聚-γ-谷氨酸(γ-PGA)，又称纳豆胶、多聚谷氨酸，是由L-或D-谷氨酸通过谷氨酞键连接形成的一种高度带负电荷的谷氨酸均聚物(γ-L-PGA、γ-D-PGA、γ-DL-PGA)。γ-PGA是一种可降解的、水溶性的、对人体无毒的生物高分子，具有可生物降解性、耐热和耐紫外线特性^[1]。因为其特殊的生物学性质，γ-PGA在生产中应用广泛。在农业肥料中添加γ-PGA，可以提高小麦玉米的发芽率^[2]。此外，γ-PGA不仅可增强土壤的持水能力，还可以改变土壤剖面水分的分布形态^[3]。γ-PGA还可应用于新型生物材料制品，作为稳定剂、冷冻保护剂及絮凝剂^[4]。

20世纪初γ-PGA在革兰氏阳性菌Bacillus anthracis荚膜中首次被发现。研究发现其他种类微生物也可产生聚γ-PGA，如B. licheniformis、B. subtilis、B. megaterium和B. halodurans^[5]。不同菌种合成的γ-PGA分子大小和立体化学组成也不尽相同。吴群等发现当培养基中添加Mn²⁺会影响B. subtilis NX-2产γ-PGA的构型比，当Mn²⁺浓度从0到0.09 g/L，γ-D-PGA所占的比例从18%增加到77%，γ-D-PGA升高的原因主要是因为谷氨酸消旋酶的活力提高了0.24 U/mg^[6]。Mn²⁺还可以影响γ-PGA的产量，提高碳源的利用率，延长发酵时间，Cromwick等研究发现在培养基中添加Mn²⁺，γ-PGA的产量增加了12 g/L，但是对于Mn²⁺浓度为什么可以影响产物立体特异性，只是提出了一种理性假设，在Mn²⁺存在下，D-谷氨酸特异性酶具有更高活性，或者可以抑制L-谷氨酸特异性酶^[7]。

不同构型的γ-PGA具有不同的用途。γ-L-PGA具有更佳的生物相容性，高L-型含量的γ-PGA广泛应用于化妆品中。许多药物可以对恶性肿瘤起作用，但由于其水溶性而难以应用，而高D-型含量的γ-PGA不易降解，因此药物的短链与高D-型含量的PGA缀合而成为治疗剂。由于高D-型γ-PGA较为稳定，为了产生适用于人类的高性能粘合剂，已经提出了PGA胶^[6]。因此生产单一构型的γ-PGA (γ-L-PGA或者γ-D-PGA)具有重要意义。研究表明Mn²⁺可以改变B. licheniformis产γ-D-PGA的比例，而此方面的研究鲜有报道。γ-PGA是微生物次级代谢产物，L-谷氨酸或者D-谷氨酸在γ-PGA合成酶的作用下生成γ-PGA。由于γ-PGA合成酶没有构型的区分，因此底物L-或D-谷氨酸的比例决定了γ-PGA中γ-L-PGA或者γ-D-PGA的比例^[8]。

本研究以地衣芽孢杆菌(B. licheniformis) WBL-3为研究对象，以枯草芽孢杆菌(B. subtilis) KH-2作为对照，分析Mn²⁺对L-谷氨酸与D-谷氨酸代谢关键酶、谷氨酸消旋酶(GR，编码基因racE)、D-丙氨酸转氨酶(D-DDT，编码基因dat)和谷氨酰胺合成酶(GS，编码基因gltA)的催化活性与转录水平的影响，探讨Mn²⁺对B. licheniformis WBL-3生成不同比例γ-PGA的机理。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒: Bacillus subtilis KH-2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏登记号为CGMCC No.12426，由中国科学院微生物生理与代谢工程重点实验室(中国科学院微生物研究所)提供。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) WBL-3为本实验室保藏菌株。Escherichia coli DH5α、E. coli BL21(DE3) 购自天根生化科技(北京)有限公司。表达载体pET-28a为本实验室保存。pET-28a-racE、pET-28a-dat、pET-28a-gltA为本研究构建，分别含有来自Bacillus subtilis KH-2、Bacillus licheniformis WBL-3的谷氨酸消旋酶基因、D-丙氨酸转氨酶基因和谷氨酰胺合成酶基因。

1.1.2 培养基及培养条件: B. licheniformis WBL-3和B. subtilis KH-2接种于发酵基础培养基(g/L)^[7]37、200 r/min振荡培养。含有重组质粒的E. coli接种于LB培养基(含40 mg/L卡那霉素)中^[9]，37、200 r/min振荡培养。

1.1.3 主要试剂和仪器: 限制性内切酶、T4连接酶、ExTaq酶、Real-time PCR试剂盒等均购自北京六合通经贸有限公司；RNA反转录试剂盒、基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；质粒小提试剂盒、纯化试剂盒、RNA提取试剂盒购自美国Omega Biotek公司；Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。PCR仪购自北京六合通经贸有限公司；扫胶仪购自上海天能科技有限公司；蛋白脱色摇床购自海门麒麟医用仪器厂；超声破碎仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司；离心机购自湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆和表达: 根据基因组信息设计引物(表 1)，分别以地衣芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌为模板，使用Pfu DNA聚合酶分别扩增得到6个基因。将基因片段经合适的限制性内切酶酶切后连接到表达载体pET-28a上，构建得到重组质粒pET-28a-racE、pET-28a-dat、pET-28a-gltA，重组质粒经双酶切并测序验证正确后分别转化到E. coli BL21(DE3) 中。

分别将含6种重组载体的E. coli BL21(DE3) 以1%接种量接种到LB液体培养基中(含40 mg/L卡那霉素)，37 ℃、200 r/min振荡培养。当OD₆₀₀达到0.6−0.8时，加入终浓度为0.8 mmol/L的IPTG、GR与D-DDT蛋白16 ℃诱导表达过夜，GS蛋白37诱导表达6 h。

1.2.2 重组蛋白的纯化: 由于重组蛋白N端含组氨酸标签His-Tag，因此使用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化。菌体的超声波破碎、层析柱的平衡、可溶性蛋白的上样及杂蛋白的清洗等过程参照试剂盒手册进行。杂蛋白用洗脱液(pH 7.9 Tris-HCl 4 mmol/L，咪唑60 mmol/L，NaCl 0.1 mol/L)进行洗脱，利用pH 7.9 Tris-HCl 4 mmol/L，咪唑300 mmol/L，NaCl 0.1 mol/L进行目的蛋白的洗脱并通过超滤管脱盐、浓缩后于−80 ℃保存。收集各阶段的洗脱液进行SDS-PAGE (13%分离胶，4%浓缩胶)电泳和考马斯亮蓝(R-250) 染色分析^[10]。

1.2.3 体外酶活测定: GR与D-DDT活性测定采用HPLC检测D-谷氨酸的生成，酶活单位(1 U)定义为：在特定条件下，每分钟产生1 μmol D-谷氨酸所需要的酶量。GR具体反应体系(100 μL)为4 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，4 mmol/L L-谷氨酸，酶液适量，测定温度为37 ℃。反应4 min后加入6 mmol/L盐酸终止反应，空白对照中不含L-谷氨酸^[11]。D-DDT具体反应体系(200 μL)为50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，25 mmol/L D-丙氨酸，10 mmol/L α-酮戊二酸，0.05 mmol/L维生素B6，酶液适量，测定温度为37 ℃。反应10 min后加入6 mmol/L盐酸终止反应，空白对照中不含D-丙氨酸^[12]。GS活性测定采用分光光度法^[11]，以盐酸羟胺为底物，利用生成物与Fe离子发生显色反应于540 nm处检测来表征^[13]。具体反应体系(500 μL)为：咪唑盐酸缓冲液(pH 7.0) 25 mmol/L，盐酸羟胺25 mmol/L，ATP 2 mmol/L，10 mmol/L L-谷氨酸，酶液适量，测定温度为37 ℃。反应20 min后，加入1 mL终止缓冲液(5.5% FeCl₃·6H₂O，2%三氯乙酸，0.78%盐酸)，空白对照中不含L-谷氨酸。GS的一个酶活单位(1 U)定义为：在特定条件下，每分钟生成1 μmol/L γ-谷氨酰羟肟酸所需要的酶量。

1.2.4 重组蛋白的动力学参数测定: 在测得以上各酶的最适反应温度和最适pH后，在最适酶活测定条件下，以不同浓度的底物测定酶活，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，计算GR、D-DDT、GS的K_m值、V_max值、k_cat值以及k_cat/K_m值^[14]。

1.2.5 实时荧光定量PCR分析: 提取24 h B. licheniformis WBL-3菌体RNA，电泳检测样品完整性，并在260 nm波长下测定样品浓度。不同浓度RNA样品分别作为模板进行反转录生成cDNA。以16S rRNA基因为内参，用Primer Premier 5.0软件设计B. licheniformis WBL-3中各关键酶编码基因和16S rRNA基因序列的高特异性引物(表 1)。采用SYBR Premix ExTaq (TaKaRa)进行实时定量PCR (RT-PCR)，每个样品做3个平行且保证3个平行的误差在15%之内。

1.2.6 聚-γ-谷氨酸构型方法分析: 发酵结束后，4离心15 min后除去菌体，向上清液中加入4倍体积的冷乙醇，冷藏过夜后离心并倾去上清液，将沉淀重新溶解在去离子水中，透析过夜。将透析后的溶液冷冻干燥，用6 mol/L HCl，105水解10 h，加入6 mol/L NaOH中和，水解物用HPLC检测L-谷氨酸和D-谷氨酸的量来测定其比例。测定条件为：手性柱流动相为2 mmol/L CuSO₄，流速0.5 mL/min，柱温25，进样5 μL，紫外检测器检测，检测波长254 nm^[15]。

2 结果与分析 2.1 不同Mn²⁺浓度下γ-PGA构型变化

在不同Mn²⁺浓度下，B. licheniformis WBL-3产γ-L-PGA和γ-D-PGA的比例见表 2。Mn²⁺浓度为0时，γ-D-PGA仅占22%，当Mn²⁺浓度为0.6 mmol/L时，γ-D-PGA构型所占的比例最高，达到67%，继续提高Mn²⁺浓度，发酵液中γ-D-PGA所占的比例出现降低的趋势。而对比菌株B. subtilis KH-2，在含有不同的Mn²⁺浓度(0、0.6、1.2、1.8和2.4 mmol/L)的发酵液中，γ-D-PGA所占的比例稳定，见表 2。上述结果表明，Mn²⁺对B. licheniformis产D-/L-构型γ-PGA的比例有影响，而不会影响B. subtilis KH-2产不同构型γ-PGA的比例。

2.2 重组蛋白的纯化

鉴于单体L-谷氨酸和D-谷氨酸的比例决定着γ-PGA中D-/L-构型的比例，以L-谷氨酸与D-谷氨酸代谢关键酶——GR (EC5.1.1.3，催化L-谷氨酸与D-谷氨酸之间相互转化)、D-DDT (EC2.6.1.21，催化D-谷氨酸与D-丙氨酸之间相互转化)和GS (EC6.3.1.2，催化L-谷氨酸与L-谷氨酰胺之间相互转化)为研究对象。分别构建重组质粒pET-28a-racE、pET-28a-dat、pET-28a-gltA，经双酶切和测序验证正确后，分别转化到E. coli BL21(DE3) 中进行诱导表达，Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化。纯化后的蛋白利用SDS-PAGE进行检测，得到单一条带(图 1)，其中GR为30 kD，D-DDT为31 kD，GS为49 kD，与预测目的蛋白大小一致。收集纯化的蛋白进行后续的酶学性质研究。

2.3 体外酶活

在各自最适反应条件下分别测定Mn²⁺为0与0.6 mmol/L (0.1 g/L)下的GR、D-DDT和GS的动力学参数，计算其K_m值、V_max值、k_cat值以及k_cat/K_m值(表 3，表 4)。

B. subtilis KH-2中Mn²⁺并未对3种代谢关键酶起到激活作用，而对于B. licheniformis WBL-3 Mn²⁺对GR起到一定的促进作用，其中底物亲和力升高，催化效率(k_cat/K_m值)升高。体外酶学性质研究得出Mn²⁺对GR的催化效率和结合能力都比没有Mn²⁺存在时高。只有在Mn²⁺存在时才检测到GS的活性，由于GS催化L-谷氨酸生成L-谷氨酰胺，而GR催化L-谷氨酸转化生成D-谷氨酸，因此，在Mn²⁺存在下，体系中L-谷氨酸积累减少，而D-谷氨酸积累增加，导致发酵液中γ-D-PGA所占的比例增加。

2.4 谷氨酰胺合成酶体内酶活检测

为了验证GS体内活性，通过HPLC对B. licheniformis WBL-3菌体破碎粗酶液中的GS进行检测^[16]。在未添加Mn²⁺的反应液中未检测到谷氨酰胺的生成，而Mn²⁺存在的反应液中，则检测到0.71 mmol/L的谷氨酰胺生成(图 2)。以上结果与体内酶活实验吻合，进一步说明了B. licheniformis WBL-3菌体内积累的L-谷氨酸浓度降低，使得γ-D-PGA比例增加。

2.5 γ-D-PGA合成相关基因体内转录水平的变化

虽然在体外、体内酶活实验检测到Mn²⁺对B. licheniformis WBL-3中谷氨酸消旋酶与谷氨酰胺合成酶活力具有促进作用，但是Mn²⁺是否在菌体生长过程中对关键酶基因转录起到一定的促进作用呢？进一步测定了Mn²⁺对关键酶编码基因转录水平的影响。通过RT-PCR实验检测了不同Mn²⁺浓度下(0与0.6 mmol/L) B. licheniformis WBL-3在生长对数期谷氨酸代谢关键基因(谷氨酸消旋酶编码基因racE、D-丙氨酸转氨酶编码基因dat和谷氨酰胺合成酶编码基因gltA)的转录水平。实验数据分析采用经典的2^-△△C_T法，结果如图 3所示。在Mn²⁺作用下racE转录水平是无Mn²⁺的2.16倍，dat的转录水平是无Mn²⁺的4.44倍，gltA的转录水平是无Mn²⁺的1.84倍。由此可见，B. licheniformis WBL-3中L-谷氨酸代谢基因和D-谷氨酸合成基因的转录水平在Mn²⁺存在条件下均高于无Mn²⁺，进一步证实了Mn²⁺的存在，使得体系中D-谷氨酸积累增加，导致发酵液中γ-D-PGA所占的比例增加。

3 讨论

γ-PGA的手型构型对抗原抗体特异性研究具有重要意义^[17]。只有B. anthracis合成的γ-PGA由100% D-谷氨酸组成，但是由于该菌具有毒性，并不能进行工业化生产γ-PGA。B. licheniformis WBL-3是一株具有代表性的高产γ-PGA的菌株。本研究分别从基因、转录和蛋白水平对不同Mn²⁺浓度下的不同比例γ-D-PGA和γ-L-PGA进行了比较分析，揭示了B. licheniformis WBL-3产不同比例γ-D-PGA的机理，为γ-D-PGA合成菌株的遗传性改造奠定理论基础。

从L-谷氨酸到D-谷氨酸的转化有两条不同的途径(图 4)，一是由谷氨酸消旋酶参与的直接途径，二是由D-丙氨酸转氨酶参与的间接途径^[2]，Ashiuchi等于1998年在B. subtilis IFO 3336中没有检测到D-丙氨酸转氨酶的活性^[18]，而在B. subtilis NX-2中Mn²⁺使谷氨酸消旋酶的活性提高2倍，从而D-构型的γ-PGA从18%增加到77%^[19]。谷氨酰胺合成酶是催化L-谷氨酸代谢成L-谷氨酰胺^[20]。然而，关于Mn²⁺对地衣芽孢杆菌γ-PGA构型比的研究国内未见报道。

本研究中B. licheniformis WBL-3的3个L、D-谷氨酸代谢关键酶中的谷氨酰胺合成酶只有在Mn²⁺存在下才具有活性，而谷氨酸消旋酶在0.6 mmol/L Mn²⁺条件下的催化活性升高，K_m值减小，说明Mn²⁺对地衣芽孢杆菌中的谷氨酸消旋酶有一定的促进作用。而对于B. subtilis KH-2并未发现在Mn²⁺存在下对关键酶酶活有促进作用。综上所述，Mn²⁺不仅可以促进L-谷氨酸合成L-谷氨酰胺，而且可以提高谷氨酸消旋酶的催化活性，从而γ-L-PGA降低，γ-D-PGA增加。转录水平上的研究也证实，Mn²⁺可以提高B. licheniformis WBL-3中L-谷氨酸代谢基因与D-谷氨酸生产基因的转录水平。这也初步阐明了不同Mn²⁺浓度对地衣芽孢杆菌产不同比例γ-PGA的机理。