2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 褚娇艳, 刘腾飞, 张汉虞, 邱乐泉
- CHU Jiao-yan, LIU Teng-fei, ZHANG Han-yu, QIU Le-quan
- 一株邻苯二甲酸二丁酯降解菌的筛选及其降解特性
- Screening and characterization of a dibutyl phthalate-degrading bacterium
- 微生物学通报, 2017, 44(7): 1555-1562
- Microbiology China, 2017, 44(7): 1555-1562
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170127
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文章历史
- 收稿日期: 2017-02-18
- 接受日期: 2017-04-18
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2017-05-31
邻苯二甲酸酯类化合物(Phthalic acid esters，PAEs)是世界上广泛使用的人工合成难降解有机化合物，主要用于塑料增塑剂、涂料、油漆等化工生产中[1]。我国已将PAEs中的邻苯二甲酸-(2-乙基己基)酯(Dioctyl phthalate，DEHP)、邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate，DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate，DEP)和邻苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate，DMP)列为环境优先污染物[2]。已有证据表明，PAEs是一类环境内分泌干扰物，其最明显的危害是使生殖机能下降，对动物及人类生殖系统有一定损害，可引起睾丸萎缩、精子减少、生殖细胞超微结构改变，且对胚胎发育有一定毒性作用[3]。目前，PAEs在全球主要工业国的生态环境中已达到了普遍检出的程度。PAEs在环境中的水解、光解的速率非常缓慢，属于难降解物质，微生物降解被认为是自然环境中PAEs完全矿化的主要过程[4]。DBP是PAEs中的重要成员，前人研究中已分离到多种微生物表现出降解DBP的能力，如Gordonia sp.[5]、Sphingomonsasp.[6]、Arthrobacter sp.[7]Rhodococcussp.[8]、Acinetobacter sp.[9]等。经典的邻苯二甲酸酯降解途径认为，不管在有氧还是无氧条件下，PAEs在相关酯酶作用下先水解为邻苯二甲酸单酯，再进一步水解为邻苯二甲酸(PA)，在有氧环境下，邻苯二甲酸通过邻苯二甲酸双加氧酶催化生成二羟基邻苯二甲酸，再经过脱氢和脱羧最后形成原儿茶酸；原儿茶酸可通过正位或偏位开环形成相应的有机酸，进而转化成丙酮酸、琥珀酸、草酰乙酸等进入三羧酸循环，最终转化为CO2和H2O[4]。为了获得高效的邻苯二甲酸酯降解菌株，有效解决邻苯二甲酸酯类化合物的环境污染，本研究从杭州河道污水出口的淤泥中分离并鉴定了一株DBP降解能力较强的菌株Arthrobacter sp. ZJUTW，研究了其对DBP的降解特性、休止细胞降解能力，并对代谢途径进行了初步分析。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器DMP、DEP、DBP、DEHP均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；甲醇(色谱级)，天津四友化工有限公司；其余试剂均为分析纯；细菌基因组DNA快速抽提试剂盒、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒、pUCm-T载体，生工生物工程(上海)股份有限公司。JEM-1230型透射电镜，日本JEOL公司；Agilent 1260高效液相色谱仪、Agilent 6890N/5975c型GC-MS，美国Agilent公司。
1.2 培养基基础无机盐培养基(g/L)：K2HPO4·3H2O 1.0，NaCl 1.0，(NH4)2SO40.5，MgSO4·7H2O 0.4，CaCl2 0.075 5，FeCl3 0.014 3，pH 7.0。
选择培养基：每升无机盐培养基加适量DBP的甲醇溶液，使DBP终浓度为125 mg/L。
LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，pH 7.0。
1.3 方法 1.3.1 DBP降解菌的筛选与鉴定:取杭州市河道污水出口处淤泥1 g置于100 mL水中，混匀，静置，然后取1 mL加入到250 mL选择培养基中，DBP初始浓度为125 mg/L，30℃、180 r/min培养4 d，重复多次驯化。将有明显生长的培养液稀释涂布培养，同时检测DBP降解情况，平板涂布法分离得到单菌落，挑取单菌落进行形态、生理生化分析。采用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取菌株ZJUTW基因组，以通用引物27F (5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-CTACGGCTA CCTTGTTACGA-3′)扩增16S rRNA基因序列[10]。50 μL PCR反应体系为：10×PCR buffer 5 μL，20 mmol/L dNTPs 4 μL，25 mmol/L引物各1.0 μL，菌体DNA 1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶1μL，加ddH2O至50μL。PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1 min，32个循环；72℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，采用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒回收16S rRNA基因片段，然后克隆至pUCm-T载体，并由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序，用MEGA 4.0软件构建系统发育树。
1.3.2 不同培养条件对菌株降解DBP的影响:将筛选到的菌株接种到LB培养基，30℃、180 r/min培养12 h，4℃4 000 r/min离心收集细胞，用无机盐液体培养基重悬至菌液浓度OD600约为1.0，以此作为种子液，按2%的接种量，通过改变培养基初始pH、温度、DBP浓度等条件，考察各生长因素对菌株降解DBP的影响，并考察了该菌株的底物利用情况和对PAEs混合底物(DMP、DEP、DBP、DEHP各125 mg/L)的降解能力。
有机污染物的降解可采用模型进行降解动力学分析[11]。DBP的降解是微生物胞内酶作用完成的，属酶促反应，其反应过程应符合米氏方程：V=Vm[C]/(Km+[C])，方程中[C]表示底物浓度，V为反应速率，Km表示最大反应速度达一半时的底物浓度；当[C]≪Km时，为一级反应，方程可写为lnC=-Kt+A (C为初始DBP浓度，t为时间，K为反应速率常数，A为常数)。假设菌株对DBP的生物降解遵循一级反应动力学方程，将降解过程中DBP残留浓度的测定数据进行对数转换，用Origin 8.0软件拟合降解动力学方程，并计算DBP的半衰期t1/2=ln2/K。
1.3.3 休止细胞的制备及对DBP的降解:将菌株接种到LB培养基，30℃、180 r/min培养到对数末期，4℃4 000 r/min离心收集细胞，用无菌水洗一次，沉淀悬浮于pH 7.0的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液中，制成菌悬液，使其菌体浓度至OD600为1.2。加入DBP至终浓度分别为125、250、400、800和1 200 mg/L，考察对休止细胞降解DBP的影响。
1.3.4 HPLC法检测PAEs:取经不同处理的培养液，加入等体积二氯甲烷，剧烈振荡后静置30 min，将水相再次用等体积二氯甲烷萃取，将两次萃取的有机相合并，旋转蒸发仪上蒸干后用1 mL甲醇溶解，以10 μL进样，用Agilent 1260 HPLC检测，检测条件为：流动相：90%甲醇+10% H2O，流速1.0 mL/min，Hypersil BDS C18色谱柱，二极管阵列(DAD)检测器，检测波长235 nm。
1.3.5 GC-MS测定降解产物:色谱条件：色谱柱为HP-5MS (30 m×250 mm×0.25 μm)；载气为高纯度He，载气流速1.0 mL/min；进样口温度：250℃；柱温条件：初始温度60℃，保持1 min，以60℃/min升温至220℃，保持2 min，以5℃/min升温至250℃，保持2 min，再以5℃/min升温至280℃，保持3 min；进样量1 μL，不分流进样。质谱条件：电子轰击(EI)离子源；电离能量70 eV；离子源温度230℃；接口温度280℃；全扫描(SCAN)质量范围：40-400 m/z；选择离子扫描(SIM)。
1.3.6 数据分析:研究中各处理采用3次重复，用Origin 8.0软件进行误差线作图(均值±标准差)，用SPSS 16.0进行统计分析。
2 结果与分析 2.1 DBP降解菌的筛选与分离经过筛选后分离到一株DBP降解菌株ZJUTW，HPLC分析结果表明(图 1)，培养12 h后，菌株已将125 mg/L DBP显著降解。在固体选择平板上形成的菌落呈圆形，凸起，湿润有光泽，乳白色，不透明。在透射电镜下(图 2)呈短杆状，无鞭毛。大小约(0.6-1.0) μm×0.35 μm。此外，菌株生长4 h多呈杆状，而生长24 h则多呈球状，说明菌株ZJUTW在生长过程中存在球、杆形态变化。对该菌株进行生理生化试验，结果表明明胶液化试验、淀粉水解试验、反硝化试验、柠檬酸盐试验、接触酶试验呈阳性；吲哚试验、甲基红试验、伏-普试验、葡萄糖发酵试验、木糖发酵试验结果呈阴性。PCR扩增16S rRNA基因(1 579 bp)，Genbank中的序列登录号为JN968374，用MEGA 4.0构建系统发育树(图 3)，该菌株与Arthrobacter sp. S15在同一个系统发育分支；结合形态、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析，表明该菌株与Arthrobacter属分类特征相符，将其命名为Arthrobacter sp. ZJUTW。
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| 图 1 菌株ZJUTW降解DBP的HPLC图 Figure 1 HPLC-chromatogram of the degradation of DBP by strain ZJUTW |
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| 图 2 菌株ZJUTW的透射电镜图 Figure 2 Photograph of transmission electron microscope of strain ZJUTW |
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| 图 3 Arthrobacter sp. ZJUTW的系统进化发育树 Figure 3 Phylogenetic tree of Arthrobacter sp. ZJUTW 注：采用邻接法计算距离，节点上的数值是自展值(%)，括号中为菌株的登录号. Note: Distances were calculated using neighbor-joining method. The numbers at the branch nodes are bootstrap values (%). Accession numbers of the bacterial isolates are shown in brackets. |
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培养基初始pH分别设置为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，DBP浓度为125 mg/L，2%接种量的条件下，菌株ZJUTW对DBP的降解如图 4A所示。在初始pH为6.0-9.0时，DBP均被快速降解，其中pH 7.0-8.0的降解最优，在14 h将DBP基本完全降解，而当初始pH为5.0时，菌株ZJUTW只降解23.8%的DBP，说明最适pH为7.0-8.0。
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| 图 4 初始pH (A)与温度(B)对菌株ZJUTW降解DBP的影响 Figure 4 Effect of pH (A) and temperature (B) on degradation of DBP by Arthrobacter sp. ZJUTW 注：误差线代表标准差，星号(*)代表显著性差异(p＜0.05). Note: Error bars indicate standard deviation. Asterisks (*) indicate a significant difference between treatments (p < 0.05). |
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在不同培养温度(25、30、37、42℃)、DBP初始质量浓度为125 mg/L，2%接种量的条件下，菌株ZJUTW对DBP的降解如图 4B所示。在30℃和37℃时，培养14 h菌株ZJUTW均基本完全降解DBP，其中以30℃最优，而在25℃只能降解36%，42℃的降解率则只有9.6%。
2.3 DBP浓度对菌株ZJUTW降解的影响不同底物浓度对菌株ZJUTW降解DBP的影响如图 5所示，菌株ZJUTW对初始浓度分别为125、250、400及800 mg/L的DBP 14 h的降解率分别为98.5%、93.1%、93.9%和83.4%。但是当DBP浓度升至1 200 mg/L时，菌株ZJUTW对其只能降解23.6%左右。DBP的微生物降解是酶促反应过程，菌株对DBP的降解在125-800 mg/L符合酶促一级反应动力学模型(表 1)，遵循一级反应动力学方程：lnC=-Kt+A (C为初始DBP浓度，K为反应速率常数，A为常数)，DBP浓度在800 mg/L，其半衰期也仅为10.47 h，说明该菌株对DBP有较高的降解能力，同时对DBP的耐受浓度也可达1 200 mg/L。
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| 图 5 不同底物浓度对菌株降解DBP的影响 Figure 5 Effect of different initial DBP concentrations on degradation by Arthrobacter sp. ZJUTW 注：误差线代表标准差，星号(*)代表显著性差异(p＜0.05). Note: Error bars indicate standard deviation. Asterisks (*) indicate a significant difference between treatments (p < 0.05). |
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| 初始DBP 浓度Initial concentration (mg/L) |
Kinetic equations | t1/2(h) |
| 125 | lnC=-0.121 8t+4.604 5 | 5.69 |
| 250 | lnC=-0.111 9t+5.305 5 | 6.19 |
| 400 | lnC=-0.080 4t+5.919 2 | 8.62 |
| 800 | lnC=-0.066 2t+6.843 7 | 10.47 |
以不同底物为唯一碳源培养菌株ZJUTW，以考察其底物利用情况，结果表明：菌株ZJUTW能够在以DMP、DEP、DBP为唯一碳源的培养基上生长良好，在DEHP、PA及邻苯二酚为唯一碳源的培养基上可以生长，但是无法在以萘、噻吩、咔唑以及苯酚为唯一碳源的培养基上生长。以4种PAEs混合物为底物(DMP、DEP、DBP、DEHP各125 mg/L)、2%接种量、30℃、pH 7.0的条件下，菌株ZJUTW对PAEs混合物的降解如图 6A所示。在24 h内，菌株ZJUTW能够将DBP、DEP和DMP完全降解，其中以DBP最快，在12 h降解了96.2%，其次为DEP和DMP，而DEHP则降解效果最差，培养24 h后降解率只有25%；说明在混合底物中，DBP为最适底物，由于DEHP具有较长的碳链，降解也难度更大。
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| 图 6 Arthrobacter sp. ZJUTW对PAEs混合物的降解(A)及其休止细胞对不同浓度DBP的降解(B) Figure 6 Degradation of mixed PAEs (A) by Arthrobacter sp. ZJUTW and different initial DBP concentrations (B) by resting cells 注：误差线代表标准差，星号(*)代表显著性差异(p＜0.05). Note: Error bars indicate standard deviation. Asterisks (*) indicate a significant difference between treatments (p < 0.05). |
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生长细胞受到外界化学或物理作用后会相应地发生变化，如基因表达、蛋白稳定性的变化等[9]。而采用休止细胞则可以避免这种影响，同时还具有反应专一性强，可以提高底物转化率，不易染杂菌，可减少产物对菌体生长及酶合成的抑制[10]等优点，因此利用休止细胞进行底物降解或转化有明显优势。在不同DBP浓度(125-1 200 mg/L)的磷酸缓冲液，加入菌株ZJUTW的休止细胞至OD600为1.2，30℃、180 r/min考察其对DBP的降解，结果如图 6B所示。休止细胞在8 h内可将125 mg/L和250 mg/L的DBP完全降解。随着DBP浓度的增加，DBP被完全降解的时间也延长，当初始DBP浓度为1 200 mg/L时，休止细胞也可在20 h将其完全降解。而生长细胞虽然可耐受1 200 mg/L的DBP，但降解率很低(23.6%)，说明休止细胞的降解效果远优于生长细胞。
2.6 DBP降解中间产物分析采用GC-MS分析菌株ZJUTW降解DBP的中间产物，结果如图 7A、B所示。降解产物中出现邻苯二甲酸丁基甲酯(butyl methyl phthalate，BMP)、邻苯二甲酸二甲酯(Dimethyl phthalate，DMP)和邻苯二甲酸(phthalic acid，PA)，推测当存在甲醇时，菌株先通过DBP酯酶催化酯交换反应，将甲醇的甲基转移置换出一个丁基形成不对称酯，然后再次转移甲基置换出另一个丁基形成DMP，其后再通过酯水解反应形成PA，因此其降解的起始步骤为：DBP→BMP→DMP→PA (图 8)。
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| 图 7 邻苯二甲酸丁基甲酯(A)与邻苯二甲酸(B)质谱图 Figure 7 Mass spectrum of butyl methyl phthalate (A) and phthalic acid (B) |
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| 图 8 DBP的降解途径 Figure 8 The degradation pathway of DBP by Arthrobacter sp. ZJUTW |
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Arthrobacter是一类广泛存在于自然环境中的革兰氏阳性菌，已发现该属的微生物具备降解多种有机污染物的能力。目前也已发现多个菌属的微生物具备DBP降解能力，如Wang等分离到一株Arthrobacter sp. ZH2[7]降解500 mg/L DBP的t1/2为10.19 h；Jin等[5]分离到一株Gordonia sp. strain QH-11降解750 mg/L DBP的t1/2为17.51 h；而Rhodococcus sp. JDC-11[8]则表现出更强的降解能力，可在24 h内将1 000 mg/L的DBP完全降解。本研究筛选到的Arthrobactersp. ZJUTW生长细胞可完全降解800 mg/L的DBP，t1/2为10.47 h，且其休止细胞降解能力远优于生长细胞，可在20 h降解1 200 mg/L的DBP，表现出较强DBP降解能力，具有较好的研究价值。
细菌对PAEs的代谢途径已有较多的研究，PAEs代谢过程中酯键分解是起始降解的关键步骤。目前文献对该起始步骤主要涉及的有酯水解反应[12]、酯交换反应[13]以及β氧化反应[14]等方式。本研究根据GC-MS中间产物分析发现在以甲醇为溶剂时，Arthrobacter sp. ZJUTW可通过酯交换反应方式起始降解。目前对PAEs的微生物降解研究基本集中在酯水解方式上，但由于环境污染物中成分非常复杂，常有醇类污染物存在，极有可能同时存在多种起始降解方式，因此，通过对多种降解方式差异的比较，阐明PAEs的微生物代谢机理，将有助于更透彻地了解PAEs在环境中的行为。
4 结论从杭州市河道污水出口处淤泥中筛选到一株DBP降解菌，经初步鉴定并命名为Arthrobacter sp. ZJUTW，并考察了不同因子对该菌株降解DBP的影响。结果表明，该菌株降解DBP的最优pH为7.0-8.0，最适温度为30℃，在DBP浓度为800 mg/L时，t1/2为10.47 h，且可耐受1 200 mg/L的DBP；此外，该菌株的休止细胞表现出远优于生长细胞的降解能力，可在20 h将1 200 mg/L的DBP完全降解。采用GC-MS分析对菌株ZJUTW降解DBP的中间产物进行分析，发现降解产物中出现BMP、DMP和PA，表明该菌株采用酯交换方式起始DBP的降解，推测其降解的起始步骤为：DBP→BMP→DMP→PA。
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