2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 赵腊梅, 孙惠芳, 刘正杰, 林春, 毛自朝
- ZHAO La-Mei, SUN Hui-Fang, LIU Zheng-Jie, LIN Chun, MAO Zi-Chao
- c-di-GMP对细菌胞外多糖合成与运输的调控
- Regulation in EPS biosynthesis and transportation by cyclic diguanylate
- 微生物学通报, 2017, 44(5): 1196-1205
- Microbiology China, 2017, 44(5): 1196-1205
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160258
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文章历史
- 收稿日期: 2016-03-29
- 接受日期: 2016-05-16
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2017-02-24
2. 云南农业大学特色资源植物改良与利用研究所 云南 昆明 650201
2. Institute of the Improvement and Utilization of Characteristic Resource Plants, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201, China
环二鸟苷酸(Cyclic diguanylate，c-di-GMP)的发现已有29年，最初是因变构激活细菌纤维素合成而被发现，目前已确定c-di-GMP参与调控包括细菌生物膜的合成与降解、运动、毒性、细胞周期、分化、变异、细胞通讯等多种生命活动和代谢，是重要的细菌第二信使。c-di-GMP由二鸟苷酸环化酶(Diguanylate cyclase，DGC)合成，并被特异性磷酸二酯酶(Phosphodiesterase，PDE)降解。c-di-GMP的信号传导主要由其效应分子核糖开关(Riboswitch)或/和受体分子(Receptor)所介导。c-di-GMP调节生物膜的合成、细胞运动、致病菌的毒性等主要是通过调控胞外多糖的合成与运输来实现的。细菌胞外多糖种类繁多，已广泛应用于医药、食品、工业等多个领域，目前其合成机制的研究备受关注。研究确定胞外多糖的合成与运输途径分为：(1) Wzx/Wzy依赖途径；(2) ATP结合盒(ABC)转运体依赖途径；(3) 合成酶依赖途径；(4) 胞外单蔗糖酶合成依赖途径[1-2]，其中合成酶依赖途径的多种多糖的合成受c-di-GMP的调控。本文综述了c-di-GMP最新的研究进展，并结合我们对农杆菌(Agrobacterium sp.) ATCC31749中c-di-GMP调控EPS可德胶合成研究的基础上，重点论述c-di-GMP对纤维素、藻酸盐、PNAG和可德胶等胞外多糖合成与运输的调控。
1 c-di-GMP概述c-di-GMP是普遍存在且十分重要的细菌第二信使，它是细菌纤维素研究的副产物。Aschner等在1946年开始研究细菌和动物纤维素的合成过程中发现，木醋杆菌(目前被定名为木葡糖酸醋杆菌，Gluconacetobacter xylinus)的静息细胞能够合成纤维素[3-4]。1985年Ross等发现一个含鸟苷酸的寡核苷酸分子调控木葡糖酸醋杆菌中纤维素的合成[5]，进一步研究确定该化合物由鸟嘌呤、核糖和磷酸以1׃1׃1的比例形成[6]，随后(1987年)通过质谱、核磁共振及体外化学合成等手段确认了该纤维素合酶活化剂为双(3′, 5′)-环状鸟苷酸[7]。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中也发现了对纤维素的合成有明显激活作用的c-di-GMP的存在[8]，说明c-di-GMP并非木葡糖酸醋杆菌特有，应具有广泛的种间分布[9]。c-di-GMP以四方形的形式形成二聚体，类似于双螺旋DNA的方式嵌入到受体分子进行信号传导[10]。细胞内c-di-GMP浓度主要由含GGDEF(或GGEEF)(Gly-Gly-Asp/Glu-Glu-Phe)结构域的二鸟苷酸环化酶(DGC)合成，并由含EAL (Glu-Ala-Leu)或HD-GYP(His-Asp-Gly-Tyr-Pro)结构域的特异性磷酸二酯酶(PDE)降解。c-di-GMP的信号传导由核糖开关(Riboswich)和受体分子(Receptor)介导，最终通过激活或抑制基因表达，或(和)是激活或抑制酶活性来完成信号传导。
2 c-di-GMP合成酶、降解酶的晶体结构 2.1 DGC结构目前已有11个细菌物种中的27个DGC或类似蛋白的三级结构被测定[11-12]，在DGC的羧基末端一般含有GGDEF/GGEEF的c-di-GMP合成结构域，氨基末端(N端)含有跨膜及信号传导的结构域。DGC的羧基末端(C端)由5个α螺旋和7个β折叠组成，底物GTP和Mg2+分别被活性中心的残基所结合，其中鸟苷酸的碱基多被活性中心Asp和Asn残基通过氢键结合，而Mg2+分别与GTP的磷酸基团和活性中心GGDEF中的Glu及临近的Asp通过离子键相连。PleD是第一个被确定的DGC，参与新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)细胞周期调控，调节细胞游离运动与附着聚集两状态间相互转化[13]。PleD晶体结构研究发现，其C末端由5个α螺旋和7个β短链组成：α1-β1-α2-α3-β2-β3-α4-β4-β5-β6-α5-β7，GGDEF以β折叠的形式存在于β2和β3之间，两个DGC C末端的GGDEF反向平行排列，各结合一个GTP分子，存在镁离子的条件下进行缩合催化形成c-di-GMP[14]。在DGC的N端多含有PAS [因在昼夜周期蛋白(Per)，芳基烃受体核转运蛋白(Arnt)和E类螺旋-环-螺旋蛋白(Sim1) 中均含保守结构域而命名]，GAF [因在cGMP特异性磷酸二酯酶(cGMP-specific phosphodiesterase)/腺苷酸环化酶(Adenylate cyclases)/甲酸氢裂合酶转录激活因子(Formate hydrogen lyase transcriptional activator)中含保守结构域得名]，REC [信号接收结构域(Receiver domain)]等结构域，可通过感应胞外或胞间信号，进行二聚化以调节DGC的活性。例如，测定新月柄杆菌CheY[15-16]晶体结构后发现，CheY合成c-di-GMP受到严格的调控，首先其N末端的结构域通过感应胞外信号，变构激活其组氨酸激酶活性，致使CheY的N末端REC结构域中Asp53 (第53位Asp残基)磷酸化，改变多肽的构象，进而使分别与1分子GTP和Mg2+结合的C端催化结构域二聚化，催化2分子的GTP缩合而形成c-di-GMP。在c-di-GMP的合成过程中，产物c-di-GMP还可通过结合到DGC的RXXD (其中X为任意氨基酸)结构域而变构抑制DGC的活性。
2.2 PDE的结构含EAL结构域的PDE催化水解c-di-GMP为线性的二聚鸟苷酸(pGpG)，而含HD-GYP结构域的PDE则是将c-di-GMP直接降解为2分子GMP。EAL型PDE的高级结构，先后在脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)等菌株中被测定[14, 17-19]。脱氮硫杆菌TBD1265和肺炎克雷伯菌BlrP被结晶后，X衍射发现，这些蛋白均以反平行的方式形成二聚体，EAL结构域由3个螺旋所连接，连接界面均由保守的氨基酸组成。最近Bellini等[20]通过嗜热菌(Persephonella marina)中PmGH (HY-GYP型PDE)的晶体结构研究发现，HD-GYP型PDE以头对头的二聚体形式排列，每个单体通过N端GAF结构域相互作用，而使含HD-GYP的C端二聚化，c-di-GMP以‘U’形(顺式)的形式接近并结合到PmGH的活性中心而被水解，不同于TBD1265和BlrP等EAL型酶，c-di-GMP是以伸展的分子构象进入活性中心被水解的[21]。
3 c-di-GMP的效应分子c-di-GMP在细菌生物体内主要通过两类效应分子发挥作用，一类是效应蛋白，一类是核糖开关。前者作为蛋白质，与c-di-GMP专一性结合后可调控基因表达或激活酶活性；后者是mRNA 5′非编码区(5′Untranslational region，5′UTR)的特定保守序列折叠成一定的RNA二级结构，能专一性与c-di-GMP结合并影响蛋白质翻译。
3.1 受体的种类 3.1.1 PilZ结构域效应蛋白: 目前有越来越多的c-di-GMP的效应蛋白被发现，最主要的还是PilZ结构域蛋白[22]。2006年，Amikam和Galperin[23]预测并确定细菌纤维素合成酶催化亚基(BcsA)下游100个氨基酸形成独立的蛋白结构域，专一性地与c-di-GMP结合，该结构为已知的PilZ结构域，这是第一个预测并随后被实验证实了的c-di-GMP受体蛋白。含PilZ结构域蛋白的分布非常广泛，大肠杆菌(Escherichia coli)中的YcgR[24]，纯化后具有与木葡糖酸醋杆菌的BcsA一样高效结合c-di-GMP的PilZ结构域。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium) UMR1菌株中，YcgR通过PilZ与c-di-GMP结合调控细菌的运动能力。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中含PilZ结构域蛋白AlgA，与c-di-GMP结合后调节胞外藻酸盐的合成[25]。多种细菌基因组分析表明，不同物种均含有较多的c-di-GMP合成与降解酶类，但含PilZ的受体分子数量变化较大且具有物种特异性。如在大肠杆菌中有29个GGDEF/EAL结构域蛋白，却只有2个PilZ结构域蛋白[23]，而蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)中只有12个GGDEF/EAL/HD-GYP结构域，却有着15个PilZ结构域蛋白[26]。 3.1.2 与c-di-GMP合成与降解酶类结构相似的受体分子: 这类受体含有与GGDEF、EAL或HD-GYP类似的结构域，不具有c-di-GMP合成或者降解的活性，但能够与c-di-GMP专一结合，进行信号传导。例如铜绿假单胞菌中发现的内膜蛋白PelD，具有保守基序RXXD[27]，通过与c-di-GMP结合后调控Pel多糖的合成[28]。荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中含GGDEF和EAL结构域的c-di-GMP受体分子(LapD)，c-di-GMP能够高效应地结合到其退化的EAL结构域，激活LapG的蛋白酶活性，促进细菌生物膜中胞外蛋白的合成与分泌[29]。目前认为这类受体蛋白可能来源于c-di-GMP代谢酶类，但在进化过程中因编码活性中心碱基的突变，导致催化功能丢失的同时，产生作为受体分子的新功能[17]。 3.1.3 c-di-GMP结合型DNA结合蛋白或转录因子: 铜绿假单胞菌中鞭毛合成基因受c-di-GMP的调控。激活鞭毛合成基因表达的FleQ蛋白，能与c-di-GMP专一性结合，但不具有之前所述c-di-GMP结合结构域的氨基酸保守基序[30]，FleQ的C末端为DNA结合结构域，激活鞭毛蛋白的表达，并以c-di-GMP依赖的方式调控Pel多糖的合成。c-di-GMP结合FleQ则抑制它与pel启动子的结合，导致pel操纵子受FleQ转录抑制的效应被解除，从而负调控胞外多糖Pel的产生[31]。FleQ的N端为典型REC结构域[FleQ(REC)]，是FleQ功能所必需的。FleQ的晶体结构发现FleQ(REC)与氮信号传导蛋白NtrC的REC结构不同，以一种不寻常的方式介导FleQ蛋白形成二聚体来调控基因的表达。霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中c-di-GMP的水平升高抑制应激反应调节子RopS的表达，能与c-di-GMP结合的霍乱弧菌的胞外多糖调节子VpsR和VpsT的敲除突变能够消除这种抑制，VpsT能与rpoS启动子结合是通过c-di-GMP依赖的方式来介导的。研究发现，VpsT与c-di-GMP结合，促使VpsT结合rpoS的转录起始位点，使rpoS转录沉默，促使细菌进入生物膜形成的状态[32]。研究表明c-di-GMP可以形成二聚体、四聚体、八聚体等形式发挥功能[33]，最近研究显示c-di-GMP组装成四聚体的形式介导转录因子BldD[34]的二聚体化，激活其DNA结合活性，抑制孢子发育相关基因的表达，控制链霉菌(Streptomyces)中细胞的分化。 3.2 核糖开关核糖开关(Riboswitches)是mRNA 5′非翻译区(5′UTR)序列折叠成一定的构象，这些构象的改变应答于体内的信号分子，从而通过这些构象的改变达到调节mRNA的稳定性并调控翻译的目的。Tamayo等[35]首先提出核糖开关参与c-di-GMP的信号传导。Sudarsan研究小组[36]发现c-di-GMP能专一性结合一类特殊的核糖开关GEMM (Genes related to the environment，membranes and motility)，调控蛋白质的翻译。c-di-GMP与核糖开关GEMM的结合是不对称的，c-di-GMP中的一个鸟苷酸Gα以Hoogsteen碱基配对方式与GEMM配对，另一个Gβ则是以Watson-Crick碱基对的方式与GEMM的92位高度保守的碱基Cys结合的[37]。研究发现，除c-di-GMP结合位置的突变外，GEMM中多个保守碱基突变后，均保留c-di-GMP的亲和力及翻译调控活性，这表明核糖开关在碱基突变上有很大的弹性和耐受性，这也是c-di-GMP核糖开关多样性产生的基础[38]。目前多种核糖开关在霍乱弧菌和铜绿假单胞菌等多种细菌中被发现，因这些核糖开关能感应c-di-GMP的浓度而促进蛋白的合成，目前已构建含这些核糖开关调控报告基因(如GFP)表达的载体，用于活体测定c-di-GMP浓度变化。
4 细菌中c-di-GMP的浓度调控细胞体内的c-di-GMP浓度变化是细胞生理代谢改变的基础，而胞内c-di-GMP浓度是怎样调控的呢？铜绿假单胞菌中转录调控因子AlgR通过直接结合DGCmucR的基因启动子促进mucR的表达，增加细胞内c-di-GMP的水平[39]。铜绿假单胞菌PAO1中的YfiBNR[40]三元信号系统，能响应细胞外信号刺激来调节胞内c-di-GMP水平，具体是膜间隙蛋白YfiR与YfiN(DGC)结合抑制了c-di-GMP的合成能力，晶体结构研究表明，PAO1菌株中含信号感应结构域的外膜脂蛋白YfiB，通过感应环境信号，使YfiB构象改变，能优先与YfiR结合，并将其束缚于外膜内侧，解除了YfiR与YfiN的结合，以分子开关的机制解除YfiN (DGC)的抑制，启动c-di-GMP合成活性来增加胞内c-di-GMP的水平。YfiBNR系统的同源序列分布广泛，在大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和荧光假单胞菌SBW25中分别通过类似的机制调控c-di-GMP的合成来调节细菌细胞运动，纤维素合成及3型菌毛的合成与分泌。多数c-di-GMP的合成酶与降解酶均具有PAS、GAF、REC等结构域，在c-di-GMP的合成和降解过程中均可通过这些结构域感应并传导胞间环境信号，并最终通过激活或抑制DGC和PDE的活性从而来控制胞内c-di-GMP的含量；另外DGC中往往具有能与c-di-GMP结合，引发构象变化的RXXD结构域，c-di-GMP与该结构域结合后，能反馈抑制DGC的活性。细菌通过上述不同层次的调控来实现菌株感应胞内和(或)胞间环境的变化而精细调控c-di-GMP的水平。
5 c-di-GMP对EPS合成调控c-di-GMP参与调节细菌生命中生物膜的合成、运动、毒性、细胞周期、分化、变异、细胞通讯等多个活动，最为清楚的是c-di-GMP促进细菌生物膜的合成[41-42]。细菌生物膜的形成是细菌细胞响应逆境并产生适应和抗性的结果，其本质是在逆境下使游动、微弱而单一的细菌，形成固定、强大而联合的细胞聚集体来共同抵御逆境的胁迫。根癌农杆菌附着并侵染植物细胞的过程中，细胞产生纤维素等生物膜成分，能较好地附着于宿主并抵抗宿主细胞的防御性攻击。同样动物病原菌生物膜形成后，使菌株致病能力提高，增强了菌株抵御宿主的免疫进攻的同时，也降低了抗生素和生物试剂毒害的作用而产生耐药性。苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)通过生物膜的形成来实现与宿主细胞之间的一个动态平衡并开启固氮功能。大多数固氮菌通过刺激其自身和周围宿主细胞进行大量的呼吸代谢来消耗氧，并通过胞外多糖的粘性使细胞聚集而形成生物膜，以形成封闭的环境，从而达到固氮所需的低氧的条件。综上所述，c-di-GMP在调节固氮、侵染能力、抗生素抗性、细菌与宿主相互作用等方面发挥重要作用。这些作用的发挥与c-di-GMP参与调节细菌多糖的合成与转运是密不可分的。细菌多糖按细胞存储部位，大致可分为胞外多糖(EPS)和荚膜多糖(CPS)，其途径有4种(见前述)，其中研究较多且较为清楚的是Wzx/Wzy依赖和合成酶依赖的合成途径。目前认为c-di-GMP主要调控合成酶依赖途径，该途径中多糖链的合成与运输在多数情况下不是由单亚基合成酶来执行的，而是由具有跨膜结构域的蛋白亚基聚合成多亚基合成复合物来完成，这种由多亚基酶催化合成与运输且研究较多清楚的胞外多糖主要包括藻酸盐、纤维素和可德胶等[43-44]。
5.1 纤维素合成的调控纤维素是世界上最丰富的有机物，不仅是细菌生物膜的重要组成部分，也是植物、真菌、部分动物细胞壁的组成部分。合成纤维素的细菌分布相当广泛[45-46]。细菌纤维素合成酶，在二价阳离子(如Mg2+)存在的条件下，通过反复催化并延伸以β-1, 4-糖苷键连接的葡聚糖分子而形成。首先合成复合物中糖基转移酶(GT)的胞内PilZ结构域与c-di-GMP结合而被变构激活，促进该亚基内膜内侧催化结构域与供体[尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)]，Mg2+和受体(含非还原端4′羟基的β-1，4-葡聚糖)结合；进而UDPG被转移到活性中心结合受体非还原端4′羟基的附近；最后葡萄糖基从UDPG中转移出来，与受体非还原端4′羟基相连接而延长了聚合物；细长的聚合物被转移到跨膜(TM)通道中，使得新添加的葡萄糖残基单元重新占据受体位点；之后UDP被UDPG替换，为新一轮聚合物的延伸做准备。通过上述反复催化的方式，最终合成纤维素单链分子。细菌纤维素合酶复合物至少包含内膜蛋白BcsA和BcsB，以及外膜蛋白BcsC。BcsA与C端定位于膜间隙，N端锚定于内膜上的BcsB亚基形成复合物，完成纤维素合成和内膜转运。BcsA包含8个TM螺旋，胞质GT的催化结构域在第4和第5跨膜(TM)螺旋之间。供体(UDPG)和受体(含4′-OH非还原受体纤维素)的结合，聚合物合成和细长纤维素聚合物的易位，跨膜运输通道的形成均由BcsA-B复合体来完成。BcsA胞内延伸的C末端具有含“RXXRDXSXXG”基序的PilZ结构域(其中X为任意氨基酸)，与c-di-GMP结合而激活催化活性。光合细菌球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)中BcsA-BcsB复合体晶体结构研究揭示，不存在c-di-GMP时，BcsA无催化活性，阻碍底物结合到活性部位；当与c-di-GMP结合后，酶被变构激活，可使底物结合到活性位点，成为激活状态的纤维素合酶复合体[47-48]。目前纤维素在革兰氏阴性菌中合成的外膜运输机制仍不清楚，推测BcsC等蛋白参与这个过程。
5.2 藻酸盐合成的调控藻酸盐是β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)通过β-(1→4) 糖苷键连接组成的EPS。这些M、G单体可以以连续的甘露糖醛酸(MM)、古洛糖醛酸(GG)，或是二者交替(MG)形成共聚物。藻酸盐主要由褐藻，假单胞菌(Pseudomonas)和固氮菌(Azotobacter)等生物合成。藻酸盐的生物合成调控网络是高度复杂的，包括转录、转录后和翻译后的调控[48]。其中藻酸盐的翻译后调控主要是由c-di-GMP结合到Alg44的PilZ结构域而激活酶的活性。Alg44是藻酸盐合成与运输复合物必不可少的核心组分。Alg44蛋白是一个多结构域蛋白，包括C端定位于细胞质内与c-di-GMP结合的PilZ结构域、跨膜结构域(TM)和N端定位于膜间隙，与多药运输蛋白(Multidrug transporter)结构相似的结构域所组成[49]。Alg44调控藻酸盐合成的翻译后调节机制与纤维素合成复合酶中BscA蛋白类似，c-di-GMP结合Alg44的PilZ结构域，使得构象发生改变，使糖核苷酸(合成供体)更靠近相应的糖基转移酶(Alg8) 的活性部位[47]。Alg44的C-末端PilZ序列的缺失会使突变株丧失藻酸盐的合成能力[49]，这表明c-di-GMP结合Alg44的胞质PilZ结构域，可通过由内向外的信号传导机制，通过Alg44的膜间隙结构域来激活藻酸盐的聚合反应是重要的调控途径[50-51]。
5.3 多聚氮乙酰葡萄糖胺(PNAG)合成的调控PNAG是细菌细胞壁基质和生物膜广泛存在的一种胞外多糖。在鼠疫杆菌(Yersinia pestis)、大肠杆菌和黑胫病菌(Pectobacterium atrosepticum)中，PNAG的生物合成是由c-di-GMP激活的[51-53]。大肠杆菌中PNAG的合成和分泌是由pgaABCD操纵子编码的蛋白来合成的。PgaA和PgaB负责PNAG胞外运输，PgaC和PgaD是多糖聚合与延伸所必需的。在乙酰化的藻酸盐和纤维素等聚合物的合成中，它们首先各自合成酶将非乙酰化的前体进行聚合，随后在周质中进行O-乙酰化修饰，而PNAG则是以UDP-N-乙酰葡糖胺为直接供体来合成的。PgaB是预测的外膜脂蛋白，在PNAG的导出过程中对3% PNAG残基进行去乙酰化[54]，形成成熟的PNAG。外膜孔蛋白PgaA能够转运局部去乙酰基(成熟的)的PNAG到细胞表面。PgaC属于GT-2家族，位于内细胞膜，能够将活化的UDP-GlcNAc合成聚GlcNAc。PgaC的催化结构域存在于细胞质，它与PgaD，一种N末端有两跨膜螺旋的小蛋白，聚合形成具有多糖合成(GT活性)与内膜转运活性(运输功能)的二聚体。在大肠杆菌中两个DGCs，YcdT和YdeH均是PNAG合成所必需的，CsrA抑制二者的表达，删除csrA，PNAG依赖的生物膜形成增加[55]。最近有新的报道指出c-di-GMP变构激活PgaCD复合体(GT)的活性[56]，具体是c-di-GMP具有分子胶功能，介导其相互作用，使PgaC和PgaD粘合，形成有GT和多糖内膜转运活性的二聚体，从而在翻译后水平调控PNAG的合成。
5.4 (1→3)(1→4)β-D-葡聚糖合成的调控在苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)中发现的一种新型线性混合连接的(1→3)(1→4)β-D-葡聚糖[57](Mixed-linkage β-D-glucan，ML β-D-葡聚糖)，该聚合物可以被特异性的地衣多糖酶水解，产生一个二糖(→4)-β-D-Glcp-(1→3)-β-D-Glcp-(1→)重复单元。研究发现，在苜蓿中华根瘤菌细胞内没有纤维素合成酶操纵子的前提下，过表达PleD (DGC)，增加了混合连接的β-D-葡聚糖的合成，说明c-di-GMP促进ML β-D-葡聚糖的合成。该混合多糖由含2基因的操纵子(bgsBA)控制合成。c-di-GMP主要是结合到BgsA(GT) C端与PilZ没有同源性的结构域，变构激活BgsA-B复合物合成ML β-D-葡聚糖，目前推测BgsB可能参与该多糖的运输。
5.5 可德胶合成的调控β-(1→3)-葡聚糖主要存在植物[58]和真菌[59]的细胞壁中，是部分细菌生物膜的主要多糖成分并被广泛应用于医药与食品等领域[60]。生产可德胶的模式菌株Agrobacterium sp. ATCC31749基因组已经被测序，且拥有较多的转录组和蛋白组的信息[61-63]。Agrobacterium sp. ATCC31749基因组中4个基因(crdA、crdS、crdC和crdR)是可德胶合成与调控的重要基因。生化分析表明CrdS是合成酶催化亚基，其催化结构域位于细胞质，N端位于内、外膜间隙，具7个跨膜结构(TM)，C端位于细胞质的内膜蛋白，大肠杆菌中表达CrdS的胞质催化结构域(CmcrdS)形成包涵体，经重新折叠后的CmcrdS未检测到可德胶合成活性[64]，将CrdS在小麦胚无细胞体系统中表达并纯化后，体外与大肠杆菌中分离的膜成分或酯质体(Liposome)组装形成含CrdS的纳米盘(Nano disc)后，检测到可德胶合成的催化活性[65]，说明跨膜结构是其催化活性所必需的，且CrdS能够独立完成可德胶的合成。我们确证CrdR[44]是可德胶合成操纵子的正调控转录因子，其潜在的DNA结合区域位于CrdA起始密码子上游-98 bp片段内。Ruffing等[61]对ATCC31749中可德胶合成基因的研究发现GGDEF蛋白AGRO_3967的基因在可德胶合成期上调表达(5.7倍)，该基因敲除导致可德胶产量下降57%。我们在ATCC31749中表达来源于大肠杆菌的yddV (DGC)后，c-di-GMP含量增加，可德胶产量提高，表达大肠杆菌yhjH (PDE)后c-di-GMP含量下降，但可德胶的产量没有明显差异[66]。进一步进行RNA测序分析菌株生长(无可德胶合成)与可德胶发酵阶段的差异表达基因，发现与CrdA、CrdS、CrdC一起上调表达基因中，有多种为c-di-GMP合成酶基因，预示可德胶合成与运输受c-di-GMP的调控。
目前ATCC31749可德胶的合成操纵子编码的CrdA与CrdC功能均未知，结构预测，发现在CrdA的N端部位具有1个跨膜结构(TM)，且与多药运输蛋白具有较高的相似性，推测定位于内膜并与可德胶的内膜转运相关；CrdC结构预测发现有2个TMs，推测其定位于外膜上，完成多糖的外膜转运。CrdA和CrdC在可德胶中合成和运输中的功能可能类似于纤维素合成与运输复合体中的BcsB与BcsC的功能。
ATCC31749中存在纤维素合成操纵子(cel)，且CrdS和根癌农杆菌CelA有相似的跨膜结构及胞质催化结构域，共属GT-2糖基转移酶。进行ATCC31749和产纤维素根癌农杆菌(ATCC33970) 间基因组比较分析，相对于ATCC33970，ATCC31749 cel中celA C153 (ATG下游153处的碱基C，下同)缺失，celB G247缺失，致移码突变；celG多处终止突变；仅celC、celD和celE具有完整读码框，其中celC编码葡聚糖水解酶，应与转运无关，推测具有膜结构特征的CelD和CelE可能参与可德胶的运输。相对于ATCC31749，产纤维素根癌农杆菌(ATCC33970) 中也含有crd操纵子，但CrdA基因突变而使该蛋白的N端缺失27氨基酸残基，C端移码突变而丧失功能，这些研究揭示了ATCC31749和ATCC33970分别只产可德胶和纤维素的基因基础，同时预示ATCC31749菌株中c-di-GMP可能与CrdS或CrdA和CrdS复合物结合，从而变构激活并促进可德胶的合成和内膜转运。
6 展望调控因子AlgR转录激活mucR活性调节c-di-GMP的合成，YfiNBR以分子开关的机理调控胞内c-di-GMP含量。这些研究增强了我们对c-di-GMP胞内浓度调控的理解，但在许多细菌基因组中我们发现有很多的c-di-GMP代谢酶，如何基于基因组序列全面阐述c-di-GMP代谢酶转录水平和翻译后修饰水平的调控将是c-di-GMP下一轮研究的热点。在c-di-GMP代谢酶活性调控方面，一般在c-di-GMP代谢酶(无论是DGC还是PDE)的N端或C端均有重要的信号接收与感应位点，细胞中应该有更为通用或专一的信号传递途径，调控DGC和PDE活性，通过c-di-GMP的合成或降解活性来调控c-di-GMP含量，阐明各类DGC和PDE激活机制也是一步研究的重点。c-di-GMP信号传导途径不仅能够促进细菌生物膜的形成，也能够调控生物膜的降解，如链霉菌中，在营养丰富的环境下，通过谷氨酸诱导c-di-GMP合成与降解调控来降解生物膜，恢复细菌细胞繁殖分化的单细胞、游离的状态。但是c-di-GMP如何调控生物膜的降解，实现细胞浮游状态的转换机制仍有待深入探讨。另在多糖合成与运输方面，研究较为清楚的是c-di-GMP调控纤维素和藻酸盐合成运输，其它重要细菌多糖是否由c-di-GMP调控以及如何调控等还不清楚；而目前因胞外多糖的运输机制不明，c-di-GMP是否参与调控多糖的运输过程及调控机制等也是急需阐明的内容。
另外，c-di-GMP在应用上有广阔的前景。在医药卫生和植物细菌性病害防治方面，我们可以通过代谢工程的手段，超表达PDE基因、抑制DGC基因的表达或者利用c-di-GMP合成酶抑制剂等来降低c-di-GMP水平，减少生物膜合成或促进生物膜的降解，以降低病原菌的毒性，克服其对抗生素的抗性；同时在植物保护方面，可用相似的策略防治作物病害以提高产量。同时在环境治理，如农残、工业污水处理等，微生物生物膜能吸附截留污染物[67]，合成生物膜的细菌具有较强的农残耐受性且可氧化分解残留，形成反硝化环境，实现脱氮除磷等功能。因此应用上可超表达DGC或抑制PDE的表达来提高c-di-GMP含量以诱导生物膜合成，增强工程菌株对农残和有毒污水的抗性，实现较好的农残生物降解并应用于污染的治理与环境保护。
| [1] | Whitney JC, Howell PL. Synthase-dependent exopolysaccharide secretion in Gram-negative bacteria[J]. Trends in Microbiology, 2013, 21(2) : 63–72. DOI:10.1016/j.tim.2012.10.001 |
| [2] | Schmid J, Sieber V, Rehm B. Bacterial exopolysaccharides: biosynthesis pathways and engineering strategies[J]. Frontiers in Microbiology, 2015, 6 : 496. |
| [3] | Aschner M, Hestrin S. Fibrillar structure of cellulose of bacterial and animal origin[J]. Nature, 1946, 157(3994) : 659. |
| [4] | Hestrin S, Aschner M, Mager J. Synthesis of cellulose by resting cells of Acetobacter xylinum[J]. Nature, 1947, 159(4028) : 955–958. |
| [5] | Ross P, Aloni Y, Weinhouse C, et al. An unusual guanyl oligonucleotide regulates cellulose synthesis in Acetobacter xylinum[J]. FEBS Letters, 1985, 186 : 191–196. DOI:10.1016/0014-5793(85)80706-7 |
| [6] | Ross P, Aloni Y, Weinhouse H, et al. Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase[J]. Carbohydrate Research, 1986, 149(1) : 101–117. DOI:10.1016/S0008-6215(00)90372-0 |
| [7] | Ross P, Weinhouse H, Aloni Y, et al. Regulation of cellulose synthesis in Acetobacter xylinum by cyclic diguanylic acid[J]. Nature, 1987, 325(6101) : 279–281. DOI:10.1038/325279a0 |
| [8] | Amikam D, Benziman M. Cyclic diguanylic acid and cellulose synthesis in Agrobacterium tumefaciens[J]. Journal of Bacteriology, 1989, 171(12) : 6649–6655. DOI:10.1128/jb.171.12.6649-6655.1989 |
| [9] | Römling U, Galperin MY, Gomelsky M. Cyclic di-GMP: the first 25 years of a universal bacterial second messenger[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2013, 77(1) : 1–52. DOI:10.1128/MMBR.00043-12 |
| [10] | Liaw YC, Gao YG, Robinson H, et al. Cyclic diguanylic acid behaves as a host molecule for planar intercalators[J]. FEBS Letters, 1990, 264(2) : 223–227. DOI:10.1016/0014-5793(90)80253-F |
| [11] | Yousef KP, Streck A, Schutte C, et al. Logical-continuous modelling of post-translationally regulated bistability of curli fiber expression in Escherichia coli[J]. BMC Systems Biology, 2015, 9 : 39. DOI:10.1186/s12918-015-0183-x |
| [12] | Zhu B, Liu CL, Liu SH, et al. Membrane association of SadC enhances its diguanylate cyclase activity to control exopolysaccharides synthesis and biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa[J]. Environmental Microbiology, 2016, 18(10) : 3440–3452. DOI:10.1111/1462-2920.13263 |
| [13] | Hecht GB, Newton A. Identification of a novel response regulator required for the swarmer-to-stalked-cell transition in Caulobacter crescentus[J]. Journal of Bacteriology, 1995, 177(21) : 6223–6229. DOI:10.1128/jb.177.21.6223-6229.1995 |
| [14] | Whiteley CG, Lee DJ. Bacterial diguanylate cyclases: structure, function and mechanism in exopolysaccharide biofilm development[J]. Biotechnology Advances, 2015, 33(1) : 124–141. DOI:10.1016/j.biotechadv.2014.11.010 |
| [15] | Chan C, Paul R, Samoray D, et al. Structural basis of activity and allosteric control of diguanylate cyclase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(49) : 17084–17089. DOI:10.1073/pnas.0406134101 |
| [16] | Paul R, Abel S, Wassmann P, et al. Activation of the diguanylate cyclase PleD by phosphorylation-mediated dimerization[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2007, 282(40) : 29170–29177. DOI:10.1074/jbc.M704702200 |
| [17] | Minasov G, Padavattan S, Shuvalova L, et al. Crystal structures of YkuI and its complex with second messenger cyclic Di-GMP suggest catalytic mechanism of phosphodiester bond cleavage by EAL domains[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2009, 284(19) : 13174–13184. DOI:10.1074/jbc.M808221200 |
| [18] | Barends TRM, Hartmann E, Griese JJ, et al. Structure and mechanism of a bacterial light-regulated cyclic nucleotide phosphodiesterase[J]. Nature, 2009, 459(7249) : 1015–1018. DOI:10.1038/nature07966 |
| [19] | Kariisa AT, Weeks K, Tamayo R. The RNA domain Vc1 regulates downstream gene expression in response to cyclic diguanylate in Vibrio cholerae[J]. PLoS One, 2016, 11(2) : e0148478. DOI:10.1371/journal.pone.0148478 |
| [20] | Bellini D, Caly DL, McCarthy Y, et al. Crystal structure of an HD-GYP domain cyclic-di-GMP phosphodiesterase reveals an enzyme with a novel trinuclear catalytic iron centre[J]. Molecular Microbiology, 2014, 91(1) : 26–38. DOI:10.1111/mmi.2014.91.issue-1 |
| [21] | Wigren E, Liang ZX, Römling U. Finally! The structural secrets of a HD-GYP phosphodiesterase revealed[J]. Molecular Microbiology, 2014, 91(1) : 1–5. DOI:10.1111/mmi.2014.91.issue-1 |
| [22] | Chou SH, Galperin MY. Diversity of c-di-GMP-binding proteins and mechanisms[J]. Journal of Bacteriology, 2016, 198(1) : 32–46. DOI:10.1128/JB.00333-15 |
| [23] | Amikam D, Galperin MY. PilZ domain is part of the bacterial c-di-GMP binding protein[J]. Bioinformatics, 2006, 22(1) : 3–6. DOI:10.1093/bioinformatics/bti739 |
| [24] | Ryjenkov DA, Simm R, R?mling U, et al. The PilZ domain is a receptor for the second messenger c-di-GMP: the PilZ domain protein YcgR controls motility in enterobacteria[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(41) : 30310–30314. DOI:10.1074/jbc.C600179200 |
| [25] | Merighi M, Lee VT, Hyodo M, et al. The second messenger bis-(3′-5′)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa[J]. Molecular Microbiology, 2007, 65(4) : 876–895. DOI:10.1111/mmi.2007.65.issue-4 |
| [26] | Hobley L, Fung RK, Lambert C, et al. Discrete cyclic di-GMP-dependent control of bacterial predation versus axenic growth in Bdellovibrio bacteriovorus[J]. PLoS Pathogens, 2012, 8(2) : e1002493. DOI:10.1371/journal.ppat.1002493 |
| [27] | Whitney JC, Colvin KM, Marmont LS, et al. Structure of the cytoplasmic region of PelD, a degenerate diguanylate cyclase receptor that regulates exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2012, 287(28) : 23582–23593. DOI:10.1074/jbc.M112.375378 |
| [28] | Lee VT, Matewish JM, Kessler JL, et al. A cyclic-di-GMP receptor required for bacterial exopolysaccharide production[J]. Molecular Microbiology, 2007, 65(6) : 1474–1484. DOI:10.1111/mmi.2007.65.issue-6 |
| [29] | Newell PD, Monds RD, O'Toole GA. LapD is a bis-(3′, 5′)-cyclic dimeric GMP-binding protein that regulates surface attachment by Pseudomonas fluorescens Pf0-1[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106(9) : 3461–3466. DOI:10.1073/pnas.0808933106 |
| [30] | Hickman JW, Harwood CS. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor[J]. Molecular Microbiology, 2008, 69(2) : 376–389. DOI:10.1111/mmi.2008.69.issue-2 |
| [31] | Su TT, Liu SH, Wang K, et al. The REC domain mediated dimerization is critical for FleQ from Pseudomonas aeruginosa to function as a c-di-GMP receptor and flagella gene regulator[J]. Journal of Structural Biology, 2015, 192(1) : 1–13. DOI:10.1016/j.jsb.2015.09.002 |
| [32] | Wang HX, Ayala JC, Benitez JA, et al. The LuxR-type regulator VpsT negatively controls the transcription of rpoS, encoding the general stress response regulator, in Vibrio cholerae biofilms[J]. Journal of Bacteriology, 2014, 196(5) : 1020–1030. DOI:10.1128/JB.00993-13 |
| [33] | Gentner M, Allan MG, Zaehringer F, et al. Oligomer formation of the bacterial second messenger c-di-GMP: reaction rates and equilibrium constants indicate a monomeric state at physiological concentrations[J]. Journal of the American Chemical Society, 2012, 134(2) : 1019–1029. DOI:10.1021/ja207742q |
| [34] | Tschowri N, Schumacher MA, Schlimpert S, et al. Tetrameric c-di-GMP mediates effective transcription factor dimerization to control Streptomyces development[J]. Cell, 2014, 158(5) : 1136–1147. DOI:10.1016/j.cell.2014.07.022 |
| [35] | Tamayo R, Pratt JT, Camilli A. Roles of cyclic diguanylate in the regulation of bacterial pathogenesis[J]. Annual Review of Microbiology, 2007, 61 : 131–148. DOI:10.1146/annurev.micro.61.080706.093426 |
| [36] | Sudarsan N, Lee ER, Weinberg Z, et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP[J]. Science, 2008, 321(5887) : 411–413. DOI:10.1126/science.1159519 |
| [37] | Kulshina N, Baird NJ, Ferré-D'Amaré AR. Recognition of the bacterial second messenger cyclic diguanylate by its cognate riboswitch[J]. Nature Structural & Molecular Biology, 2009, 16(12) : 1212–1217. |
| [38] | Smith KD, Lipchock SV, Livingston AL, et al. Structural and biochemical determinants of ligand bindingby the c-di-GMP riboswitch[J]. Biochemistry, 2010, 49(34) : 7351–7359. DOI:10.1021/bi100671e |
| [39] | Kong WN, Zhao JR, Kang HP, et al. ChIP-seq reveals the global regulator AlgR mediating cyclic di-GMP synthesis in Pseudomonas aeruginosa[J]. Nucleic Acids Research, 2015, 43(17) : 8268–8582. DOI:10.1093/nar/gkv747 |
| [40] | Li SS, Li TT, Xu YY, et al. Structural insights into YfiR sequestering by YfiB in Pseudomonas aeruginosa PAO1[J]. Scientific Reports, 2015, 5 : 16915. DOI:10.1038/srep16915 |
| [41] | Sommerfeldt N, Possling A, Becker G, et al. Gene expression patterns and differential input into curli fimbriae regulation of all GGDEF/EAL domain proteins in Escherichia coli[J]. Microbiology, 2009, 155(4) : 1318–1331. DOI:10.1099/mic.0.024257-0 |
| [42] | Simm R, Lusch A, Kader A, et al. Role of EAL-containing proteins in multicellular behavior of Salmonella enterica serovar Typhimurium[J]. Journal of Bacteriology, 2007, 189(9) : 3613–3623. DOI:10.1128/JB.01719-06 |
| [43] | Rehm BHA. Bacterial polymers: biosynthesis, modifications and applications[J]. Nature Reviews Microbiology, 2010, 8(8) : 578–592. DOI:10.1038/nrmicro2354 |
| [44] | Yu XQ, Zhang C, Yang LP, et al. CrdR function in a curdlan-producing Agrobacterium sp. ATCC31749 strain[J]. BMC Microbiology, 2015, 15 : 25. DOI:10.1186/s12866-015-0356-1 |
| [45] | Mao ZC, Chen RR. Recombinant synthesis of hyaluronan by Agrobacterium sp.[J]. Biotechnology Progress, 2007, 23(5) : 1038–1042. |
| [46] | McManus JB, Deng Y, Nagachar N, et al. AcsA-AcsB: The core of the cellulose synthase complex from Gluconacetobacter hansenii ATCC23769[J]. Enzyme & Microbial Technology, 2016, 82 : 58–65. |
| [47] | Morgan JL, McNamara JT, Zimmer J. Mechanism of activation of bacterial cellulose synthase by cyclic di-GMP[J]. Nature Structural & Molecular Biology, 2014, 21(5) : 489–496. |
| [48] | Hay ID, Wang YJ, Moradali MF, et al. Genetics and regulation of bacterial alginate production[J]. Environmental Microbiology, 2014, 16(10) : 2997–3011. DOI:10.1111/emi.2014.16.issue-10 |
| [49] | Oglesby LL, Jain S, Ohman DE. Membrane topology and roles of Pseudomonas aeruginosa Alg8 and Alg44 in alginate polymerization[J]. Microbiology, 2008, 154(Pt6) : 1605–1615. |
| [50] | Navarro MVAS, Newell PD, Krasteva PV, et al. Structural basis for c-di-GMP-mediated inside-out signaling controlling periplasmic proteolysis[J]. PLoS Biology, 2011, 9(2) : e1000588. DOI:10.1371/journal.pbio.1000588 |
| [51] | Newell PD, Boyd CD, Sondermann H, et al. A c-di-GMP effector system controls cell adhesion by inside-out signaling and surface protein cleavage[J]. PLoS Biology, 2011, 9(2) : e1000587. DOI:10.1371/journal.pbio.1000587 |
| [52] | Boehm A, Steiner S, Zaehringer F, et al. Second messenger signalling governs Escherichia coli biofilm induction upon ribosomal stress[J]. Molecular Microbiology, 2009, 72(6) : 1500–1516. DOI:10.1111/mmi.2009.72.issue-6 |
| [53] | Pérez-Mendoza D, Coulthurst SJ, Sanjuán J, et al. N-Acetylglucosamine-dependent biofilm formation in Pectobacterium atrosepticum is cryptic and activated by elevated c-di-GMP levels[J]. Microbiology, 2011, 157(Pt 12) : 3340–3348. |
| [54] | Itoh Y, Rice JD, Goller C, et al. Roles of pgaABCD genes in synthesis, modification, and export of the Escherichia coli biofilm adhesin poly-β-1, 6-N-acetyl-D-glucosamine[J]. Journal of Bacteriology, 2008, 190(10) : 3670–3680. DOI:10.1128/JB.01920-07 |
| [55] | Jonas K, Edwards AN, Simm R, et al. The RNA binding protein CsrA controls cyclic di-GMP metabolism by directly regulating the expression of GGDEF proteins[J]. Molecular Microbiology, 2008, 70(1) : 236–257. DOI:10.1111/j.1365-2958.2008.06411.x |
| [56] | Steiner S, Lori C, Boehm A, et al. Allosteric activation of exopolysaccharide synthesis through cyclic di-GMP-stimulated protein-protein interaction[J]. The EMBO Journal, 2012, 32(3) : 354–368. DOI:10.1038/emboj.2012.315 |
| [57] | Pérez-Mendoza D, Rodríguez-Carvajal Má, Romero-Jiménez L, et al. Novel mixed-linkage β-glucan activated by c-di-GMP in Sinorhizobium meliloti[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2015, 112(7) : E757–E765. DOI:10.1073/pnas.1421748112 |
| [58] | Zavaliev R, Epel BL. Imaging callose at plasmodesmata using aniline blue: quantitative confocal microscopy[A]//Heinlein M. Plasmodesmata: Methods in Molecular Biology[M]. New York: Springer, 2015, 1217: 105-119 |
| [59] | Wiater A, Paduch R, Pleszczynska M, et al. α-(1→3)-D-glucans from fruiting bodies of selected macromycetes fungi and the biological activity of their carboxymethylated products[J]. Biotechnology Letters, 2011, 33(4) : 787–795. DOI:10.1007/s10529-010-0502-7 |
| [60] | Zhang RR, Edgar KJ. Properties, chemistry, and applications of the bioactive polysaccharide curdlan[J]. Biomacromolecules, 2014, 15(4) : 1079–1096. DOI:10.1021/bm500038g |
| [61] | Ruffing AM, Chen RR. Transcriptome profiling of a curdlan-producing Agrobacterium reveals conserved regulatory mechanisms of exopolysaccharide biosynthesis[J]. Microbial Cell Factories, 2012, 11 : 17. DOI:10.1186/1475-2859-11-17 |
| [62] | Jin LH, Um HJ, Yin CJ, et al. Proteomic analysis of curdlan-producing Agrobacterium sp. in response to pH downshift[J]. Journal of Biotechnology, 2008, 138(3/4) : 80–87. |
| [63] | Dai XM, Yang LB, Zheng ZY, et al. Proteomic analysis of curdlan-producing Agrobacterium sp. ATCC 31749 in response to dissolved oxygen[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2015, 55(8) : 1018–1025. (in Chinese) 戴小萌, 杨利博, 郑志永, 等. 溶氧影响土壤杆菌ATCC 31749发酵生产热凝胶的蛋白质组学[J]. 微生物学报, 2015, 55(8) : 1018–1025. |
| [64] | Periasamy A, Shadiac N, Amalraj A, et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1, 3)-β-D-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2013, 1828(2) : 743–757. DOI:10.1016/j.bbamem.2012.10.003 |
| [65] | Marczak M, Matysiak P, Kutkowska J, et al. PssP2 is a polysaccharide co-polymerase involved in exopolysaccharide chain-length determination in Rhizobium leguminosarum[J]. PLoS One, 2014, 9(9) : e109106. DOI:10.1371/journal.pone.0109106 |
| [66] | Yu XQ. Primarys studies on regulation curdlan biosynthesis in Agrobacterium sp. ATCC 31749[D]. Kunming: Master's Thesis of Yunnan Agricultural University, 2013 (in Chinese) 余小琴. 农杆菌ATCC 31749可德胶合成调控的初步研究[D]. 昆明: 云南农业大学硕士学位论文, 2013 |
| [67] | Saleem M, Moe LA. Multitrophic microbial interactions for eco-and agro-biotechnological processes: theory and practice[J]. Trends in Biotechnology, 2014, 32(10) : 529–537. DOI:10.1016/j.tibtech.2014.08.002 |