鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)引起的鸭的主要细菌性传染病，研究RA的致病机制对开展该病的防控具有重要意义。RA对宿主的致病性受其毒力因子、生物被膜和密度感应系统的调控。广泛存在于革兰氏阴性和阳性菌中的LuxS/AI-2型密度感应系统能产生通用信号分子AI-2，AI-2由LuxS和Pfs催化底物S-adenosylhomocysteine (SAH)产生，SAH在Pfs作用下，产生S-核糖同型半胱氨酸(S-ribosyl-homocysteine，SRH)，SRH在LuxS作用下产生等量的同型半胱氨酸(Homocysteine，HCY)和AI-2，AI-2参与调控细菌众多的生理功能^[1]。

在大肠杆菌中pfs基因的编码产物Pfs不但参与AI-2的合成，同时也是细菌甲硫氨酸循环中的重要组分，其对于有毒代谢产物SAH的清除也是必需的^[2]。研究表明，pfs在细菌的感染过程中发挥重要作用，参与调控包括细菌的毒力、生物被膜形成等功能^[3]。

本实验室的前期研究表明，在RA中不存在luxS基因，不产生AI-2，但存在编码Mtan蛋白的pfs^[3]。由于RA血清型众多，不同血清型的pfs是否存在差异，pfs的编码产物Mtan蛋白是否在体外具有催化SAH的能力，目前尚未见相关研究。

在宿主的消化道、泌尿生殖道、呼吸道和皮肤等病原菌入侵部位存在微生物菌群(microbiota)，并且微生物菌群中的细菌可以产生AI-2，由于AI-2不具有种属特异性，是一种通用的信号分子，因此不产生该类信号分子的细菌，可以利用环境中其他细菌产生的AI-2来调节其生物学特性，如苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)自身不产生AI-2，但可以利用其他细菌产生的AI-2来调控自身的行为^[4]。RA在感染过程中，是否存在类似的作用，目前仍未见相关报道。

本研究通过对RA不同血清型pfs的序列分析，进一步研究其重组表达产物RA-Mtan的催化活性，为研究pfs对RA的调控作用提供参考。

不同血清型的9株RA分离自樱桃谷鸭，由本实验室分离、保存；哈维弧菌BB170、哈维弧菌BB152由本实验室保存；RA的pfs重组表达质粒pCold-RA-pfs、禽致病性大肠杆菌(APEC)的pfs和luxS原重组表达质粒pET28a-APEC-pfs和pET28a-APEC-luxS均由本实验室前期构建、保存^[5]。

DNA Marker DL5000、DL2000，2×PrimeSTAR Max DNA Polymerase高保真酶购自宝生物工程(大连)有限公司；2×Taq PCR Master Mix购自北京康为世纪有限公司；蛋白超滤管购自Millipore公司；自动高压灭菌锅购自日本TOMY公司；恒温培养箱购自上海新苗公司；多功能酶标仪购自美国Biotek公司。

以不同血清型的9株鸭疫里默氏杆菌CH3 (血清1型)、WJ4 (血清1型)、YXB12 (血清1型)、TH4 (血清2型)、YB2 (血清2型)、YXB1 (血清2型)^[6]、YXL1 (血清10)、XYB1 (血清10)、HXB2 (血清10型)基因组为模板^[6]，以RA-pfs-F (5′-CCGGAATTCA TGAAAATAGTCGTTATTGGAGC-3′，划线部分为EcoR Ⅰ酶切位点)和RA-pfs-R (5′-CCCAAGCTTC TATAAACTTTTAATTAAATC-3′，划线部分为Hind Ⅲ酶切位点)为引物，PCR扩增pfs基因，PCR扩增体系为：25.0 μL PCR Mix，上下游引物(10.0 μmol/L)各1.0 μL，基因组DNA (100 mg/L) 1.0 μL，双蒸水补充至50.0 μL；PCR扩增条件为：98 ℃ 40 s；98 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。产物回收后连接T载体，送华津生物科技公司测序。利用DNAStar软件中的MegAlign进行核苷酸序列的同源性分析。

将本实验室前期构建的分别表达APEC的luxS和pfs重组表达质粒pET28a-APEC-luxS和pET28a-APEC-pfs^[5]和本实验构建的表达RA的pfs重组表达质粒pCold-RA-pfs分别转化大肠杆菌BL21(DE3) 菌株，37 ℃培养至OD₆₀₀约为0.6-0.8，经IPTG诱导表达后，收集菌体，用超声细胞裂解仪130 Hz工作90 s，间歇90 s，超声破碎裂解菌体，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，分别收集上清和沉淀并进行SDS-PAGE分析，以检测基因表达情况。将上述表达的重组蛋白分别命名为APEC-LuxS、APEC-Pfs和RA-Mtan。

重组蛋白的纯化用美国Bio-Rad公司的高效亲和纯化层析仪进行。将收集的洗脱蛋白进行SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，并采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品蛋白的浓度。

通过测定重组蛋白APEC-LuxS、APEC-Pfs和RA-Mtan催化底物SAH后形成HCY的量，评价蛋白的酶活。参照文献[7]方法并进行适当修改，建立HCY标准曲线，具体方法如下：将100 μL不同浓度的同型半胱氨酸(用10 mmol/L pH 7.5磷酸钠缓冲液，将HCY稀释到1-200 μmol/L)与50 μL 5 mmol/L的Ellman’s试剂混匀后，避光置于37 ℃培养箱孵育30 min，用酶标仪测量不同浓度的HCY在412 nm的吸收峰值，建立HCY标准曲线。

将纯化蛋白超滤后，在3管终浓度为1 mmol/L SAH的磷酸钠(10 mmol/L，pH 7.5) 缓冲液中，分别加入终浓度为0.5 mg/mL的APEC-LuxS+APEC-Pfs (阳性对照)、APEC-LuxS+RA-Mtan和RA-Mtan (阴性对照)，37 ℃孵育1 h。将反应液用10 kD蛋白超滤管进行超滤，去除反应液中的蛋白后，取出100 μL滤液与50 μL 5 mmol/L的Ellman’s试剂混匀后避光置于37 ℃孵育30 min。用酶标仪测量每组在412 nm处的吸收峰值，参照1.4 HCY标准曲线，测定每组生成同型半胱氨酸的浓度。

将哈维弧菌BB170在28 ℃培养过夜，培养至OD₆₀₀为3.0，用新配制的AB培养基^[1]以1:5 000稀释BB170培养物。将1.5中反应产物超滤液在无菌条件下用0.22 μm的滤器过滤后，用于AI-2活性检测。具体方法参照文献[1]，并做适当修改。具体方法如下：900 μL的AB培养基，加入无菌的各蛋白滤液100 μL，28 ℃培养3 h后用多功能酶标仪测定生物发光。同时以哈维弧菌BB152培养上清为阳性对照、DH5α培养上清为阴性对照，每组重复3次。

PCR检测结果表明，不同血清型的RA菌株均可以扩增到大小约为688 bp的pfs基因(图 1)。对扩增的序列测序后，运用DNAStar软件进行序列分析，结果表明该基因在不同血清型间的核苷酸一致在93.9%-100%之间(图 2)。

图 1　9株不同血清型鸭疫里默氏杆菌pfs基因PCR检测 Figure 1　The pfs gene was amplified from 9 isolation strains of Riemerella anatipestifer from different serotypes 注：M：DL2000 DNA分子标准；1-9：RA 9株不同血清型的pfs基因PCR扩增条带. Note: M: DL2000 DNA marker; 1-9: The pfs from different serotypes in RA.

图选项

图 2　核苷酸序列比对分析图 Figure 2　Nucleotide sequence analysis

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将包含重组表达质粒pCold-RA-pfs的BL21重组菌经IPTG诱导后，用SDS-PAGE检测，结果表明，获得以可溶性方式表达的RA的重组Mtan蛋白，大小约为85 kD，与预期大小一致(图 3)。

图 3　RA-Mtan的表达、纯化 Figure 3　Experession and purification of RA-Mtan 注：M：蛋白质分子质量Marker；1：转化空质粒pColdTF的BL21 (阴性对照)；2：纯化的RA-Mtan；3：转化pCold-RA-pfs的BL21重组菌；4：转化pCold-RA-pfs的BL21重组菌超声上清. Note: M: Protein marker; 1: The total cellular proteins from E. coli BL21 containing pColdTF (serve as negative control); 2: The purification of RA-Mtan; 3: The total cellular proteins containing expression plasmids pCold-RA-pfs; 4: The supermatant of total cellular proteins containing expression plasmids pCold-RA-pfs.

图选项

APEC-LuxS和APEC-Pfs的纯化、表达参照本实验室前期建立的方法。RA-Mtan、APEC-LuxS和APEC-Pfs通过His-Binding-Resin进行亲和层析纯化后，经BCA法测定的浓度分别为0.67、1.30和2.30 g/L。

将不同浓度(0-200 μmol/L)的同型半胱氨酸(HCY)分别与5 mmol/L Ellman’s试剂混匀，37 ℃作用30 min后，测定其在412 nm波长下的光吸收值。依据得到的数据建立HCY浓度测定标准曲线(图 4)。

图 4　HCY浓度测定标准曲线 Figure 4　Standard curve to determine HCY concentration

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当200 μL 0.5 g/L的APEC-LuxS与APEC-Pfs酶蛋白组合共同作用于200 μL 1 mmol/L的底物SAH时，可以生成306.6 μmol/L的HCY，当APEC-LuxS和RA-Mtan酶蛋白组合共同作用于相同浓度的SAH时，生成HCY的浓度为176.7 μmol/L，而当RA-Mtan单独作用于底物SAH时，不能产生HCY。

AI-2活性检测结果表明，当APEC-LuxS和APEC-Pfs共同作用于SAH时，能产生有活性的AI-2分子；同样地，当APEC-LuxS和RA-Mtan共同作用于SAH时，也能产生有活性的AI-2。但当RA-Mtan单独作用于SAH时，不能产生AI-2，表明鸭疫里默氏杆菌中Mtan与大肠杆菌的Pfs功能相似，参与AI-2的合成(图 5)。

图 5　AI-2活性检测 Figure 5　AI-2 bioassay

图选项

pfs基因编码Pfs (又称为Mtan)，是细菌甲硫氨酸循环的关键酶，主要参与多聚胺的生物合成、密度感应系统调控、嘌呤和蛋氨酸的合成与代谢等过程^[8]。不同的细菌采用不同的甲硫氨酸代谢通路，在布鲁氏菌和铜绿假单胞菌中，甲硫氨酸与ATP反应生成S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine，SAM)，SAM去甲基后生成SAH，SAH在SahH作用下生成HCY，HCY重新生成甲硫氨酸，此过程不产生AI-2^[9-11]。但在大肠杆菌和沙门氏菌中，甲硫氨酸代谢需要Pfs和LuxS的参与，通过催化底物SAH和SRH产生AI-2^[12]。

近年的研究表明，pfs在细菌代谢过程中具有重要作用，参与调控细菌的众多生理过程。在金黄色葡萄球菌中pfs基因缺失，可降低金黄色葡萄球菌的自溶能力和影响其生物被膜的形成能力^[13]，在肺炎链球菌中pfs编码Mtan蛋白，参与对其密度感应系统的调控^{[2, 14]}。本实验室前期研究表明RA不产生AI-2^[3]，但存在pfs。RA的致病性研究结果表明，RA主要的致病血清型是1、2和10型，其pfs序列是否存在差异?在体外RA的pfs基因编码产物Mtan蛋白是否能催化SAH产生具有活性的AI-2分子?目前尚未见相关研究报道。本研究对9株RA的1、2和10型的pfs序列进行克隆、测序，序列分析表明，pfs在3种血清型中的一致性高，表明该基因保守性高，与血清型的相关性不大。

AI-2分子的产生需要LuxS和Pfs的参与^[1]，虽然RA中存在pfs，但其编码产物Mtan是否能催化SAH产生AI-2分子仍不明确。因此本研究利用禽致病性大肠杆菌的LuxS和RA的Mtan共同作用于SAH验证其催化活性，结果表明在体外Mtan可以催化SAH生成AI-2。由于RA不产生AI-2，而SAH在胞内蓄积对细菌是有毒性的，推测在RA中，存在类似于布鲁氏菌和铜绿假单胞菌的甲硫氨酸代谢通路，即RA中的SAH是在SahH作用下生成HCY，HCY重新生成甲硫氨酸，相关研究仍有待深入。本研究为进一步研究pfs对RA的调控作用提供参考。