微生物学通报  2017, Vol. 44 Issue (8): 1882−1890

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李艳梅, 王琼瑶, 涂卫国, 崔永亮, 钟玘狄, 李俐珩, 陈强, 余秀梅
LI Yan-mei, WANG Qiong-yao, TU Wei-guo, CUI Yong-liang, ZHONG Qi-di, LI Li-heng, CHEN Qiang, YU Xiu-mei
镍胁迫下产铁载体细菌对花生的促生性
Growth promoting activity of siderophore secreting bacteria for peanut plant under nickel stress
微生物学通报, 2017, 44(8): 1882-1890
Microbiology China, 2017, 44(8): 1882-1890
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160792

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收稿日期: 2016-11-01
接受日期: 2016-12-28
优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-02-08
镍胁迫下产铁载体细菌对花生的促生性
李艳梅1, 王琼瑶2, 涂卫国2, 崔永亮2, 钟玘狄1, 李俐珩1, 陈强1, 余秀梅1     
1. 四川农业大学资源学院微生物系    四川 成都    611130;
2. 四川省自然资源科学研究院    四川 成都    610041
摘要【目的】 挖掘镍耐受性强、产铁载体活性高的植物根际促生细菌,研究镍胁迫下产铁载体细菌对花生的促生作用及其对花生吸收镍的影响。【方法】 利用CAS (Chrome azurol S)培养基对花生根际产铁载体细菌定性筛选及定量测试获得产铁载体能力强的菌株,16S rRNA基因相似性及系统进化分析鉴定产铁载体细菌,并用含Ni2+牛肉膏蛋白胨培养基测试细菌对Ni的耐受性;通过花生盆栽实验,测试花生的株高、根长、生物量、氮磷钾含量及镍含量来分析镍胁迫下产铁载体细菌对花生的影响。【结果】 从花生根际分离筛选产铁载体芽孢杆菌5株,其中HSGJ1产铁载体能力最强,培养2 d后产156.56 mg/L的铁载体。HSGJ1对Ni2+具有较强的耐受性,最小致死浓度为150 mg/L。在50、100 mg/kg的Ni2+盆栽基质中,HSGJ1能够有效地促进花生的生长、增加花生的生物量及氮磷钾含量,并使花生根部和地上部分的镍含量降低。【结论】 产铁载体芽孢杆菌HSGJ1是一株优良的植物根际促生细菌,可应用于镍污染农耕土壤的作物种植中,以提高作物在镍胁迫下的抗逆性,降低作物对镍的富集量,具有较好的应用价值。
关键词促生细菌     铁载体          花生    
Growth promoting activity of siderophore secreting bacteria for peanut plant under nickel stress
LI Yan-mei1, WANG Qiong-yao2, TU Wei-guo2, CUI Yong-liang2, ZHONG Qi-di1, LI Li-heng1, CHEN Qiang1, YU Xiu-mei1     
1. Department of Microbiology, College of Resource Sciences, Sichuan Agricultural University, Chengdu, Sichuan 611130, China;
2. Natural Resources Science Research Institute of Sichuan Province, Chengdu, Sichuan 610041, China
Received: November 01, 2016; Accepted: December 28, 2016; Published onlineFebruary 08, 2016
Foundation item: Key Research Project in Sichuan Province (No. 2017SZ0087); Science and Technology Innovation Talent Project in Sichuan Province (No. 2017RZ0064)
*Corresponding author: YU Xiu-mei, Tel:86-28-86290982; E-mail:yuxiumeicool@163.com.
Abstract: [Objective] We explored plant growth promoting rhizobacteria with strong activity of resisting nickel and secreting siderophore, and studied their effect on promoting peanut plant growth and absorbing nickel. [Methods] Strains with strong siderophore secreting capacity were isolated from peanut rhizosphere by using qualitative and quantitative test of CAS (chrome azurol S) medium. Siderophore secreting strains were identified by similarity and phylogenetic analysis of 16S rRNA gene. Tolerance of siderophore secreting strains to nickel was measured by beef extract-peptone medium supplemented with nickel ion. In the pot experiment of peanut, effects of siderophore secreting strains on peanut plant was analyzed by measuring shoot height, root length, biomass and the content of nitrogen, phosphorus, potassium and nickel in peanut plant. [Results] Five Bacillus strains with siderophore secreting capacity were isolated from peanut rhizosphere. Bacillus sp. HSGJ1 showed the strongest siderophore secreting capacity among the five strains. It secreted 156.56 mg/L of siderophore after 2 days. Bacillus sp. HSGJ1 showed strong tolerance to nickel with 150 mg/L of minimum lethal concentration. HSGJ1 could promote plant growth, increase the biomass and nitrogen, phosphorus and potassium contents of peanut, and decrease the nickel content in the root and shoot of peanut plant in 50 and 100 mg/kg of Ni2+ in pot soil. [Conclusion] As a good plant growth promoting rhizobacterium, the siderophore secreting Bacillus sp. HSGJ1 can be applied for planting crop in the nickel contaminated soil to improve crop tolerance under nickel stress and decrease nickel accumulating in crop. Therefore, Bacillus sp. HSGJ1 shows good application value.
Key words: Growth promoting bacteria     Siderophore     Nickel     Peanut    

随着城市化和工业化的快速发展,土壤重金属污染问题突出,严重影响人类的生存环境。据调查,我国近2×1011 m2的耕地受到重金属的污染,约占总耕种面积20%[1]。重金属污染导致土壤作物产量和品质的下降,还会引发地下水污染,甚至通过“土壤-植物-人体”或“土壤-水-人体”[2]食物链富集到人体,严重威胁人类的生命健康。土壤重金属污染具有隐蔽性、长期性、不可降解、不可逆转等特点,因此重金属污染与治理已成为国内外研究的热点和难点。

重金属污染土壤的修复有物理化学修复、生物修复和农业生态修复。其中,生物修复具有成本低、效果好、无二次污染、操作简单等优点,主要包括植物修复和微生物修复。微生物修复以微生物吸附、氧化还原、矿化重金属离子等方式来修复土壤中的重金属[3-4]。植物根际促生菌可通过产铁载体、分泌吲哚乙酸(IAA)、固氮、溶磷、解钾等方式促进植物生长、改善重金属耐受性,以提高植物修复重金属污染土壤的效率[5-6]。微生物产生的铁载体[7]对铁元素具有较高亲和力,其不仅可以螯合Fe3+,还可以螯合Al3+、Mn2+、Cd2+、Cu2+、Pb2+及Zn2+等金属离子[8]。重金属离子以主动运输或被动运输方式进入细胞产生毒害[9],而铁载体螯合重金属离子后形成的大分子物质无法进入细胞内,从而提高修复植物或土壤微生物对重金属的耐受性[10]。同时,在螯合反应中铁载体还能通过降低重金属的毒害作用来促进微生物产IAA[11]。植物根际微生物分泌高亲和性的铁载体可增加根际铁的供给量,竞争性抑制重金属的根系吸收,并抑制重金属元素向植物地上部分转运,以促进植物的生长,增加作物的生物量[12]

花生是一种铁敏感的植物,缺铁的花生叶片会黄化,严重时植株会矮化,甚至不结果导致产量低[13]。Jadhav等研究报道,产生铁载体的豇豆根瘤菌可有效地将土壤中不溶性铁转化为生物有效铁来补充花生植株的铁营养,进而促进花生的生长,提高叶绿素含量,其与直接添加去铁敏B的效果相似[14]。据调查,镍在农耕土壤中平均含量为26.12 mg/kg,而镍对植物危害的极限值为20 mg/kg[15],农耕土壤中过多的镍会影响植物生长,同时还可通过食物链的富集作用转移到人体,严重者可致癌[16]。花生是我国重要的经济粮油作物,年种植面积数百万公顷,部分花生耕作地也受到不同程度的镍污染。然而,镍污染土壤上的花生植株施用产铁载体细菌,是否可以促进花生植株的生长并影响花生对镍的吸收还是一个尚未解答的问题。因此,本研究从花生根际土中分离筛选出产铁载体能力强的细菌,并通过花生盆栽实验分析镍胁迫下产铁载体菌株对花生促生性及固定土壤中镍的作用,为镍污染农耕土壤作物种植提供可利用的微生物固定技术和理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 花生植株的采集: 2015年6月,从攀枝花钒钛磁铁尾矿库边缘采集长势较好的花生植株。以花生植株为中心,以半径5 cm的范围,用铁铲将花生植株挖出,将其根部及包裹的土壤装入聚乙烯塑料袋中带回实验室。在超净工作台上,抖动根系(<2 mm)的土壤于无菌自封袋中,获得花生根际土样[17]

1.1.2 主要试剂和仪器: (1) 用于DNA提取的试剂:异硫氰酸胍(GUTC),购自南京化学试剂股份有限公司;(2) 植物样品消煮试剂:浓硫酸、30%过氧化氢,购自四川西陇化工有限公司;(3) 植物重金属测定试剂:浓硝酸、高氯酸(HNO3:HClO4=4:1,体积比)混酸,购自国药集团化学试剂有限公司;国家标准重金属液体Ni购于国家有色金属及电子材料分析测试中心;(4) 16S rRNA基因扩增引物由深圳华大基因公司合成。

HYQ系列双层恒温摇床,武汉汇诚生物技术有限公司;V-1100D分光光度计,上海美谱达仪器有限公司;Centrifuge5148R离心机,艾本德中国有限公司;FP6410火焰光度计,上海精科仪器有限公司;PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪,Bio-Rad公司;ICP-AES,美国热电公司。

1.1.3 培养基: (1) 菌株的分离、纯化及保种培养基:牛肉膏蛋白胨培养基[18];(2) 产铁载体筛选培养基:CAS定性培养基[19]和费氏定量基本培养基[20];(3) 耐镍筛选培养基:将不同浓度的Ni2+添加到牛肉膏蛋白胨培养基中;(4) LB液体培养基(g/L):蛋白胨10.0,酵母浸粉5.0,NaCl 10.0。所有培养基在用前1×105 Pa灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 产铁载体细菌的分离与筛选: 利用牛肉膏蛋白胨培养基的稀释平板涂布法[18]分离花生根际细菌,通过多次划线镜检获得根际细菌纯培养,并保存于牛肉膏斜面(-20) 和30%甘油(-80中。利用CAS检测法来定性和定量地筛选产铁载体细菌:在CAS平板上点接10 μL菌悬液后28培养4-5 d,将菌斑周围产生黄色晕圈的菌株定性筛选为产铁载体阳性细菌[21];将产铁载体阳性细菌新鲜菌液(1%)接种于费氏基本培养基中,28 150 r/min培养2 d,取上清液,用CAS检测液处理1 h后测OD400,计算铁载体浓度(mg/L)。

1.2.2 产铁载体细菌的分子鉴定与系统进化分析: 用异硫氰酸胍(GUTC)法[22]提取细菌的总DNA,并将总DNA保存在-20备用。16S rRNA基因的PCR扩增引物为27F (5′-AGAGTTTGATTGGCTCA G-3′)和1492R (5′-TACGGTACCTTGTTACGAC T-3′)[23];PCR扩增体系(30 μL):2×PCR mix 15 µL,27F和1492R (10 µmol/L)引物各0.15 µL,DNA模板1 µL,超纯水补至30 µL。PCR扩增程序[24]中退火温度为54。PCR扩增产物测序(深圳华大基因公司)后,将16S rRNA基因序列在GenBank数据库里进行BLASTn分析[25]获得序列相似性及同源基因;用MEGA 6.0软件的邻接法(Neighbor-Joining)对产铁载体细菌的16S rRNA基因序列构建系统发育树[26]

1.2.3 产铁载体细菌对镍的耐受性测试: 产铁载体细菌对Ni2+的耐受性主要通过测定镍的最小致死浓度(MLC)[27]来评价,即:接种10μL新鲜菌液(108 CFU/mL)到Ni2+浓度为10-200 mg/L的牛肉膏液体培养基中,并以接菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基作为对照,28 150 r/min培养2 d后测定OD660,以培养液OD660为零Ni2+浓度作为镍对细菌的最小致死浓度(MLC)。

1.2.4 花生盆栽实验: 根据产铁载体细菌对Ni2+的耐受性设置盆栽蛭石基质中Ni2+的浓度为0、50、100、150 mg/kg的梯度,测试产铁载体细菌在不同浓度镍胁迫下的促生特性。先对种子进行表面灭菌[28],用纱布包裹花生种子浸泡在95%的酒精30 s,浸泡灭菌0.1%的HgCl2溶液5 min,无菌水清洗5-6次;将种子播种在已进行灭菌(1×105 Pa灭菌30 min)处理的改进的Leonard Jar装置[29],基质蛭石用含Fe3+的营养液润湿,下方塑料瓶装入含氮营养液。在植株长出土表 2 cm-3 cm,接种优势产铁载体菌悬液(108个细胞) 1 mL于植物根围,同时在表面铺上已灭菌并干燥石英砂防止杂菌进入装置。每个处理3个重复,并以不接菌的处理作为对照,在光照室(25光照17 h和17黑暗7 h)种植60 d后收获。

表 2 花生植株的生长与生理特征 Table 2 Growth and physiological feature of peanut plants
Ni浓度
Ni concentration (mg/kg)
处理
Treatment
株高
Stem length (cm)
根长
Root length (cm)
生物量
Dry weight (g)
N含量
N concent (g/kg)
P含量
P content (g/kg)
K含量
K content (g/kg)
0 HTR3 34.45±1.06a 28.99±0.65a 3.64±0.74a 22.88±0.45a 2.41±0.07a 38.81±0.59a
TR3 29.06±1.99a 24.70±0.80b 2.58±0.19a 20.37±0.21b 1.94±0.17b 30.55±0.31b
50 HTR3 31.02±2.49a 25.47±1.96a 2.27±0.50a 20.90±0.02a 2.01±0.15a 32.00±0.57a
TR3 28.96±2.39a 22.37±2.81a 2.08±0.15a 18.47±0.32b 1.80±0.15a 25.85±0.54b
100 HTR3 30.62±1.96a 19.61±1.76a 1.99±0.12a 19.92±0.25a 1.98±0.14a 30.70±0.70a
TR3 25.72±1.82a 17.72±1.00a 1.72±0.31a 17.53±0.27b 1.32±0.20b 23.23±0.52b
150 HTR3 24.87±1.60a 13.37±1.11a 1.10±0.02a 17.05±0.08a 1.23±0.15a 19.40±0.25a
TR3 24.83±0.99a 13.95±0.32a 1.13±0.10a 17.22±0.11a 1.25±0.17a 19.77±0.59a
注:HTR3:接种HSGJ1;TR3:不接菌的对照;加粗字母:Ni浓度为0 mg/kg的显著性差异;斜体字母:Ni浓度为50 mg/kg的显著性差异;斜体加粗字母:Ni浓度为100 mg/kg的显著性差异;正常字母:Ni浓度为150 mg/kg的显著性差异;表中字母均是P<0.05水平的显著性差异.
Note: HTR3: HSGJ1 inoculation; TR3: the control without inoculation; Bold letters: The significant difference at Ni concent of 0 mg/kg; Italic letters: The significant difference at Ni concent of 50 mg/kg; Italic and bold letters: The significant difference at Ni concent of 100 mg/kg; Normal letters: the significant difference at Ni concent of 150 mg/kg; Letters in table means significant difference at P<0.05.

1.2.5 评估指标与测试方法: 盆栽花生的评估指标主要包括株高、根长、干重、植株氮磷钾及镍含量。盆栽60 d后,收获花生植株,测定株高和根长;收获的新鲜植株置于105烘箱中杀青30 min,80烘干至恒重;用硫酸-过氧化氢消煮法[30]消煮粉碎的植物样品后测定植株氮、磷、钾含量:全氮用溴酚蓝比色法测定,全磷用钼锑抗比色法测定,全钾用原子吸收火焰光度法测定[31];花生植株镍含量用ICP-AES[32]测定。

1.2.6 实验数据分析方法: 实验数据用Microsoft office 2010进行均值和标准差的分析,用SPSS 17.0进行显著性差异(P<0.05) 分析,用Sigmaplot 10.0作图。

2 结果与分析 2.1 产铁载体细菌的分离纯化筛选

通过稀释涂布法纯化获得菌落形态、大小、颜色不同的花生根际细菌21株,其中包括19株革兰氏阳性细菌和2株革兰氏阴性菌。在细菌产铁载体定性测试中,5株细菌在CAS平板上产生了大小不同的黄色晕圈,说明其能产铁载体。细菌产铁载体定量测试说明这5株细菌培养2 d后产生的铁载体为10.33-156.56 mg/L (表 1),说明其产铁载体的能力不同,其中HSGJ1产铁载体能力最强。

表 1 细菌产铁载体能力及16S rRNA基因相似性分析 Table 1 The siderophore secreting capacity and similarity analysis of 16S rRNA genes for strains
菌株编号
Strain No.
晕圈直径
Halo diameter (cm)
浓度
Concentration (mg/L)
长度
Length (bp)
序列编号
Sequence No.
序列号
Accession No.
同源性
Similarity (%)
属名
Genus name
HSGJ1 2.98 156.56 1 421 KJ739954 CP005881 100 Bacillus
HSGJ5 0.57 10.33 1 453 KJ733951 FJ253021 99 Bacillus
HSGJ8 0.74 19.17 1 429 KJ733958 JF411247 100 Bacillus
HSGJ13 0.85 20.08 1 430 KJ733970 JF411297 100 Bacillus
HSGJ19 2.53 105.33 1 419 KJ733955 CP005881 100 Bacillus
2.2 产铁载体细菌对镍的耐受性测试

在耐镍细菌的平板筛选实验中,这5株产铁载体细菌对Ni2+表现出了不同的耐受性,其中HSGJ1存活于100 mg/kg的Ni2+牛肉膏蛋白胨平板上,但菌斑略小于无Ni培养基上的对照菌斑,而其他4株产铁载体细菌死亡,说明其不能耐受高于100 mg/kg的Ni2+。产铁载体细菌HSGJ1在10-200 mg/L的Ni2+牛肉膏液体培养基中培养2 d后细胞浓度各不相同。当Ni2+浓度达到150 mg/L时,培养液中无菌细胞,说明产铁载体细菌HSGJ1的最小致死浓度为150 mg/L。

2.3 产铁载体菌株的系统发育分析

产铁载体菌株的16S rRNA基因测序后获得约1 400 bp的序列,其在GenBank数据库中的BLASTn分析发现,这5株产铁载体的16S rRNA基因与芽孢杆菌属(Bacillus)的16S rRNA基因的相似度达99%-100% (表 1)。因此,将这5株产铁载体细菌初步鉴定为芽孢杆菌,并将这5株芽孢杆菌的16S rRNA基因序列提交到GenBank数据库获得相应的序列编号(表 1)。用软件MEGA 6.0的邻接法(Neighbour-Joining)对5株产铁载体的菌株和30株芽孢杆菌属(Bacillus)的标准菌株16S rRNA基因构建系统发育树(图 1),这5株产铁载体菌株在系统发育树上与芽孢杆菌特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)聚在同一分支上,说明他们的遗传距离近、同源性高,但不能准确地将其鉴定为种水平。因此,将这5株产

图 1 产铁载体菌株16S rRNA基因序列的系统发育树 Figure 1 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequence for the siderophore secreting strains 注:括号里的数字为GenBank登录号;分支点上的数字为Bootstrap值,代表分类单位被聚在一起的几率;比例尺显示水平线的长度,代表碱基替换数;T代表标准菌株. Note: Numbers in parentheses represent the sequence accession number. The numbers at the nodes indicate the level of bootstrap support (%) based on 1 000 resample data set, only values above 50% are given. The scale bar corresponds to 0.05 substitutions per nucleotide position. T: type strains.

铁载体细菌鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)。这5株产铁载体菌株在系统发育进化树上又分处于不同亚支,说明这5株产铁载体细菌各不相同。

2.4 花生的生长与营养状况

对不同Ni2+浓度梯度胁迫下花生的生理指标测试表明:产铁载体芽孢杆菌HSGJ1能促进花生的生长并提高植株氮磷钾含量(表 2)。在没有Ni胁迫下,接种HSGJ1的花生株高、根长、生物量及氮磷钾含量显著高于(P<0.05) 不接菌的对照花生植株,且其长势和营养状况明显优于Ni胁迫下的植株。在盆栽基质中加入50 mg/kg和100 mg/kg的Ni2+后,花生的生长明显被抑制,但是HSGJ1对花生仍然表现出了促生作用。在基质Ni2+浓度为50 mg/kg时,花生的株高、根长和生物量分别比不接菌植株增加了7.1%、13.9%和9.1%,花生氮磷钾的含量分别增加了13.2%、11.7%和23.8%。在基质中Ni2+浓度为100 mg/kg时,花生的株高、根长和生物量分别比不接菌植株增加了19.0%、10.6%和15.7%,花生氮磷钾的含量分别增加了13.0%、50.0%和32.2%。与无Ni胁迫及低浓度Ni2+胁迫下的花生相比,在含150 mg/kg Ni2+的盆栽基质中的花生株高、根长、生物量及氮磷钾含量明显较低,且接种HSGJ1与不接菌的对照植株不存在显著性差异(P<0.05)。

2.5 花生植株镍含量测试

在花生盆栽实验中,基质中不加Ni2+的花生植株中没有检测到镍元素。与未接菌的对照植株相比,接种产铁载体细菌HSGJ1可以显著降低花生地上部分和根部的Ni含量(P<0.05) (图 2)。在盆栽基质Ni2+浓度为50、100 mg/kg时,接种HSGJ1花生地下部分的Ni含量较对照植物分别降低了68.9%和63.9%,而地上部分也分别降低了48.3%和22.1%。在基质Ni2+含量为150 mg/kg时,花生地上部分和根部Ni含量较其他两个Ni浓度处理花生植株含量高,且接种产铁载体芽孢杆菌HSGJ1与不接菌的对照花生植株中的Ni含量不存在显著差异(P<0.05)。

图 2 花生植株地上部分(A)和根部(B)的Ni含量 Figure 2 The nickel content in the shoots (A) and roots (B) of peanut plant 注:HTR3:接种HSGJ1;TR3:不接菌的对照;图中字母均是P<0.05水平的显著性差异. Note: HTR3: HSGJ1 inoculation; TR3: The control without inoculation; Letters in figure mean significant difference at P < 0.05.
3 结论与讨论

产铁载体菌是促生性好的根际微生物,已被广泛应用到重金属的污染修复中。本研究所分离到的产铁载体细菌是来源于矿区含镍土壤中的花生根际,因此其对镍有一定的耐受性。重金属镍是植物生长的微量营养元素,但过多的镍会给植物带来危害[33],而有些植物却是镍的富集体,比如车前草[34]Alyssum Linnaeus[35]。本研究分离筛选出产铁载体能力强的芽孢杆菌HSGJ1,其培养2 d后产生铁载体的浓度为156.56 mg/L,且其对Ni2+具有较强的耐受性。因此,可将HSGJ1应用于有轻微Ni污染土壤的植物栽培种植中,具有较好的应用价值。

芽孢杆菌是一类分布广泛、功能多样化的微生物,但不同环境下产铁载体细菌各不相同。林天兴等[36]从棉田土壤中分离获得的产铁载体细菌SS05属于莫哈韦芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)。朱彭玲等[37]在新疆地区的根际棉土壤中捕获到58株产铁载体菌株,BOX-A1R及16S rRNA基因测序分析供试菌株属于假单孢杆菌(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、不动细菌属(Acinetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、短状杆菌属(Brachybacterium)和泛菌属(Pantoea)。本研究筛选获得的花生根际产铁载体细菌都属于芽孢杆菌(Bacillus),其可能因为有芽孢休眠体具有较强的抗逆性而存活于矿区边缘的含镍土壤中。本研究分离获得的5株产铁载体菌株的16S rRNA基因相似性和系统进化分析表明其与芽孢杆菌Bacillus tequilensisBacillus subtilis高度同源。Gatson等[38]曾报道Bacillus tequilensis是一类与Bacillus subtilis密切相关的种属,具有很高的相似性,很难通过16S rRNA基因序列分析将其分开。Stackebrandt等[39]将大于97%的16S rRNA基因序列相似性鉴定为同一种群,但由于16S rRNA基因很难将Bacillus tequilensisBacillus subtilis鉴别开,因此只能将HSGJ1鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)。本研究获得的5株产铁载体细菌与Bacillus tequilensisBacillus subtilis在系统进化树上虽聚为同一个分支,但在遗传距离上存在微小的差别,且这5株细菌产铁载体活性和对Ni2+耐受能力各不相同,这都说明这5株产铁载体细菌是完全不同的芽孢杆菌(Bacillus)。

盆栽实验中,接种产铁载体芽孢杆菌HSGJ1的花生植株的生长、生物量及氮磷钾含量明显增加,这说明产铁载体芽孢杆菌HSGJ1具有较好的促生特性。同时,产铁载体芽孢杆菌HSGJ1能明显降低花生地上部分和根部的Ni2+含量,这可能是因为HSGJ1产生铁载体螯合基质中的Ni2+,从而抑制花生对镍的吸收。花生是对铁元素敏感的植物之一,铁能影响花生的氮素代谢和叶绿素的合成,并增强植株的抗病能力[40]。重金属镍胁迫下会影响花生对Fe元素的吸收与利用,从而造成铁元素的缺失,使叶绿素的合成受阻,影响花生的生长[41]。本研究筛选的产铁载体细菌接种到花生根际可以改善花生的缺铁症状,可能与其产生的铁载体螯合铁来摄取铁营养元素有关,从而增强花生抵抗重金属镍的毒害作用,有效促进了花生的生长。Tank等[42]报道在重金属Ni污染的土壤中接种产铁载体的根际促生菌能增加鹰嘴豆的生物量并使植物Ni含量降低50%。Tripathi等[43]研究报道接种耐Pb和Cd的产铁载体菌株Pseudomonas putida KNP9可提高绿豆的生物量,并减少对Pb和Cd的富集吸收。在本研究中,花生植物对重金属镍的吸附随基质中Ni2+浓度的增加而增加,但在50 mg/kg和100 mg/kg的Ni2+基质中产铁载体芽孢杆菌HSGJ1均能使花生根部和地上部分的Ni含量减少,使其株高、根长、生物量及氮磷钾含量增加,这可能是通过缓解重金属Ni对花生的毒害作用而促进了植株生长。当基质中Ni2+浓度为150 mg/kg时,接种花生和对照植株的株高、根长、生物量、氮磷钾含量及重金属镍含量不存在显著性差异(P<0.05),可能是因为镍对HSGJ1的最小致死浓度为150 mg/kg,在此浓度的Ni2+基质中HSGJ1已死亡。

农耕地是经济作物种植常用地,土壤中镍含量较高会影响经济作物的种植。为了模拟含Ni农耕土壤环境,根据土壤环境质量标准GB15618-1995要求农耕土壤中三级标准Ni总量≤200 mg/kg,盆栽实验中Ni2+最大浓度设置为150 mg/kg。本研究验证了在农耕土壤镍污染三级标准值范围内,不同浓度镍胁迫下产铁载体芽孢杆菌HSGJ1对花生均有促生作用,并能够有效地降低花生植株中的Ni2+含量,这为镍污染农耕土壤花生等农作物的生产提供了可利用的微生物固定技术和理论依据。

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