肠道菌群约占人类共生微生物的95%，构成了影响人类健康的重要内在环境因素^[1]。在消化、营养及免疫等方面，其发挥对机体健康的保护作用^[2]。越来越多的证据表明，肠道微生物与中枢神经系统的功能之间具有密切的联系，并影响脑的功能和行为。肠道微生物被认为是通过“微生物-肠道-脑轴(microbiota-Gut-Brain axis)”对中枢神经系统产生影响^[3]。随着对肠道共生微生物的深入研究，一些中枢神经系统的疾病被证实与肠道共生菌群的失调相关，如自闭症^[4]、抑郁症^[5]、帕金森病^[6]等。最近，阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD，俗称“老年性痴呆”)的发生发展也被证明与肠道菌群相关，并认为AD的发病可能始于肠道^[7]。

我国人口老龄化日趋严重，老年人口约占我国总人口的10%以上。到2050年，我国将有800-1200万AD患者，严重危害老年人的身心健康和生活质量，给患者造成痛苦，给家庭和社会带来沉重的经济和精神负担。AD是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，约占所有老年痴呆的60%-80%^[8]，主要表现为渐进性记忆和认知损害，包括人格改变及语言障碍等^[9]。因此，研究老年性痴呆的发生发展机制，不但具有理论意义，同时具有潜在的重要应用价值。

甲醛具有强烈的毒性，小鼠处于气态甲醛环境中，可出现明显认知能力下降，产生抑郁、焦虑等行为^[10]。Kilburn等发现，在解剖或病理实验室工作的技术人员，由于长期接触福尔马林(37%甲醛)，在退休后发生痴呆的概率显著高于同龄对照^[11]。王佳琬等观察到，老年人( > 65岁)经历大型或长时间手术，发生手术后认知损害(post operative cognitive dysfunction，POCD)的概率会显著增加，而发生POCD患者尿甲醛浓度，显著高于未发生POCD的患者^[12]。杨美凤等采用低浓度甲醇喂食年轻猕猴(3-5岁)，检测到猴脑脊液甲醛浓度显著升高，学习记忆能力下降，脑内出现老年斑(Aβ淀粉样沉积)，神经Tau蛋白异常磷酸化等老年性痴呆的典型病理征兆^[13-14]。临床实验表明，阿尔兹海默病病人内源甲醛的浓度与其认知损害程度呈正相关^[15]。

APP/PS1转基因老年性痴呆小鼠是目前国内外最常用于AD研究的动物模型鼠^[16]，被广泛用于AD的发病因素、病理机制、药效学等研究。本文选用APP/PS1转基因小鼠作为对象，以野生型C57BL/6J小鼠为对照，分析和比较肠道内甲醛的含量，以探索AD模型鼠肠道菌群甲醛代谢的状况。

7月龄APP/PS1转基因小鼠(n=8) 和相同月龄C57BL/6J野生型小鼠(n=9) 来自北京华阜康生物科技股份有限公司。APP/PS1实验小鼠和C57BL/6J对照小鼠均在相同条件下饲养。

2, 4-二硝基苯肼(2, 4-dinitrophenylhydrazine，DNPH)、三氯乙酸、乙腈及甲醛，德国Sigma公司。LC-20A高效液相色谱仪UV-HPLC、SPD-M20A二极管阵列检测器，日本岛津公司；色谱柱：LiChrospher 100 RP-18 (250 mmx4.6 mmx5 mm)，德国Merck公司。

实验开始前，称小鼠体重和血糖。处死后，立刻取肠段。从胃到肛门的方向，依次分取小鼠肠段，即十二指肠、小肠、盲肠、结肠；肠道截取后，在冰浴中迅速将小肠、盲肠和结肠内的消化物分别取出，称量湿重，迅速进行甲醛测定。由于十二指肠内消化物非常少，无法测定其消化物内的甲醛浓度。

消化物收集后，立刻采用10倍于肠道组织体积的预冷(4℃)生理盐水灌洗肠道3次，包括十二指肠、小肠、盲肠、结肠肠段，洗净后，迅速进行甲醛的测定。

样品制备：取不同肠段内的消化物各1.0 g，加入10%三氯乙酸溶液(10 ml)，混匀后4 ℃、13 000 r/min离心30 min。

取0.4 ml上清、0.1 ml 2, 4-二硝基苯肼(1.0 g/L)和0.5 ml乙腈混匀后，60 ℃保温30 min，4 ℃、13 000 r/min离心10 min，取上清用于HPLC分析甲醛。甲醛测定的具体方法参考本实验室的2, 4-二硝基苯肼HPLC方法^[17]。

样品制备：取不同肠段各1.0 g，加入10%三氯乙酸溶液(10 ml)，加入0.5 mL repa组织裂解液匀浆1 min，4 ℃、13 000 r/min离心30 min，取0.4 ml上清测定甲醛的含量。

采用Graphpad软件对获得的数据进行one-Way ANOVA统计分析并作图，数值使用平均值±标准误差(S.E.M)表示，P < 0.05时被认为有显著性差异。

对实验小鼠和对照小鼠的基本生理状况进行了比较，分别称量APP/PS1转基因小鼠和C57BL/6J小鼠的体重，如图 1a所示，两组小鼠的体重无显著差异(P > 0.05)。同时对两组小鼠的血糖进行了分析，APP/PS1转基因小鼠的血糖有轻微升高(图 1b)，但尚未达到显著差异(P=0.09)。

图 1　APP/PS1转基因小鼠与C57BL/6J野生型小鼠的体重和血糖的比较 Figure 1　Comparison of body weight and blood sugar between APP/PS1 transgenic mice (n=8) and C57BL/6J mice (n=9) before they participated the experiments

图选项

为了比较APP/PS1转基因小鼠与C57BL/6J野生型小鼠肠道内甲醛含量，采用HPLC偶联DNPH显色法^[17]，对不同肠段的消化物进行甲醛含量分析。结果显示(表 1)，APP/PS1老年性痴呆转基因小鼠盲肠内消化物的甲醛含量最高，并且显著(P=0.036) 高于C57BL/6J小鼠(图 2)。两组鼠的小肠和结肠消化物中的甲醛含量无显著差异(P > 0.05)。

图 2　APP/PS1转基因小鼠与C57BL/6J野生型小鼠肠道消化物的甲醛含量 Figure 2　Comparison of concentrations of formaldehyde in the intestinal digestion contents between APP/PS1 transgenic mice and C57BL/6J wildtype mice Note: Concentrations of formaldehyde in small intestine, cecum and colon of APP/PS1 and C57BL/6J mice were determined with HPLC-coupled with DNPH absorption measurements. The levels of the cecum formaldehyde of APP/PS1 mice (n=8) were significantly (P < 0.05) higher than C57BL/6J wildtype mice (n=9) used as control. However, levels of formaldehyde in small intestine and colon between both APP/PS1 and C57BL/6J mice were not markedly different (P > 0.05).

图选项

APP/PS1转基因小鼠盲肠消化物甲醛浓度显著高于其自身的小肠(P=0.022) 和略高于大肠消化物(P=0.097)。这些结果提示，老年性痴呆模型小鼠盲肠内甲醛蓄积，而且浓度高于其他肠道的消化物。

甲醛能够进入细胞^[18]，从而被肠道吸收。为了进一步了解甲醛在肠道内的分布，测定了十二指肠、小肠、盲肠以及结肠壁内甲醛的含量(表 1)。虽然APP/PS1转基因小鼠盲肠壁内的甲醛浓度与对照鼠的浓度相比无显著差异。但可以观察到，盲肠壁的甲醛含量最高，其次是结肠和小肠壁组织(图 3)。APP/PS1转基因小鼠小肠壁内的甲醛含量较对照组有升高，但无统计学上的显著差异(P < 0.052)。然而，比较各肠段壁内的甲醛含量显示，无论实验组还是对照组，其盲肠壁的甲醛含量为最高。

图 3　APP/PS1转基因小鼠肠壁组织中的甲醛含量 Figure 3　Concentrations of formaldehyde in the intestinal wall of APP/PS1 transgenic mice 注：与C57BL/6J小鼠比较，APP/PS1转基因小鼠小肠壁的甲醛含量升高，接近显著差异(P < 0.052)；但其他肠壁中甲醛的含量，两组相比，未见显著升高(P > 0.05). Note: Conditions were as for Materials and Methods, except that concentrations of formaldehyde in the intestinal wall were determined. Levels of formaldehyde in small intestinal walls of APP/PS1 and C57BL/6J mice were observably different (P < 0.052). However, levels of formaldehyde in the duodenum, cecum, and colon walls were not significantly different (P > 0.05).

图选项

APP/PS1模型组盲肠消化物的甲醛浓度平均值为141.87 μmol/kg，而对照组为92.84 μmol/kg，AD鼠增加了52.8%。从肠道壁来看，尽管AD模型鼠和野生型鼠的盲肠壁不存在显著差异(P > 0.05)，但盲肠壁内的甲醛含量均高于十二指肠、小肠、结肠壁组织。说明甲醛的蓄积主要发生在盲肠。

通过比较APP/PS1与C57BL/6J小鼠肠道内甲醛含量，作者认为，肠道菌群是人体内产生甲醛的主要来源之一，其理由是：(1) 在哺乳动物细胞培育过程中，细胞自身可以产生少量甲醛，如小鼠神经母细胞瘤N2a细胞中约为5 μmol/L^[19]，血管上皮bEnd.3细胞中约为4 μmol/L，远低于肠道内甲醛的水平，提示肠道壁细胞对肠道甲醛的贡献很小^[20]；(2) C57BL/6J野生型小鼠脑内甲醛含量仅为14.2±2.1 μmol/L^[21]，远低于其盲肠消化物的浓度92.84±8.96 μmol/L；(3) C57BL/6J野生型小鼠盲肠壁内甲醛浓度为126.44±12.02 μmol/L，说明甲醛能够进入肠壁组织；(4) APP/PS1转基因小鼠盲肠消化物甲醛浓度高达141.87±20.22 μmol/L，肠壁为114.95±10.06 μmol/L，接近野生型小鼠脑甲醛浓度的10倍；(5) 已有研究报道，甲醛可以迅速通过细胞，从而被肠道吸收^{[18, 22]}。以上结果显示，甲醛可以由肠道菌群产生，从而被肠道吸收。

在肠道菌群中，有益生菌和致病菌，它们均能够产生和代谢甲醛。肠道内的益生菌，如Lactobacillus fermentum strain NS9、Lactobacillus helveticus及Bifidobacteria longum三种益生菌对人类的认知甚至学习记忆有益(表 2)。它们分别含有ADH、ALDH及ADH甲醛代谢酶，具有降解甲醛的作用。Lactobacillus fermentum strain NS9^{[24, 34]}和Lactobacillus helveticus^[25]具有改善大鼠心理认知状态、增强小鼠学习记忆能力的作用^[26]。

另一方面，在老年性痴呆发生发展过程中，肠道内也寄生有一些致病菌，如Chlamydia pneumoniae^[29-30]、Helicobacter pylori^[31-32]及Toxoplasma gondii^[33]，它们分别与老年性痴呆相关，在AD发生发展的过程中发挥不良作用。这些研究工作证实，在老年性痴呆的进程中，患者体内的肠道菌群发生改变，导致肠道菌群的代谢失调，从而影响脑的认知功能。

肠道微生物菌群是体内甲醛的主要来源，对于盲肠来说，无论是消化物还是肠壁组织，其甲醛含量均比其他肠段要明显高得多。相比之下，老年性痴呆模型小鼠的小肠壁甲醛也有较高的含量。这些结果提示，必须重视肠道菌群的甲醛产生与代谢问题，特别是老年性痴呆病人肠道菌群的甲醛代谢失调。

老年性痴呆住院患者和正常人的内源甲醛分别为13.70±5.17 mmol/L及9.61±2.90 mmol/L^[21]。内源甲醛作为临床检验的生物标志物，可以用于老年认知损害的指标，但该临床指标不能用来区分阿尔茨海默病与血管性痴呆(VD)。然而，AD和VD可以通过病史进行鉴别诊断。“微生物-肠道-脑轴”不但与衰老相关，也与认知损害相关^[35]。对于65岁以上的老人，进行尿和粪便甲醛的测定，对出现内源甲醛升高的老人，可以作为生物学标志物在流行病学和临床上药物干预方面加以应用，以利于早期发现、早期诊断，以肠道甲醛代谢为药物作用靶点进行早期预防，从而减少甲醛对中枢神经系统和认识的损害。