浓香型白酒是指以高粱、大米、玉米等粮谷为原料，经固态发酵、蒸馏、陈酿、勾兑而成，具有以己酸乙酯为主体香的白酒^[1]。因其具有“窖香浓郁、绵甜醇厚、香味协调、回味悠长”的风味特征而深受广大消费者喜爱，年销售额约占我国白酒总量的70%^[1]。浓香型白酒风味特征的形成与酒体香味物质密切相关。酒体香味物质以酯类为主，并包括酸、醛、缩醛、酮、酚等，它们的含量和比例是影响酒质的直接原因^[2]。窖池为浓香型白酒生产的特征容器^[3]，窖泥是酒体生香功能微生物的繁殖载体。窖泥微生物协同发酵为酒体香味物质的形成提供反应底物，为浓香型白酒风味特征的形成奠定了基础^[4]。

近年来，得益于分子生物学和微生物学等学科的迅速发展，现代分子生物学技术与传统分离培养技术有机结合，成为了研究窖泥微生物的有力武器。相关研究在窖泥微生物群落结构和功能菌株选育及应用等方面取得了丰富的研究进展，极大提升了对浓香型白酒发酵机理的认识水平。本文结合文献资料和本课题组的研究工作，对相关研究取得的主要进展进行总结，并提出未来研究方向，以期对窖泥微生物研究的深入有所帮助。

1 窖泥微生物群落结构的研究进展

窖泥微生物群落结构是指窖泥所有微生物种类及遗传变异和生态系统的复杂性总称。揭示窖泥微生物群落结构是发掘功能微生物资源的基础。由于酿酒微生态系统的复杂性，加之绝大多数微生物不可培养^[5]，近年的报道主要是基于分子生物学研究手段的免培养技术^[5]，如变性梯度凝胶电泳(Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)^[6-11]、基因文库^[12-16]和Illumina/454测序^[17-21]等对窖泥微生物群落结构展开研究。

1.1 窖泥微生物群落多样性

1.1.1 窖泥细菌群落多样性: 细菌是酿造生产的主要参与者。虽然相关研究采用的窖泥样本和技术方法不同，但所报道的细菌群落结构具有明显相似性。真细菌主要分类于硬壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和互养菌门(Synergistetes)，优势属有梭菌属(Clostridium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、互营单胞菌属(Syntrophomonas)、Sedimentibacter和Petrimonas^{[6-8, 10, 17-18, 21-23]}。古菌主要分类于广古菌门(Euryarchaeota)，优势属为甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷鬃菌属(Methanosaeta)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)和甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)^{[8, 11, 17, 22, 24]}。此外，Liu等^[9]从种水平研究优势类群梭菌属的多样性，表明克氏梭菌(C. kluyveri)、永达尔梭菌(C. ljungdahlii)、C. ragsdalei和C. autoethanogenum为窖泥细菌基本成员，为菌株选育提供了一个方向。

另一方面，通过比较Zheng等^[7]、Ding等^[22]和汤斌等^[12]的报道看出，不同企业窖泥细菌群落结构可能存在显著差异。如泸州老窖窖泥细菌分类为8个科，包括梭菌科(Clostridiaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、互养菌科(Synergistaceae)、鞘氨醇单胞菌科(Sphingomonadaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、Clostridiales Incertae Sedis XI、Lanchnospiraceae和Plannococcaceae^[7]；叙府酒业窖泥细菌归属于5个科，包括乳杆菌科、梭菌科、互养菌科、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)和醋杆菌科(Acetobacteraceae)^[22]；而古井贡酒窖泥细菌仅被精确分类于真杆菌(Eubacterium)、梭菌、乳杆菌和互营单胞菌4个属^[12]。虽然研究方法不同可能造成结果出现偏差，但应注意的是，窖泥微生物群落结构差异可能是造成我国浓香型白酒风味多样化的主要原因。近年来，将酿酒微生物用于培养人工窖泥已成为主要的生产实践^[25]。以上研究提示，系统研究企业间窖泥菌群结构的差异，合理搭配和利用微生物资源是保持产品特色的关键。

1.1.2 窖泥真菌群落多样性: 真菌是窖泥微生物的重要组成部分，具有较高生物量^[26]。但研究显示，窖泥真菌多样性较低，仅分类为威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、白地霉属(Galactomyces)和地霉属(Geotrichum)^{[7, 22]}。研究者认为，这可能是由于真菌多为好氧微生物，窖池厌氧环境不利于其生长所造成^[7]。近期，本课题组利用DGGE和Illumina测序技术研究窖泥ITS基因多样性，发现窖泥真菌分类为111个属并归于子囊菌门(Ascomycota)、接合菌门(Zygomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)，其中大部分优势属与所报道的酒曲真菌群落一致。重要的是，低龄和百年窖泥优势菌群结构存在显著差异，并且百年窖泥的假丝酵母属丰度显著较高(P < 0.05)^[27]。因此，虽然厌氧环境会抑制真菌生长，但酒曲丰富的真菌资源可维持窖泥真菌群落稳定发展。窖泥真菌之间、真菌与细菌之间是否存在相互作用以及由此可能对酒质存在的影响值得进一步研究。

1.2 窖泥微生物群落的演替

窖泥微生物演替是指随窖龄的推移，窖泥微生物群落和生态环境定向有序的发展过程。演替的主要标志是群落在物种组成上发生了改变。生产实践表明，窖泥越老，其发酵白酒的酒质越好。因此，研究窖泥微生物的演替有利于深入认识酿酒微生物发酵机理，揭示“老窖产好酒”的秘密。

2014年，Tao等^[17]利用454测序技术首次系统研究了窖泥细菌在1–50年间的演替。该研究将演替分为3个阶段：起始驯化期(1年)、演替期(1−25年)、成熟期(25年后)。3个阶段均以优势菌群和化学成分的显著变化为特征。结果显示，窖泥pH、NH₄⁺和乳酸的含量是影响细菌演替的主要因素。起始驯化期，窖泥富含乳杆菌属，乳酸的积累形成高酸度环境，使适应性低的菌群被淘汰。演替期，窖泥pH值随乳杆菌的衰亡和NH₄⁺含量的增加而上升，细菌多样性增加，拟杆菌门和螺旋体门(Spirochaetes)大量繁殖；有机酸、H₂和CO₂的含量也有所增加，促进了能促己酸生成的产甲烷菌(Methanogens)的生长。成熟期，细菌群落相对稳定，梭菌属Ⅳ簇、梭菌科和Anaerobrancaceae的丰度提高并与窖泥己酸含量呈显著正相关(P < 0.01)，说明它们对己酸乙酯的生成具有积极作用。随后，Guo等^[19]的研究显示50年后的窖泥细菌群落结构与Tao等^[17]的报道基本一致，但拟杆菌门在50–440年仍大量增长，说明演替是非常漫长的过程。以上研究为解释“老窖产好酒”提供了理论基础，为功能菌株的分离提供了有利线索。此前虽有大量关于不同窖龄窖泥微生物群落结构的比较研究，但受样品规模的限制，绝大多数报道未能提供演替的详细信息。

1.3 窖泥微生物群落结构与窖泥质量的关系

近年来，并购整合、兼并重组已成为白酒行业发展的主旋律。建立科学的窖泥质量评价体系可为企业在征地拆迁、并购重组、窖池抵押参保等过程中对窖池价值的客观评估提供依据。长期以来，窖泥质量主要依靠其感官特征和化学成分进行判定^[28]。近期研究显示，窖泥质量与其菌群结构存在密切联系。Liang等^[10]发现正常窖泥细菌DGGE的多样性和均匀度均高于退化窖泥；qPCR结果显示，正常窖泥放线菌门的丰度也显著较高。Hu等^[20]利用Illumina测序技术对不同质量等级(退化、正常和高质量)窖泥群落及其与环境因子的关系开展系统研究，发现梭菌纲(Clostridia)、拟杆菌纲(Bacteroidia)和产甲烷菌是维持窖泥生态平衡的主要类群，丰度与窖泥质量正相关，较高的pH值、NH₄⁺和有效磷含量利于它们的生长；乳杆菌属、片球菌属(Pediococcus)和链球菌属(Streptococcus)的大量繁殖不利于窖泥生态平衡的保持。以上研究展示了不同菌群和窖泥质量存在的潜在联系，将来若能建立不同质量等级窖泥微生物群落丰度的置信区间，将有利于窖泥质量鉴定体系的完善。另外，Tao等^[17]和Hu等^[20]的研究均显示，优质窖泥以梭菌纲、拟杆菌门和产甲烷菌为优势菌群，近中性酸度和较高水平的NH₄⁺含量利于酿酒有益微生物生长，这对人工窖泥的培养具有指导意义。

2 窖泥微生物分离选育及应用研究进展 2.1 窖泥微生物的分离选育

浓香型白酒香味成分以酯类，尤其是四大酯(己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯)为主。其中，己酸乙酯是主体香，其含量是衡量优质品率的关键指标^[1]。由于酒体酯类物质是在发酵后期由乙醇和酸类经酯化作用生成。所以，根据主要代谢产物与香味成分的关系，窖泥微生物可分为各类产酸菌(己酸、丁酸、乙酸、乳酸等)和酯化菌^[4]。

近期研究分离的纯培养以己酸菌和丁酸菌为主。因以己酸乙酯的前体为主产物，己酸菌被视为最重要的酿酒功能菌。从1964年“茅台试点”至今，有很多关于己酸菌的报道，但几乎均被鉴定为克氏梭菌^[29-30]。因此，以前的研究普遍认为，己酸主要是以乙醇和乙酸为底物，由梭菌属为核心的菌群催化合成^{[1, 30]}。近年研究表明，窖泥己酸菌具有丰富的遗传多样性，集中于芽孢杆菌属、梭菌属和假单胞菌属(Pseudomonas)。高产菌株有C. celerecrescens、克氏梭菌、谲诈梭菌(C. fallax)和巨大芽胞杆菌(B. megaterium)^{[18, 31-34]}。其中C. celerecrescens的己酸产量达5.47 g/L^[32]，与本课题组选育的Bacillus sp. LJ-1相当(GenBank登录号：KJ786449)^[35]，极具应用潜力。代谢途径研究方面，Zhu等^[36]以窖泥为接种物催化乳酸发酵，提出了己酸合成新机制，即乳酸氧化偶联脂肪酸β氧化逆循环，对窖泥微生物发酵机理作出了重要补充。

丁酸是丁酸乙酯的前体，也是己酸合成的中间产物^[1]。近年来，窖泥丁酸菌研究逐渐受到学者们的重视^[37-42]。万朕等^[42]发现将丁酸菌BTL-B02和己酸菌按适当比例混合培养，可使己酸产量提高50%。胡小红等^[39]和Tao等^[40]分别报道了能利用乳酸产丁酸的Clostridium sp. BEY8和Clostridium sp. BPY5。其中Clostridium sp. BEY8能在pH 5.5−6.0条件下，4 d内将66.56 mmol/L乳酸完成转化生成16.63 mmol/L丁酸。此外，以上菌株在低pH条件下出现的乳酸转化抑制均可通过外加乙酸解除。研究者认为，乙酸可能作为电子受体参与乳酸转化丁酸的过程^[39]，提示乙酸菌很可能对此代谢过程具有促进作用。因此，系统研究各类功能菌的协同机理、构建稳定的复合菌系将是提升窖泥微生物应用潜力的有效途径。

2.2 窖泥微生物的应用

研发以己酸菌为核心的窖泥培养菌剂是窖泥微生物应用研究的热点。窖泥培养菌剂是利用微生态学基本原理，将己酸菌在含有糟醅、大曲或窖泥等成分的培养基中富集驯化而制成的复合微生态制剂。将其接种于精心筛选的窖泥原料，可使酿酒有益微生物迅速富集，促进窖泥老熟，提高酒质。此过程称人工窖泥培养^[25]。如本课题组利用百年窖泥己酸菌Bacillus sp. LJ-1开发的窖泥培养菌剂和配套技术，使新窖白酒的己酸乙酯含量提高50%，优质品率提高6个百分点^{[35, 43-45]}。陈翔等^[46]利用洋河老窖己酸菌YH-L001制成复合菌剂，使新窖白酒优质品率达到15.21%，出酒率达35%。此外，吴三多等^[47]、吴亦波等^[48]和熊翔等^[49]学者的研究也取得了良好的效果。除酿酒生产领域，窖泥微生物在化工和农业等领域也具有广泛的应用前景。例如，己酸是生物燃料的合成前体，可作为新兴能源物质。Zhu等^[36]以窖泥微生物组催化乳酸实现了己酸的高效合成，积累浓度超23 g/L，合成率达2.97 g/(L•d)，极具工业应用潜力。此外，钟正丹等^[50]分离的乳酸菌具有较高的细菌素产率，能显著抑制致病微生物的生长，为生防制剂的开发奠定了基础。

3 窖泥微生物研究方向

进入21世纪，白酒产业经历了被誉为“黄金十年”的高速发展期。在此期间，窖泥微生物研究经历了学科的快速融合与生产实践的检验，取得了显著成绩。探讨已有成果及存在问题，明确未来研究方向对于指导我国酿酒微生物的研究和利用具有重要意义。

3.1 系统开展窖泥微生物群落结构的差异化研究

研究显示，窖泥微生物具有丰富的遗传多样性，其群落结构可能因地域、企业、窖龄和质量等不同而存在差异。但由于相关研究大多缺乏窖泥样本的生物学重复，且采用的研究方法不同，本文难以总结出微生物群落差异的具体细节及形成机理。窖泥样本的采集常受客观因素影响。以高龄窖池为例，四川省50年以上窖池仅占窖池总量的5%−10%，且集中于大型名优企业，部分百年窖池如“1573国宝窖池”还被列入国家级重点文物保护单位。此外，大规模采集窖泥样本是否会影响正常生产也是企业管理者担忧的问题。

然而，酿造工艺的技术创新需要行业参与者共同为之努力。为提高行业整体研究水平，使之成为高端生物技术产业。将来可由政府或名优酒企牵头，组织实施以全面解析基因及其功能多样性为目标的酿酒微生物基因组计划。该计划可针对我国各地具有代表性的名优酒企进行统一采样，系统分析，建立窖泥微生物基因库。通过比较群落的基因组，揭示不同来源窖泥微生物群落的差异及其形成机理。这有利于阐明窖泥微生物与窖泥质量及酿造酒质间的关系，为人工窖泥配方的优化改良、窖泥质量鉴定体系的完善提供依据，这也是进一步开发窖泥微生物资源的重要途径。

3.2 进一步发掘窖泥微生物资源，提升功能微生物的应用潜力

近年研究报道了许多窖泥微生物新种^{[37, 51-53]}。分子生物学研究进一步揭示，窖泥存在大量未培养的微生物(Uncultured microorganisms)^{[17, 22]}，为开发新的生物资源奠定了基础。因此，不断分离高效功能菌是今后研究的重要方向。提高功能菌株分离效率的关键是尽量将培养条件模拟为自然状态，并特异添加生长必需的营养成分，前提是对菌株特性有所了解^[54]。随着生物信息学的发展，研究者可利用分子生物学技术获得窖泥微生物群落的基因序列，再通过比较基因组学的方法鉴定基因，得到微生物遗传发育和生理功能等信息，为准确设计培养条件提供基础。王保军等^[55]综述了近年出现的一些新颖独特的环境微生物培养技术和方法，为开发窖泥微生物资源提供了重要的参考资料。此外，改进选育方法构建或改良高效功能菌也是提升窖泥微生物应用前景的有效途径。近年来，我国学者在酿酒微生物诱变选育和基因改良方面取得了一定进展^[56-58]。如熊俐等^[56]通过紫外诱变使己酸菌GS₅的己酸产量提高12%。Chen等^[57]利用基因敲除技术构建酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，该菌在液态和固态发酵中的己酸乙酯产量分别提高2.97和2.80倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯含量明显增加。

值得提出的是，分离选育是获得高效功能菌的主要手段，全面研究菌株代谢产物及其功效则是保证其科学应用的重要前提。研究揭示，菌株代谢产物对酿造生产的影响可能具有两面性。刘博等^[21]发现，除能产生酯类等酒体香味物质，氨基戊酸梭菌(C. aminovalericum)、突那梭菌(C. ultunense)和C. purinilyticum的代谢产物4-甲基苯酚很可能导致窖泥发臭。这也提示选育改良应对菌株各种功效有所兼顾，全局优化。

3.3 深入研究窖泥培养菌剂的作用机理，实现品质控制

目前，窖泥培养菌剂研究大多取得了良好的应用效果，但存在的普遍问题是缺乏对其作用机理的系统研究，对应用效果的解释仅限于概念性阐述。由于缺少强有力的理论证据支持菌剂质量鉴定标准的制定，常导致实际生产对培养原料的选用具有随机性。如在规模化生产中，很可能因为优质老窖泥不足而采用低龄窖泥作替代，为菌剂功效带来不确定性，严重阻碍产业化推广。长期以来，国内外复合菌剂研发面临相同的难点，即菌株在单独和混合培养条件下的各项参数最佳值均存在较大差异，并且在混合菌系中，微生物群落结构及相互作用易受环境因素影响，从而导致产品功效不稳定^[59]。相对而言，要实现窖泥培养菌剂的品质控制更为困难。除己酸菌外，菌剂配方还包括老窖泥、酒糟和曲药，此三者本就是庞大的酿酒微生物区系，其中还蕴藏很多未被发掘、未知功能的微生物。此外，不同来源窖泥、酒糟^[60]和曲药^[61]的微生物群落结构均存在差异，为菌剂功效的稳定性带来诸多不确定因素。

为构建高效、稳定的窖泥培养菌剂，将来应加强探索其作用机理，关键是明确维持菌剂生态平衡和功能效应的主要菌群。由于菌剂微生物主要源于原料，所以，品质控制的根本是制定原料质量的鉴定标准。因此，将来可首先从基因组和代谢组两个方面研究己酸菌、窖泥、酒糟和曲药等原料对菌剂菌群结构和代谢产物的影响，揭示出质量控制的关键指标，为进一步优化原料配方奠定基础。