29]。腾冲青海湖的细菌群落组成比较单一，均为芽孢杆菌，这可能是由于腾冲受地热影响，水温较高，而芽孢杆菌本身具有较好的耐热能力，因此只有该菌得以存活，成为优势菌群；而莲花湖筛选得到的细菌多样性最高，相比其他淡水湖泊中的细菌类群大多数属于芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和气单胞菌属(Aeromonas)等^[30-31]，莲花湖筛选得到的细菌主要由假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、贪噬菌属(Variovorax)、黄杆菌属(Flavobacterium)和成团泛菌属(Pantoea)组成。考虑到雷波马湖作为我国已知的第三大高山深水湖泊以及中缅边境凯邦亚湖特殊的地理位置，还有腾冲青海湖美丽的自然风光等，近年来这3个高山湖泊均成为了著名的旅游景区，受人为活动干扰较大。然而海拔高度位于4 000 m以上的沙德莲花湖位置比较偏僻，人迹罕至，受当地人类活动影响较小，这可能是造成菌株组成差异较大的主要原因。

2.2 细菌产胞外分泌物的多样性分析

对分离纯化到的41株细菌进行了发酵培养，对发酵液中的蛋白酶、纤维素酶活性及胞外多糖的产生情况进行了比较分析(表 1)。对筛选的41株细菌进行胞外酶活性检测，结果显示有28株细菌具有蛋白酶活性，其中Exiguobacterium sp. LB2、Bacillus sp. LB12、Aeromonas sp. ZM2、Aeromonas sp. ZM3、Aeromonas sp. ZM7、Paenibacillus sp. ZM8、Pseudomonas sp. ZM9、Flavobacterium sp. SD5、Bacillus sp. TC3这9株细菌产蛋白酶的能力较强；Pseudomonas sp. LB6、Bacillus sp. LB12、Paenibacillus sp. ZM6、Aeromonas sp. ZM10、Bacillus sp. TC3、Bacillus sp. TC6这6株细菌具有纤维素酶活性，其中Bacillus sp. LB12的发酵产物的纤维素降解能力最强(图 3)。此外通过拉丝实验初步检测分离得到的细菌产胞外多糖的能力(图 4A)，结果显示有17株细菌具有产胞外多糖能力，其中Aeromonas sp. LB7、Bacillus sp. LB12、Aeromonas sp. ZM3、Bacillus sp. TC1和Bacillus sp. TC6这5株细菌产胞外多糖能力较强(图 3)。根据硫酸-苯酚法检测细菌发酵液中胞外多糖总量发现，Bacillus sp. TC1产胞外多糖含量最高，多糖产量为0.61 g/L；其次是Bacillus sp. TC6、Aeromonas sp. ZM3、Bacillus sp. LB12和Aeromonas sp. LB7，胞外多糖含量分别为0.54、0.50、0.32和0.25 g/L (图 4B)。从表 1还可以看出，其中Bacillus sp. LB12和Bacillus sp. TC3能产生3种胞外分泌物，而Bacillus sp. LB3、Pseudomonas sp. LB11、Bacillus sp. LB14、Aeromonas sp. ZM2、Aeromonas sp. ZM3、Aeromonas sp. ZM7、Pseudomonas sp. ZM9、Bacillus sp. TC1、Bacillus sp. TC2和Bacillus sp. TC4既产胞外蛋白酶，又产胞外多糖；Pseudomonas sp. LB6和Aeromonas sp. ZM10既产胞外蛋白酶，又产纤维素酶；Bacillus sp. TC6既产纤维素酶，又产胞外多糖。通过比较4个不同地区高山湖泊的可培养细菌产胞外活性物质的分泌情况，结果发现，从雷波马湖分离得到的产蛋白酶的细菌菌株最多，其中多为芽孢杆菌属(Bacillus)，占分离菌株的46.7%；腾冲青海湖和雷波马湖分离得到的细菌分泌胞外多糖最多，特别是腾冲青海湖分离得到的所有菌株(芽孢杆菌)都可以分泌胞外多糖，占分离菌株的100%，雷波马湖分泌胞外多糖的芽孢杆菌属(Bacillus)占分离菌株的26.7%；而4个湖泊中分泌纤维素酶的细菌均较少(表 1)。由此可以推测，这4个湖泊中蛋白酶资源相对比较丰富，而可培养细菌大都不是通过降解纤维素来获取碳源。细菌胞外多糖的分泌有利于细菌捕获环境中的有机物质，供给自身生长需要。腾冲青海湖中分离得到的芽孢杆菌都可以分泌胞外多糖，可能是它们对地热生存环境的一种适应。

2.3 细菌产蛋白酶和纤维素酶的活性电泳图谱分析和酶活测定

对产蛋白酶明显的细菌进行摇瓶发酵实验，取第5天的粗酶液进行底物反浸聚丙烯酰胺凝胶活性电泳图谱分析，确定蛋白酶的种类和酶活力。如图 5所示，酶谱结果表明不同属的细菌产蛋白酶的能力和类型均明显不同。Exiguobacterium sp. LB2、Bacillus sp. LB12、Aeromonas sp. ZM3、Aeromonas sp. ZM7和Pseudomonas sp. ZM9的酶谱条带均较明亮，说明这几株菌的胞外蛋白酶活性较强；而Aeromonas sp. ZM2、Paenibacillus sp. ZM8、Flavobacterium sp. SD5和Bacillus sp. TC3的蛋白酶活性相对较低。Exiguobacterium sp. LB2、Bacillus sp. LB12、Pseudomonas sp. ZM9、Flavobacterium sp. SD5和Bacillus sp. TC3胞外活性酶谱有3条非常明显的降解条带，Aeromonas sp. ZM2和Aeromonas sp. ZM3胞外活性酶谱有2条明显的降解条带；Aeromonas sp. ZM7和Paenibacillus sp. ZM8胞外蛋白酶条带较为单一。此外，由图 5可知，同属的细菌产蛋白酶的种类也存在明显差异，例如Aeromonas sp. ZM3产2种不同类型的蛋白酶，而Aeromonas sp. ZM7只产1种类型的蛋白酶，而且Aeromonas sp. ZM7蛋白酶谱上的降解条带比Aeromonas sp. ZM3更明显，不同细菌所产胞外蛋白酶明显具有多样性。

取发酵到第5天的粗酶液，采用Folin-酚法进一步比较不同细菌发酵液的蛋白酶活性。如图 6所示，Exiguobacterium sp. LB2的胞外蛋白酶相对活性最高，而Aeromonas sp. ZM3、Aeromonas sp. ZM7、Pseudomonas sp. ZM9、Aeromonas sp. ZM2、Paenibacillus sp. ZM8、Flavobacterium sp. SD5和Bacillus sp. TC3的蛋白酶相对活性较低。蛋白酶酶活测定结果和活性电泳图谱结果基本吻合。

对产纤维素酶的6株细菌进行发酵，取第5天粗酶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱分析。如图 7所示，Bacillus sp. LB12的纤维素酶谱条带最亮，且只产1种类型的纤维素酶，产酶类型比较单一；同样只产1种类型纤维素酶菌株还有Paenibacillus sp. ZM6和Aeromonas sp. ZM10；而Pseudomonas sp. LB6、Bacillus sp. TC3和Bacillus sp. TC6的活性电泳图上均有2条明显的纤维素降解条带。通过羧甲基纤维素钠盐酶活性方法测定了发酵液中的纤维素酶活性(图 8)，与聚丙烯酰胺凝胶电泳图结果基本一致。

3 讨论

Peeters等在对南极洲Forlidas Pond和Lundström Lake中的可培养细菌多样性进行研究时，也是对每个湖泊的一个采样点取样进行可培养细菌的筛选，然后对两个不同地区细菌组成进行比较，通过16S rRNA基因序列结果分析比对，表明82个代表菌株属于四大细菌群落^[29]。在本实验中，我们采用了类似的取样方式，对不同湖泊中的可培养细菌进行分离、筛选，通过16S rRNA基因序列分析得到的细菌主要是芽孢杆菌属、假单胞菌属、气单胞菌属等，相关数据一定程度上反映了湖泊中微生物区系的变化。

本课题组从4个不同的湖泊中分离筛选出细菌41株，根据细菌的生理生化性质及16S rRNA基因序列进行分析，发现雷波马湖、中缅边境凯邦亚湖和腾冲青海湖的优势菌属均是芽孢杆菌，表明芽孢杆菌在高山淡水湖泊中有着举足轻重的作用。除了芽孢杆菌外，假单胞菌和气单胞菌在雷波马湖和中缅边境凯邦亚湖中也占有很大的比例。刘文等^[32]在研究青藏高原北部湖泊中可培养细菌对不同碳源利用情况的过程中也发现了大量假单胞菌和气单胞菌，它们可以利用多种碳源，是高山淡水湖泊碳循环过程的重要参与者。然而韩永和等^[33]的研究显示，假单胞菌广泛分布于淡水系统中，参与了淡水湖泊的有机氮循环过程。因此雷波马湖和中缅边境凯邦亚湖湖泊中大量存在假单胞菌和气单胞菌两种细菌，同样预示着它们在该湖泊的碳循环和氮循环过程中具有重要的作用。沙德莲花湖中分离得到的可培养细菌种类最多，且细菌种类均较罕见，这可能与该湖泊远离人类有关，这也为下一步剖析原生态的高山湖泊微生物生态学意义提供了合适的研究对象。刘晓波等通过研究青藏高原纳木错湖等高山湖泊的细菌群落特征发现，青藏高山湖泊中的优势菌属主要是嗜氢菌属(Hydrogenophaga)、诺卡氏菌属(Nocardioides)、原绿球菌属(Prochlorococcus)、红曲霉属(Hongiella)和黄杆菌属(Flavobacterium)^[7]，这与本文西南高原湖泊的研究结果有较大的差异。细菌种类与湖泊的多项物理化学参数有关，是多种参数如湖泊的海拔高度、地形地貌、汇水方式、面积大小、营养状况共同作用的结果^[7]。本实验选取的4个高山湖泊与青藏高原纳木错湖都是地处偏远地区、低温和寡营养的高山湖泊，但由于所处位置不同，湖泊的营养状况差距不小，且湖泊受人为干预和气候影响等也均有明显的区别，因此西南地区选取的4个湖泊的细菌丰度和组成与青藏高原的高山湖泊有着明显的不同。这也为下一步深入分析和探讨西南地区其他高山湖泊的微生物多样性提供了可靠的参考价值。

本实验采用平板水解圈法和拉丝实验针对几种实用的胞外活性物质进行测定，筛选结果显示分离的41株细菌中分别有68.3%和43.9%的可培养菌株产蛋白酶和胞外多糖，只有14.6%的可培养菌株产纤维素酶。通过分析西南地区4个不同湖泊的可培养细菌产胞外活性物质情况，发现雷波马湖中产蛋白酶、纤维素酶和胞外多糖这3种胞外活性物质的菌株最多，且绝大部分是芽孢杆菌。此外，腾冲青海湖中产蛋白酶、纤维素酶和胞外多糖最多的菌株也是芽孢杆菌。据此可以推断，芽孢杆菌在参与雷波马湖和腾冲青海湖中氮循环和碳循环过程中发挥着重要的作用。同时，我们发现不同的菌株产胞外活性物质的能力也存在明显的不同，其中芽孢杆菌属(Bacillus)，如菌株Bacillus sp. LB12可以同时具有产3种实用功能的胞外活性物质的能力，而大部分细菌只具有产1种胞外活性物质的能力，这也再一次印证了芽孢杆菌属(Bacillus)在西南高山湖泊的重要性。

本研究以西南地区4个不同高山湖泊中可培养细菌和它们所产的胞外活性物质为对象，通过比较湖泊中的细菌丰度组成，分析各个地区细菌多样性存在差异的可能原因，有助于后期全面、系统地对西南湖泊中的细菌多样性开展生态学研究，对于将来更好地管理和维护高山湖泊生态环境具有深远意义。同时，通过研究细菌所产的几种实用的胞外活性物质的多样性，为深入阐述细菌及其胞外活性物质在高山湖泊中所起的重要角色以及对环境的定点监测和保护打下了坚实的基础。