微生物学通报  2017, Vol. 44 Issue (7): 1513−1524

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李朔, 许楹, 周宁一
LI Shuo, XU Ying, ZHOU Ning-Yi
三氯卡班降解菌株Sphingomonas sp. YL-JM2C中多个邻苯二酚双加氧酶的功能
Functional characterization of multiple catechol dioxygenases in triclocarban degrader Sphingomonas sp. YL-JM2C
微生物学通报, 2017, 44(7): 1513-1524
Microbiology China, 2017, 44(7): 1513-1524
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170100

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收稿日期: 2016-02-08
接受日期: 2017-03-22
优先数字出版日期(www.cnki.net): 2017-04-05
三氯卡班降解菌株Sphingomonas sp. YL-JM2C中多个邻苯二酚双加氧酶的功能
李朔, 许楹, 周宁一     
上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室    上海    200240
摘要【目的】 研究Sphingomonas sp. YL-JM2C菌株的生长特性,确定以三氯卡班作为碳源的生长情况。挖掘菌株YL-JM2C潜在的邻苯二酚1, 2-双加氧酶及邻苯二酚2, 3-双加氧酶基因,在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达邻苯二酚双加氧酶基因并研究其酶学性质。【方法】 优化S.sp. YL-JM2C菌株以三氯卡班作为碳源时的培养条件,并利用全自动生长曲线测定仪测定菌株生长情况,绘制生长曲线。通过生物信息学方法挖掘潜在的邻苯二酚双加氧酶基因,并分别在Escherichia coli BL21(DE3) 中进行异源表达,通过AKTA快速纯化系统纯化蛋白,分别以邻苯二酚、3-和4-氯邻苯二酚为底物检测重组蛋白的酶学特性。【结果】 菌株在pH为7.0−7.5时生长最优。在以浓度为4−8 mg/L的三氯卡班做为底物时,菌株适宜生长。当R2A培养基仅含有0.01%酵母提取物和无机盐时,加入终浓度为4 mg/L的三氯卡班可促进菌株生长。挖掘到6个潜在的邻苯二酚双加氧酶基因stcA1stcA2stcA3stcE1stcE2stcE3,表达并通过粗酶液分析证明其中5个基因stcA1stcA2stcA3stcE1stcE2编码的酶均具有邻苯二酚双加氧酶和氯邻苯二酚双加氧酶的活性;纯化酶的底物范围研究揭示了StcA1、StcA2和StcA3均属于Ⅱ型邻苯二酚1, 2-双加氧酶,StcE1和StcE2为两个新型邻苯二酚2, 3-双加氧酶;它们酶动力学分析研究证明了5个酶对邻苯二酚的亲和力和催化效率最高,4-氯邻苯二酚次之。【结论】 在同一菌株中发现了5个具有功能的邻苯二酚双加氧酶基因,stcA1stcA2stcA3编码的酶均属于Ⅱ型邻苯二酚1, 2-双加氧酶,stcE1stcE2为两个新型邻苯二酚2, 3-双加氧酶编码基因。5个酶均具有催化邻苯二酚和氯邻苯二酚开环反应的功能,这为更好地理解微生物基因组内代谢邻苯二酚及其衍生物氯代邻苯二酚基因的多样性奠定了基础。
关键词鞘氨醇单胞菌YL-JM2C     三氯卡班     邻苯二酚     3-氯邻苯二酚     4-氯邻苯二酚     邻苯二酚1, 2-双加氧酶     邻苯二酚2, 3-双加氧酶    
Functional characterization of multiple catechol dioxygenases in triclocarban degrader Sphingomonas sp. YL-JM2C
LI Shuo, XU Ying, ZHOU Ning-Yi     
State Key Laboratory of Microbial Metabolism and School of Life Sciences & Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
Received: February 08, 2016; Accepted: March 22, 2017; Published onlineApril 05, 2017
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 31370094, 31570100)
*Corresponding author: XU Ying, Tel/Fax:86-21-34208261;E-mail:ying.xu@sjtu.edu.cn.
Abstract: [Objective] We are aiming to study the growth characteristics of Sphingomonas sp. YL-JM2C when triclocarban acts as carbon source; to mine putative genes encoding catechol 1, 2-dioxygenase and catechol 2, 3-dioxygenase from strain YL-JM2C; and to express, purify and functionally identify the putative catechol dioxygenase, then revealing the characters of catechol dioxygenases in this strain. [Methods] The growth of S.sp. YL-JM2C was measured at different pH values with different triclocarban concentrations on the optimized R2A medium containing extremely low amount of single carbon source. The putative catechol dioxygenase genes were cloned and heterologous expressed in E. coli BL21(DE3), and purified through AKTA purifier system. The purified proteins were functionally identified based on their abilities to catalyze the ring cleavage of catechol as well as its derivatives 3-chlorocatechol and 4-chlorocatechol. Their enzymatic characters were also determined through enzyme kinetics parameters. [Results] The optimal pH value was 7.0−7.5 for the growth of strain YL-JM2C, and this strain was able to utilize triclocarban as the carbon source and the optimum concentration for its growth was in the range of 4−8 mg/L. With adding 4 mg/L triclocarban, the biomass of strain YL-JM2C increased over time when this strain grew in the optimized R2A medium containing 0.01% of yeast extract and mineral salts. Six putative catechol dioxygenase genes (stcA1, stcA2, stcA3, stcE1, stcE2 and stcE3) were found through bioinformatics analysis. All exhibited catechol dioxygenase activities through assay using crude enzymes expressed in E. coli, except StcE3. Further, after purification, the substrate range analyses revealed that StcA1, StcA2 and StcA3 belonged to type Ⅱ catechol 1, 2-dioxygenase while StcE1 and StcE2 were identified as the novel type catechol 2, 3-dioxygenase, which were all able to catalyze the ring cleavage of catechol and chlorocatechol. The kinetics parameters obtained from purified enzymes revealed that the enzymes exhibited highest affinity and catalytic efficiency to catechol, followed by 4-chlorocatechol. [Conclusion] In this research, five active catechol dioxygenase genes are functional identified from a single strain, which all have the ability to catalyze the ring cleavage of catechol and chlorocatechol. Among them, StcA1, StcA2, and StcA3 belong to type Ⅱ catechol 1, 2-dioxygenase, and StcE1 and StcE2 are new type catechol 2, 3-diocygenase. This study will be greatly helpful to explore the diverse capability for the microbial aromatic degradation of microbes using catechol and chlorocatechol as ring-cleavage substrates.
Key words: Sphingomonas sp. YL-JM2C     Triclocarban     Catechol     3-chlorocatechol     4-chlorocatechol     Catechol 1, 2-dioxygenase     Catechol 2, 3-dioxygenase    

随着现代化学工业的发展,大量自然界原本不存在的异生物质涌现出来,对生态环境造成了严重污染。其中含有一个或多个苯环的芳烃污染物,因其种类繁多、结构多样、难降解的化学本质和广泛的使用性,成为环境污染物的典型代表。三氯卡班(Triclocarban)是多氯联苯的芳烃化合物,近年来频繁在污水、污泥排放中被大量检测出来。美国粮食药物管理局(FDA)认为三氯卡班对于人体抗炎症作用有所影响[1]。目前细菌降解三氯卡班的代谢途径尚未研究透彻,这无疑得到科学家们的广泛关注。

细菌代谢芳烃化合物通常经过一系列外周代谢转化为原儿茶酸、龙胆酸和邻苯二酚或其衍生物作为开环底物,进一步开环代谢并最终进入三羧酸循环[2]。芳烃化合物代谢的开环反应是微生物能否进一步代谢的关键步骤,因此,催化芳烃开环的双加氧酶是研究其代谢的焦点之一。其中,原儿茶酸开环反应的研究最为丰富,目前已有研究报道催化其开环的有原儿茶酸3, 4-双加氧酶[3]、原儿茶酸2, 3-双加氧酶[3]、原儿茶酸4, 5-双加氧酶[4],部分芳烃化合物也可通过原儿茶酸衍生物由其同源的原儿茶酸双加氧酶进行开环代谢并最终进入三羧酸循环;龙胆酸由龙胆酸1, 2-双加氧酶催化其开环反应,随后可通过异构途径或水解途径代谢并最终进入三羧酸循环[5];邻苯二酚的开环反应则分为邻位开环和间位开环两种,分别由邻苯二酚1, 2-双加氧酶或邻苯二酚2, 3-双加氧酶催化其生成顺, 顺-粘糠酸或2-羟基粘糠酸半醛,随后通过一系列反应最终进入三羧酸循环[6]

Sphingomonas sp. YL-JM2C是从工业废水中分离得到的一株纯培养革兰氏阴性菌,对磺胺莫托辛、新诺明和磺胺嘧啶这3种磺胺类抗生素具有抗性。该菌株初步被认为可代谢新型污染物三氯卡班,并通过检测部分代谢中间产物,推测了其可能的降解途径[7]。如图 1所示,三氯卡班首先通过水解生成3, 4-二氯苯胺和4-氯苯胺,4-氯苯胺经过羟基化脱氨生成4-氯邻苯二酚,随后经过一系列反应进入三羧酸循环。该菌株在三氯卡班途径中的相关研究目前尚未透彻,尚无功能基因的研究报道。

图 1 S. sp. YL-JM2C降解三氯卡班可能的代谢途径[7] Figure 1 The putative pathway of triclocarban catabolism by S. sp. YL-JM2C[7]

本文研究了S. sp. YL-JM2C的相关生长特性,通过生物信息学挖掘了3个潜在的邻苯二酚1, 2-双加氧酶基因和2个潜在的邻苯二酚2, 3-双加氧酶基因,其可能催化三氯卡班降解中间产物4-氯邻苯二酚的开环反应;并在分子和生化水平上研究了上述5个有活力的邻苯二酚双加氧酶。初步揭示了单个微生物菌种代谢邻苯二酚及其衍生物氯代邻苯二酚的多样性,进而探索微生物代谢芳烃污染物代谢机理的多样性。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株及质粒:

实验所用菌株及相关质粒如表 1所示。

表 1 实验中所用菌株及质粒 Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株/质粒
Strains/Plasmids
特征
Characteristics
来源
Source
S. sp. YL-JM2C 野生菌株,可彻底降解三氯卡班 详见参考文献[7]
E. coli BL21(DE3) F-ompT hsdS (rB-mB-) gal dcm lacY1 (DE3) Novagen
pET28a 表达载体KmR Promega
Note: KmR: Kanamycin-resistant.

1.1.2 培养基、缓冲液和抗生素:

R2A培养基参照文献[8]配制;LB培养基参照文献[9]配制。50 mmol/L pH 7.4的磷酸缓冲液:0.2 mol/L磷酸氢二钠40.5 mL,0.2 mol/L磷酸二氢钠9.5 mL,加水定容至1 L;100 mmol/L pH 8.0的磷酸缓冲液:0.2 mol/L磷酸氢二钠94.7 mL,0.2 mol/L磷酸二氢钠5.3 mL,加水定容至1 L。卡那霉素的终浓度为50 mg/L。

1.1.3 试剂及药品:

实验所用内切酶购自New England BioLabs公司;蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天试剂公司;用于回收胶、纯化、质粒提取以及基因组所用试剂盒均购自Omega公司。

1.1.4 主要仪器:

Perkin Elmer紫外分光光度计、Gene Company酶标仪(型号EPOCH2)、AKTA蛋白纯化系统购自GE公司;Ni-DA Resin FF Prepacked亲和层析柱购自金斯瑞生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株生长特性研究及优化:

30 ℃条件下,含有4 mg/L三氯卡班的R2A固体培养基中培养S. sp. YL-JM2C。挑取单菌落转接到R2A液体培养基生长,在30℃、160 r/min振荡培养至OD600约为0.5,以5 500 r/min离心10 min收集菌体,并用100 mmol/L pH 7.4的磷酸缓冲液清洗菌体重悬于R2A培养基中。进行以下3组实验:(1) 加入不同配比浓度氯化钠溶液;(2) 加入不同浓度三氯卡班溶液;(3) 调节R2A液体培养基酸碱度,对菌株在三氯卡班条件下的生长情况进行监测。除此以外,为更好地研究菌株降解三氯卡班过程中相关功能基因的酶学与表达特性,减少培养基内碳源干扰,在实验中将培养基进行优化。将R2A培养基中碳源去除,向仅含有无机盐的培养基中分别加入以下单一碳源:0.01%胰蛋白胨、0.01%酪蛋白氨基酸、0.01%葡萄糖、0.01%可溶性淀粉、0.01%的酵母提取物、4.0 mg/L的三氯卡班。利用全自动生长曲线测定仪分别检测菌株YL-JM2C利用三氯卡班的生长曲线。

1.2.2 邻苯二酚双加氧酶基因克隆及转化:

S. sp. YL-JM2C基因组序列(Genbank登录号:ASTM00000000) 进行生物信息学分析,将菌株的全基因组蛋白序列与已研究过功能的邻苯二酚1, 2-双加氧酶序列(CAM86609.1,CDF83097.1,NP_251197.1) 及邻苯二酚2, 3-双加氧酶序列(NP_049202.1,AAD02148.1,EJU14558.1,EZP74038.1) 通过Blastp进行比对,找到3个潜在的邻苯二酚1, 2-双加氧酶基因编码的蛋白StcA1 (WP_029994301.1,蛋白分子量28.3 kD)、StcA2 (WP_029995212.1,蛋白分子量34.6 kD)和StcA3 (WP_029995453.1,蛋白分子量31.4 kD),以及3个潜在的邻苯二酚2, 3-双加氧酶基因编码的蛋白StcE1 (WP_029992749.1,蛋白分子量33.1 kD)、StcE2 (WP_029995332.1,蛋白分子量33.1 kD)和StcE3 (WP_029993321.1蛋白分子量33.5 kD)。以菌株YL-JM2C基因组为模板分别扩增以上6个邻苯二酚双加氧酶基因并进行基因克隆及转化。

序列引物设计及酶切位点如表 2所示。

表 2 实验中所用引物 Table 2 Primers used in the study
引物名称
Primers
引物序列
Primers sequence (5′→3′)
限制酶酶切位点
Restriction sites
stcA1f GGAATTCCATATGATGTCGGATGCTGAACG Nde
stcA1r CGGAATTCCGTAAATCCTCCACCTCAGG EcoR Ⅰ
stcA2f ATTCCATATGGCATCCGAACTGGTGCA EcoR Ⅰ
stcA2r CCCAAGCTTCGGAGGCGATTGCTTCGTTCT Hind Ⅲ
stcA3f GGAATTCCATATGATCATCGACCACCAGGCC Nde
stcA3r CCGGAATTCTCATGGGATCGGCGCCTT EcoR Ⅰ
stcE1f GGAATTCCATATGTCCGGAACCCCAGC Nde
stcE1r CGGAATTCTCAGGTCCACTCGTGATACCAG EcoR Ⅰ
stcE2f CGGAATTCTATCTCGCCTATCCGCTTTG EcoR Ⅰ
stcE2r CCCAAGCTTCCGAATCTTTTCCGCCAT Hind Ⅲ
stcE3f CGGAATTCAGCGGATATGCCCATCCAGG EcoR Ⅰ
stcE3r CCCAAGCTTAGGAAGACATCGTCGCTCCTG Hind Ⅲ
注:下划线标注为限制性酶切位点.
Note: Underline marked restriction enzyme sites.

1.2.3 邻苯二酚双加氧酶的纯化:

将构建的大肠杆菌BL21(DE3)[pET28a-stcA1]、BL21(DE3)[pET28a-stcA2]、BL21(DE3)[pET28a-stcA3]、BL21(DE3) [pET28a-stcE1]和BL21(DE3)[pET28a-stcE2]接入LB液体培养基培养至OD600约为0.5时,加入终浓度0.1 μmol/L的IPTG诱导4 h后收集菌体。大肠杆菌BL21(DE3)[pET28a-stcA1]、BL21(DE3) [pET28a-stcA2]和BL21(DE3)[pET28a-stcA3]分别重悬于20 mL 50 mmol/L pH 7.4的含有10%甘油的磷酸缓冲液中,大肠杆菌BL21(DE3)[pET28a-stcE1]和BL21(DE3)[pET28a-stcE2]分别重悬于20 mL 100 mmol/L pH 8.0的含有10%甘油的磷酸缓冲液中,超声破碎后离心收集上清液。利用加装Ni-DA Resin FF Prepacked亲和层析柱的AKTA蛋白纯化系统对破碎上清液进行纯化。利用超滤离心柱对纯化的蛋白溶液进行浓缩,纯化的蛋白浓度利用蛋白浓度测定试剂盒通过酶标仪测定。

1.2.4 邻苯二酚双加氧酶酶学测定:

通过Perkin Elmer双波长分光光度计,分别以邻苯二酚、3-氯邻苯二酚、4-氯邻苯二酚作为底物,对粗酶液和纯化蛋白进行酶活力测定。粗酶液和纯化蛋白酶活检测及反应体系参考相关的研究报道[10],邻苯二酚1, 2-双加氧酶催化邻苯二酚、3-氯邻苯二酚和4-氯邻苯二酚开环反应,其产物的摩尔消光系数分别为16 800、17 100和12 400 mol/(L·cm)[10];邻苯二酚2, 3-双加氧酶催化邻苯二酚和4-氯邻苯二酚开环反应,其产物的摩尔消光系数为36 000 mol/(L·cm)和42 000 mol/(L·cm)[11]

1.2.5 实时定量PCR:

S.sp. YL-JM2C接种于100 mL R2A液体培养基中,在30℃、160 r/min振荡培养至OD600约为0.3时,培养液平均分装入两个三角瓶中,其中一瓶加入4 mg/L三氯卡班。两瓶培养液继续振荡培养,OD600约0.5时分别用50 mmol/L pH 7.4的磷酸缓冲液清洗菌体,再分别重悬于50 mL相同的磷酸缓冲液中。在含有4 mg/L三氯卡班的菌悬液中再加入4 mg/L三氯卡班再诱导6 h后收集菌体,另一瓶菌体为对照组。以菌株YL-JM2C的16S rRNA基因作为内参基因,以stcA1stcA2stcA3stcE1stcE2为模板设计实时定量PCR引物(表 3),利用Takara PrimeScript™ RT reagent kit with gDNA Eraser试剂盒提取RNA并反转录成cDNA,根据Takara试剂盒SYBR®Premix ExTaq™说明进行实时定量PCR测定。

表 3 实时定量PCR实验中所用引物 Table 3 Primers used in the study of Real-time PCR
引物名称
Primers
引物序列
Primers sequence (5′→3′)
qstcA1f TCGGATGCTGAACGACTGG
qstcA1r CGAGAAATTGCACGCCCTC
qstcA2f CAACACCAAGGGCGGCTATTC
qstcA2r ACGACGCTGCGGAAGACATAG
qstcA3f AGCAGGACCGCCTCGAAAC
qstcA3r CCGCCTCAAGCACGAAGTC
qstcE1f TCGAACTCGACACGCAGGAC
qstcE1r CGCGGACGTAGATGAACAGC
qstcE2f GACCGTCTTCATGCCAGCAC
qstcE2r CCAACCGAACTCCGTCTGC
qYL16sf AAGAACACCAGTGGCGAAGGC
qYL16sr ATCATCGTTTACGGCGTGGACTAC
2 结果与分析 2.1 S. sp. YL-JM2C生长特性研究

R2A液体培养基中30℃、160 r/min培养条件下,通过全自动生长曲线测定仪对菌株YL-JM2C在不同pH、氯化钠和三氯卡班浓度时的生长进行实时监测,得到以下结论:菌株YL-JM2C在中性条件pH为7.0-7.5时生长最优;菌株YL-JM2C耐盐范围在0-2%,在培养基配比1.5%氯化钠条件下菌株生长最优;在以三氯卡班做为底物时,浓度在4-8 mg/L范围内菌株生长情况最好。

R2A培养基中碳源丰富,菌株YL-JM2C可以在其中生长。为了更好地研究菌株YL-JM2C降解三氯卡班的遗传特性,减少培养基中其他碳源的干扰,并为研究降解基因的分子机理和酶学特性奠定基础,进行R2A培养基优化。在加入4 mg/L的三氯卡班条件下优化R2A培养基,降低培养基中其它碳源含量,检测菌株YL-JM2C的生长情况。如图 2所示,通过Logistic生长曲线模型拟合[12],当优化的R2A培养基中仅含有无机盐和0.01%酵母提取物时,30 ℃条件下,菌株YL-JM2C能以终浓度为4 mg/L的三氯卡班为底物生长。图 2中加入三氯卡班的菌株进入对数期的时间较不加入三氯卡班的对数期滞后,分析可能是由于培养基中酵母提取物与三氯卡班碳源的竞争性抑制导致。

图 2 菌株YL-JM2C利用三氯卡班的生长曲线 Figure 2 Growth curve of strain YL-JM2C on triclocarban
2.2 邻苯二酚双加氧酶基因生物信息学分析

利用生物信息学进一步分析S. sp. YL-JM2C中3个潜在的邻苯二酚1, 2-双加氧酶基因stcA1stcA2stcA3及两个潜在的邻苯二酚2, 3-双加氧酶基因stcE1stcE2。StcA1、StcA2和StcA3三者相互间一致性在27%-30%;StcE1和StcE2的蛋白序列一致性为14.6%。从构建的系统发育树结果分析(图 3):StcA1、StcA2和StcA3与已有功能研究的邻苯二酚1, 2-双加氧酶或氯代邻二酚1, 2-双加氧酶亲缘最相近,而StcE1和StcE2与其它邻苯二酚2, 3-双加氧酶建立的发育树自举值在50%以下,亲缘性较远。

图 3 邻苯二酚双加氧酶系统发育树 Figure 3 The phylogenetic tree of catechol dioxygenases

将StcA1、StcA2和StcA3与已研究功能的邻苯二酚1, 2-双加氧酶序列进行一致性比对(表 4),StcA1与来自Delftia acidovoransPseudomonas sp. GT241-1的氯邻苯二酚1, 2-双加氧酶一致性最高,均为61.9%;StcA2与P. knackmussii B13的邻苯二酚1, 2-双加氧酶蛋白序列一致性最高,为51.4%;StcA3与Variovorax sp. WDL1的邻苯二酚1, 2-双加氧酶蛋白序列一致性最高,为63.1%。StcE1和StcE2与已研究过功能的邻苯二酚2, 3-双加氧酶蛋白序列一致性比对(表 5),StcE1与来自Geobacillus genomos sp. 3的邻苯二酚2, 3-双加氧酶蛋白序列一致性最高,为27.4%;而StcE2与来自Beijerinckia sp. strain B1的邻苯二酚2, 3-双加氧酶序列一致性最高,为24.1%。

表 4 邻苯二酚1, 2-双加氧酶序列一致性 Table 4 Identity of catechol 1, 2-dioxygenases (%)
Functional identified catechol dioxygenases Enzymes
StcA1 StcA2 StcA3
TfdC2 [S. sp. TFD44][AAT99373] 58.9 31.7 30.5
Catechol 1, 2-dioxygenase [P. knackmussii B13][CDF83097] 22.3 51.4 28.8
TfdC [S. sp. TFD44][AAT99364] 60.2 32.0 32.7
Catechol 1, 2-dioxygenase [Acinetobacter radioresistens][AAG16896] 38.1 48.7 27.2
Catechol 1, 2-dioxygenase [Achromobacter xylosoxidans A8][CAD56206] 61.1 30.1 34.8
Catechol 1, 2-dioxygenase [A. sp. ADP1][AAC46426] 34.6 50.7 24.7
Catechol 1, 2-dioxygenase [V. sp. WDL1][KWT64073] 45.8 31.5 63.1
Catechol 1, 2-dioxygenase [A. Radioresistens][AAK55425] 36.5 47.9 27.0
Chlorocatechol 1, 2-dioxygenase [P. chlororaphis][CAB52140] 61.5 29.7 34.8
Chlorocatechol 1, 2-dioxygenase [D. acidovorans][AAC35836] 61.9 30.3 35.1
Chlorocatechol 1, 2-dioxygenase [P. nitroreducens][ABL07613] 61.8 30.0 34.8
Chlorocatechol 1, 2-dioxygenase [P. sp. GT241-1][AAR88247] 61.9 30.0 28.7
Catechol 1, 2-dioxygenase [A. radioresistens][2XSR_A] 34.6 51.3 24.7

表 5 邻苯二酚2, 3-双加氧酶序列一致性 Table 5 Identity of catechol 2, 3-dioxygenases (%)
Functional identified catechol dioxygenases Enzymes
StcE1 StcE2
XylE [Sphingobium sp. PNB][AGZ63466] 23.5 23.0
Catechol 2, 3-dioxygenase [Bordetella sp. SCN 67-23][ODS70257] 27.2 22.3
Catechol 2, 3-dioxygenase [G. genomo sp. 3][BAD08308] 27.4 19.6
Catechol 2, 3-dioxygenase [P. putida][AAD05250] 22.7 21.0
Catechol 2, 3-dioxygenase [Planococcus sp. S5][ADV39941] 25.3 20.5
Chlorocatechol 2, 3-dioxygenase [P. veronii][AAP51197] 22.7 21.4
Catechol 2, 3-dioxygenase [Burkholderia sp. JS667][ACO92651] 24.7 20.6
Catechol 2, 3-dioxygenase [B. strain B1][B57264] 23.9 24.1
Catechol 2, 3-dioxygenase [P. sp. PD7][ABR10836] 25.6 20.2
Catechol 2, 3-dioxygenase [P. sp. PD10][ABR10837] 25.6 20.5
Chlorocatechol 2, 3-dioxygenase [P. fluorescens][AAP51203] 22.7 21.7
Chlorocatechol 2, 3-dioxygenase [P. sp. MG61][AAP51201] 22.7 21.4
Catechol 2, 3-dioxygenase [P. sp. Kl28][AAP92388] 22.8 19.7
Catechol 2, 3-dioxygenase [P. sp. M1][ETM68898] 23.7 19.0
Catechol 2, 3-dioxygenase [P. putida Mt-2][1MPY_A] 23.2 22.7
Catechol 2, 3-dioxygenase [A. sp. YAA][BAA23555] 24.9 19.9
Catechol 2, 3-dioxygenase [P. sp. Y-2][BAB18933] 24.4 21.8
Catechol 2, 3-dioxygenase [P. sp. ZJF08][ABF55259] 24.9 22.3

综上所述,初步推测S. sp. YL-JM2C中同时存在3个潜在的有功能的邻苯二酚1, 2-双加氧酶StcA1、StcA2和StcA3以及两个潜在的邻苯二酚2, 3-双加氧酶StcE1和StcE2,而且StcE1和StcE2与已研究报道过的邻苯二酚2, 3-双加氧酶序列一致性差异较大,可能是一类新型的邻苯二酚2, 3-双加氧酶。

2.3 邻苯二酚1, 2-双加氧酶酶学特性研究

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证StcA1、StcA2和StcA3表达和纯化结果,如图 4所示纯化蛋白的条带清晰且蛋白分子量正确。利用分光光度计分别检验纯化蛋白StcA1、StcA2和StcA3的酶活力,如图 5所示。加入底物为邻苯二酚时,275 nm处邻苯二酚吸收峰上升,随后向催化反应中产物顺, 顺-粘糠酸260 nm出峰处偏移,证明邻苯二酚1, 2-双加氧酶催化底物的开环(图 5A)。在加入邻苯二酚衍生物3-氯邻苯二酚(图 5B)和4-氯邻苯二酚(图 5C)后,产物氯代粘糠酸产物峰上升,证明构建的邻苯二酚1, 2-双加氧酶可催化氯代邻苯二酚开环。经过酶活测定证明邻苯二酚1, 2-双加氧酶StcA1、StcA2和StcA3均成功表达,并可催化邻苯二酚及其衍生物氯代邻苯二酚生成顺, 顺-粘糠酸和氯代顺, 顺-粘糠酸的反应。图 5显示的反应是以StcA1催化的,而StcA2和StcA3分别催化的反应与图 5相似。

图 4 纯化蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳 Figure 4 SDS-PAGE of purified proteins

图 5 邻苯二酚1, 2-双加氧酶StcA1催化邻苯二酚(A)、3-氯邻苯二酚(B)和4-氯邻苯二酚开环反应(C) Figure 5 Catechol 1, 2-dioxygenase StcA1 catalyzed the ring cleavages of catechol (A), 3-chlorocatechol (B) and 4-chlorocatechol (C)

酶学动力学参数如表 6所示:StcA1、StcA2和StcA3与邻苯二酚亲和性最好,其Km值分别为以3-氯邻苯二酚或4-氯邻苯二酚为底物时Km值的30%-40%,其中StcA2以邻苯二酚为底物时的Km值最小,底物亲和性最好;以邻苯二酚为底物时StcA1、StcA2和StcA3的催化效率(kcat/Km)高于3-氯邻苯二酚或4-氯邻苯二酚为底物时;以4-氯邻苯二酚为底物时,StcA1、StcA2和StcA3的催化效率又均高于以3-氯邻苯二酚为底物时。以邻苯二酚为底物时,StcA2的催化效率最高,分别是StcA1和StcA3的4.6倍和19.5倍;以3-氯邻苯二酚为底物时,StcA2的催化效率最高,分别是StcA1和StcA3的7.3倍和26.0倍。以4-氯邻苯二酚为底物时,StcA3的催化效率最高,分别是StcA1和StcA2的1.7倍和5.2倍。

表 6 邻苯二酚双加氧酶酶动力学参数 Table 6 Enzymatic kinetics of the catechol dioxygenases
Enzymes Item Substrates
catechol 3-cholorcatechol 4-cholorcatechol
StcA1 Km(mmol/L) 0.035±0.042 0.092±0.059 0.082±0.025
kcat (s-1) 1.422±0.642 0.185±0.042 0.404±0.058
kcat/Km (L/(mmol·s)) 40.207 2.011 4.927
StcA2 Km(mmol/L) 0.022±0.006 0.090±0.097 0.073±0.043
kcat (s-1) 4.081±0.299 1.322±0.800 0.121±0.028
kcat/Km (L/(mmol·s)) 185.455 14.667 1.658
StcA3 Km(mmol/L) 0.039±0.035 0.143±0.067 0.126±0.054
kcat (s-1) 0.375±0.087 0.080±0.022 1.073±0.023
kcat/Km (L/(mmol·s)) 9.615 0.559 8.492
StcE2 Km(mmol/L) 0.404±0.229 - 0.042±0.028
kcat (s-1) 6.160±1.647 - 0.332±0.077
kcat/Km (L/(mmol·s)) 15.248 - 7.905
2.4 邻苯二酚2, 3-双加氧酶酶学特性研究

通过粗酶液酶活检测,仅有StcE1和StcE2具有邻苯二酚2, 3-双加氧酶的功能,StcE3通过多次检测均未检测到产物峰,确认没有邻苯二酚2, 3-双加氧酶的功能。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证StcE1和StcE2表达和纯化结果,如图 4所示纯化蛋白的条带清晰且蛋白分子量正确。通过紫外分光光度计检测纯化的StcE2蛋白的酶活力,如图 6A所示,以邻苯二酚为底物时375 nm吸收峰上升,证明StcE2催化邻苯二酚开环反应生成顺, 顺-粘糠酸半醛(λmax=375 nm),具有邻苯二酚2, 3-双加氧酶活力;以4-氯邻苯二酚为底物时,在380 nm吸收峰上升,证明StcE2催化4-氯邻苯二酚开环反应生成3-氯-粘糠酸半醛(λmax=380 nm),具有4-氯邻苯二酚2, 3-双加氧酶活力(6B);以3-氯邻苯二酚为底物时未检测到酶活。酶动力学参数如表 6所示,以邻苯二酚为底物时StcE2的Km值约为以4-氯邻苯二酚为底物时的10倍,StcE2与4-氯邻苯二酚的亲和性远高于邻苯二酚;但以邻苯二酚为底物时StcE2的催化效率约为以4-氯邻苯二酚为底物时的2倍。StcE1在测定粗酶液酶活时酶活性较低,测得分别以浓度为200μmol/L的邻苯二酚、3-氯邻苯二酚和4-氯邻苯二酚为底物时,比活力分别为3.97×10-4、4.75×10-5和2.35×10-5 U/mg。由于酶活较低无法测量StcE1酶动力学参数。

图 6 邻苯二酚2, 3-双加氧酶StcE2催化邻苯二酚(A)和4-氯邻苯二酚开环反应(B) Figure 6 Catechol 2, 3-dioxygenase StcE2 catalyzed the ring cleavage of catechol (A) and 4-chlorocatechol (B)
2.5 邻苯二酚双加氧酶编码基因的转录研究

S. sp. YL-JM2C降解三氯卡班过程中,其中间开环底物被推断可能为4-氯邻苯二酚[7]。为探究哪一个邻苯二酚双加氧酶参与了4-氯邻苯二酚的开环反应,将上述体外证明具有功能的5个邻苯二酚双加氧酶基因分别进行qPCR,检测在代谢过程中5个基因的转录类型和转录水平。对加入三氯卡班诱导前后5个基因的相对转录表达量利用2-ΔΔCT方法[13]进行分析,如图 7所示。以菌株16s rRNA基因作为内参基因(Control),5个基因经过诱导后无显著变化,相对转录表达均小于1,有下调趋势。由此推测该5个基因可能均是组成型表达,或者虽然该菌株可以降解三氯卡班,但是三氯卡班不是代谢途径的诱导物,从而不能成功诱导5个邻苯二酚双加氧酶基因的转录量增加。

图 7 邻苯二酚双加氧酶编码基因相对转录表达量 Figure 7 The relative expression of catechol dioxygenase genes
3 结论与讨论

本研究在同一菌株中发现5个有功能的邻苯二酚双加氧酶基因stcA1stcA2stcA3stcE1stcE2。通过相关酶学研究证明邻苯二酚1, 2-双加氧酶StcA1、StcA2和StcA3以及邻苯二酚2, 3-双加氧酶StcE1和StcE2均具有催化邻苯二酚和氯邻苯二酚开环反应的功能。StcE3蛋白表达后,通过多次粗酶液酶活检测未检测到产物峰,认为该潜在蛋白不具有邻苯二酚2, 3-双加氧酶功能。

根据目前的国内外研究报道,Ⅰ型邻苯二酚1, 2-双加氧酶几乎不能催化氯代邻苯二酚进行开环反应[14-15],Ⅱ型邻苯二酚1, 2-双加氧酶则可同时催化邻苯二酚和氯代邻苯二酚的开环反应[14-15]。本研究报道的邻苯二酚1, 2-双加氧酶StcA1、StcA2和StcA3均可催化3-氯邻苯二酚和4-氯邻苯二酚开环反应,可认为其均属于Ⅱ型邻苯二酚1, 2-双加氧酶。氯原子所在苯环的位置可影响邻苯二酚1, 2-双加氧酶催化效率和底物亲和性,本研究中StcA1、StcA2和StcA3均与邻苯二酚亲和性高于氯代邻苯二酚;而在催化氯代邻苯二酚开环反应时,三者皆对4-氯邻苯二酚的亲和性和催化效率更高。S.sp.TFD44的氯邻苯二酚1, 2-双加氧酶TfdC和TfdC2[16]以及Pseudomonas chlororaphis的氯邻苯二酚1, 2-双加氧酶TctA[17]同样可催化氯代邻苯二酚开环,其中Pseudomonas chlororaphis的TctA对4-氯邻苯二酚底物结合性较高,而TfdC和TfdC2对3-氯邻苯二酚底物亲和性更高且对氯代邻苯二酚亲和性高于邻苯二酚。除上述的TfdC、TfdC2[16]和TctA[17]外,在Stenotrophomonas maltophilia strain KB2[18]A. sp. Y64[19]均存在邻苯二酚1, 2-双加氧酶可催化邻苯二酚及甲基化邻苯二酚开环反应,在A. sp. DS002中邻苯二酚1, 2-双加氧酶CatA可催化邻苯二酚和4-硝基邻苯二酚开环反应[20],在Achromobacter xylosoxidans A8中邻苯二酚1, 2-双加氧酶MocpA可催化开环4-氯邻苯二酚[21]。然而,目前在同菌株中最多找到两个邻苯二酚1, 2-双加氧酶基因并进行过相关功能验证[16],而在本实验中所用的S.sp. YL-JM2C中存在3个有功能的邻苯二酚1, 2-双加氧酶基因stcA1stcA2stcA3,且3个基因编码的蛋白经过酶学检测证明均可以催化邻苯二酚和氯邻苯二酚的开环反应,在进行粗酶液酶活测定中也检测出三者皆可催化甲基邻苯二酚的开环反应。

本研究中邻苯二酚2, 3-双加氧酶StcE1和StcE2可催化邻苯二酚及其氯代衍生物3-氯邻苯二酚(StcE2无功能)和4-氯邻苯二酚开环反应,在进行粗酶液酶活检测时,StcE1和StcE2同样可催化3-甲基邻苯二酚和4-甲基邻苯二酚。目前关于氯邻苯二酚2, 3-双加氧酶的功能研究鲜有报道,但可催化甲基邻苯二酚开环反应的邻苯二酚2, 3-双加氧酶的研究较多。例如,Pseudomonassp. KL2可催化甲基邻苯二酚开环反应[22];来自Planococcus sp. S5[23]Pseudomonas sp. S-47[24]PseudomonasAW-2[25]的邻苯二酚2, 3-双加氧酶可催化邻苯二酚、4-氯邻苯二酚、3-甲基邻苯二酚和4-甲基邻苯二酚,其底物范围与StcE2相似;来自Pseudomonas putida mt-2[26]Pseudomonas putida GJ31[27]的氯邻苯二酚2, 3-双加氧酶CbzE与StcE1底物范围相似,可催化3-甲基邻苯二酚、4-甲基邻苯二酚、3-氯邻苯二酚和4-氯邻苯二酚开环反应。但通过亲缘性比对,StcE1和StcE2与上述报道的邻苯二酚2, 3-双加氧酶亲缘性非常低,可能属于一类新型邻苯二酚2, 3-双加氧酶。

本研究中S. sp. YL-JM2C降解三氯卡班的过程中,其中间开环底物推测可能是4-氯邻苯二酚[7],但实时定量PCR检测三氯卡班诱导前后5个邻苯二酚双加氧酶基因的转录量均未出现变化,推测该5个基因可能均是组成型表达。在后续研究中会进行深入探究,了解其下游产物4-氯邻苯二酚在三氯卡班代谢过程中是通过邻苯二酚1, 2-双加氧酶催化进行邻位开环反应,还是通过邻苯二酚2, 3-双加氧酶催化的间位开环反应进一步降解,从而初步揭示菌株YL-JM2C降解三氯卡班途径中4-氯邻苯二酚代谢的分子机理,并探索微生物代谢新型污染物的代谢机理及其多样性。

致谢: 感谢中国科学院城市环境研究所于昌平研究员提供S.sp. YL-JM2C并在菌种培养方面提供的帮助。
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