亚麻(Linum usitatissimum L.)是一种重要的经济作物，其亚麻纤维被广泛地应用于纺织、造纸产业，亚麻种子可以生产亚麻籽油，营养丰富^[1-2]。亚麻立枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的一种毁灭性的土传病害，主要危害幼苗茎基部或地下根部，导致幼苗大面积猝倒、死苗，造成巨大的经济损失^[3-4]。亚麻立枯病的防治目前主要是采用轮作、土壤消毒以及使用化学药剂，但由于立枯丝核菌可在土壤中存活很多年，且长期使用化学药剂会提高病菌抗药性，所以并不能有效地防治亚麻立枯病^[5-6]。更为严重的是，长期地使用化学药剂会威胁人类健康，造成环境污染等问题^[4]。因此，发展一种有效、绿色、安全地防治亚麻立枯病的新方法是迫切重要的。

利用有益微生物生物防治土传病害具有对人畜安全无毒、无残留、不污染环境以及不会使病原菌产生抗药性等特点，越来越受到人们的重视^[7-9]。许多生防菌已经被研究表明能够有效地抑制立枯丝核菌的生长，包括芽孢杆菌(Bacillus spp.)、木霉菌(Trichoderma sp.)、放线菌(Actinomycetes sp.)、青霉菌(Penicillium sp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、沙雷氏菌(Serratia spp.)和类芽孢杆菌(Paenibacillus spp.)^[10-16]。

本研究从湖南沅江市亚麻立枯发病区健康亚麻植株的根际土壤中，分离出一株对亚麻立枯病菌具有显著拮抗作用的细菌，对其进行形态学、生理生化特征、分子鉴定及抗菌谱测定，并进一步优化了其产生抑菌活性物质的发酵条件，以期为利用拮抗菌进行亚麻立枯病的生物防治奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 供试病原真菌: 亚麻立枯病菌(R. solani)，用于筛选亚麻立枯病原拮抗菌；辣椒疫病病菌(Phytophthora capsici)、亚麻炭疽病菌(Colletotrichum lini)、油茶炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、马铃薯立枯病菌(Rhizoctonia solani)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum sp. cucumebrium Owen)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)，用于测定拮抗菌的抑菌谱，均为本实验室分离、鉴定并保存。

1.1.2 培养基: NA培养基^[17]用于细菌的分离、培养以及发酵种子液的制备；PDA培养基^[17]用于拮抗菌的筛选以及打孔法测定无菌发酵液的抑菌活性；发酵基础培养基(g/L)：葡萄糖20.0，牛肉膏10.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，pH 7.0，用于拮抗菌后续胞外抗菌物质的发酵优化。

1.1.3 主要试剂和仪器: 细菌DNA提取试剂盒、DNA marker、dNTPs、DNA聚合酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；其余均为国产分析纯。电泳仪购自北京六一仪器厂；PCR仪购自美国ABI公司；恒温摇床购自天津欧诺仪器仪表有限公司；紫外可见分光光度计购自上海光谱仪器有限公司。

1.2 拮抗菌的分离及筛选

从湖南沅江市亚麻立枯发病区收集健康亚麻植株根际土壤样品，取土样5 g置于45 mL的无菌水中，涡旋振荡至悬浮均匀。悬浮液分别稀释成10^-5、10^-6、10^-7系列浓度梯度，然后分别吸取100µL悬浮液涂布至NA平板上，每个浓度重复3次。将平板置于28 ℃下培养36 h，挑选形态各异的菌落进行划线纯化，编号并保存于4℃。

采用对峙培养法^[18]，将直径为5 mm的亚麻立枯病菌菌块接种于 =9 cm的PDA平板中心，将候选细菌点接至距平板中心2.5 cm处，以不接种细菌的平板为对照，每个处理重复3次。平板置于28℃下培养，待对照组菌落长满全皿时，测量每个细菌的抑菌圈直径，选出生防潜力最强的细菌作为候选菌株进行后续研究。

1.3 候选拮抗菌株抑菌谱的测定

以候选拮抗菌为研究对象，方法同1.2。靶标菌为辣椒疫病病菌、亚麻炭疽病原菌、油茶炭疽病原菌、马铃薯立枯病原菌、黄瓜枯萎病原菌、油菜菌核病原菌、水稻纹枯病原菌，以不接种细菌的平板为对照，每个处理重复3次。待对照组菌落长满全皿时，测量每个病原菌的抑菌圈直径，获得拮抗菌抑菌谱。

1.4 候选拮抗菌株的菌种鉴定

1.4.1 形态学观察: 将供试菌株划线接种至NA平板上，30℃培养24 h，观察菌落生长形态并进行常规的革兰氏及芽孢染色。

1.4.2 生理生化鉴定: 参照《伯杰细菌鉴定手册》(第9版)对菌株进行生理生化鉴定。

1.4.3 16S rRNA基因序列分析: 采用细菌DNA提取试剂盒提取供试菌株DNA；利用通用引物B27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和U1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增细菌16S rRNA基因；PCR反应体系(50 μL)为：10×PCR buffer 5 μL，DNA模板1 μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 4 μL，MgCl₂ (25 mmol/L) 3 μL，引物(1 mmol/L)各1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH₂O 34.5 μL；反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；4 ℃保存。扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将测定的序列在GenBank中进行BLAST相似性比对(available at: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，最后用MEGA 6.0的Neighbor-Joining构建系统发育树，确定该菌株的系统发育学地位。

1.5 拮抗菌温室抗病实验

供试亚麻种子为中亚2号，为本实验室前期保存及备用。对种子进行表面消毒、恒温暗光催芽处理。基质为市售营养土，使用前先进行两次灭菌处理，然后拌入亚麻立枯病原菌菌液，使得病原菌菌液浓度达10⁵CFU/g。实验共设3个处理，分别为施加HXP-5菌株菌液，浓度达10⁸CFU/g (T)，施加等量无菌培养液(CK2) 以及施加等量无菌水(CK1)。每个处理设置3钵，每钵接种50粒出芽亚麻种子。培养条件：温度为22±1 ℃，光照强度为12 000 lx，光周期L׃D=14׃10，RH=90%±10%。每隔2 d每钵施加10 mL营养液，以保证基质较为湿润，亚麻正常生长。待CK1处理组发病率达60%以上时，实验结束并进行抗病效果统计调查。

发病率(%)=发病株数/调查总株数×100；

防治效果(%)=(1-处理组发病株率/对照组发病株率)×100。

1.6 拮抗菌的发酵优化

1.6.1 发酵优化结果评价: 以亚麻立枯病原菌为靶标菌，采用打孔法检测供试菌无菌发酵液的抑菌活性以及利用分光光度计测定发酵液在波长600 nm下的吸光度值，每个处理重复3次。

1.6.2 单因素筛选最优碳源、氮源: 对发酵培养基碳源、氮源进行单因素实验，碳源种类选择葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘油和可溶性淀粉，浓度为2%；氮源种类选择胰蛋白胨、牛肉粉、酵母浸出粉、蛋白胨+牛肉粉(3:1)、蛋白胨+酵母浸出粉(3:1)、黄豆粉、硝酸铵，浓度为1%。接种量为2%，将种子液接入装有50 mL相应培养基的250 mL摇瓶中，28 ℃、180 r/min培养48 h，每处理重复3次。

1.6.3 均匀设计实验: 选择最优碳源、氮源、NaCl、时间、温度、转速、装液量和接种量作为自变量，无菌发酵液抑菌圈直径作为因变量利用DPS实验设计与数据处理软件设计8因素5水平均匀设计表。保持培养条件不变的情况下，按照均匀设计表进行实验，并用该软件处理分析数据，得出最佳组合。最后对上述实验得出的结果进行验证实验，检测模型及结果的准确性。

2 结果与分析 2.1 拮抗菌的分离和筛选

从湖南沅江市亚麻立枯发病区健康亚麻植株的根际土壤中共分离筛选到13株对亚麻立枯病原菌有拮抗效果的细菌。其中，菌株HXP-5对病菌的拮抗能力最强，抑菌圈直径达到21.6 mm (图 1)。因此，选择菌株HXP-5用于进一步的研究。

2.2 HXP-5菌株抑菌谱的测定

从表 1可以看出，菌株HXP-5对几种供试病原真菌均显示出较强的抑制作用。其中，对辣椒疫病病菌抑制作用最强，抑菌圈直径为23.4 mm；对黄瓜枯萎病原菌抑制作用最弱，但抑菌圈直径也达到了14.4 mm。抑菌效果见图 2，说明菌株HXP-5可高效广谱地拮抗病原真菌。

2.3 HXP-5菌株的菌种鉴定

2.3.1 形态学特征: 菌株HXP-5在NA平板上30℃培养24 h，菌落呈圆形、污白色、表面粗糙褶皱(图 3A)；革兰氏染色呈阳性(图 3B)，为革兰氏阳性菌；芽孢染色有芽孢生成(图 3C)。

2.3.2 生理生化特征: 生理生化实验结果如表 2所示。

2.3.3 16S rRNA基因分子鉴定: 经DNA提取，PCR扩增和测序获得的16S rRNA基因片段长度为1 452 bp，在GenBank上进行BLAST比对，得出该菌株与枯草芽孢杆菌ZD-16序列相似性达到99%。从GenBank中调取芽孢杆菌属不同种的14株标准菌株的16S rRNA基因序列，构建系统发育进化树，结果显示(图 4)菌株HXP-5与枯草芽孢杆菌的同源关系最近，提交序列后获得的登录号为KX421348。结合形态学和生理生化鉴定结果，确定菌株HXP-5为Bacillus subtilis，中文名称枯草芽孢杆菌。

2.4 拮抗菌温室抗病实验结果

温室抗病实验结果表明枯草芽孢杆菌HXP-5在温室条件下能有效地防治亚麻立枯病的发生。如图 5所示，温室培养15 d后，对照组CK1和CK2均出现大面积的幼苗猝倒、死苗症状，CK1的发病率达到73.56%，CK2也达到了50.73%，而施加了HXP-5菌液处理组的发病率仅为21.17%，远低于对照组。以CK1作为对照，CK2和T处理组的防治效果分别达到31.04%和71.22%，进一步表明了拮抗菌HXP-5具有较强的生防潜力。

2.5 HXP-5菌株的发酵优化

2.5.1 最优碳源、氮源的筛选: 碳源优化结果如图 6所示，CK为无碳源培养基，选择的几种碳源较CK而言，对菌株HXP-5的生长影响不大，但均能明显地促进其抑菌物质的产生。其中葡萄糖作为碳源抑菌圈直径最大，且其对菌株生长也有一定的促进作用，所以选择葡萄糖作为发酵碳源；氮源优化结果如图 7所示，胰蛋白胨+酵母粉(3:1) 较其它氮源而言，可显著提高菌株HXP-5的生物量及抑菌物质的产生，所以选择胰蛋白胨+酵母粉(3:1) 作为发酵氮源。

2.5.2 均匀设计实验结果: 由DPS实验设计与数据处理软件得到的优化实验设计方案及结果见表 3。对实验数据进行二次多项式逐步回归分析，得到抑菌圈直径与各因素的回归方程为：Y=7.698 066 87-2.803 274 628 5X₂+ 0.083 627 201 43X₇+0.000 258 840 121 08X₄X₆。P=0.001 7，R²=0.999 992，F=197 137.436 6，作F检验，F > F_0.05(3, 1)=215.7，回归方程显著。其最优结果为：葡萄糖为2.280 8%，胰蛋白胨+酵母粉(3:1) 为0.25%，NaCl为0.178 1%，发酵时间为71.999 9 h，发酵温度为26.625 9 ℃，转速为209.962 8 r/min，250 mL摇瓶装液100 mL，接种量为1.731 5%，抑菌圈直径达到19.27 mm。实际选择葡萄糖为2.3%，胰蛋白胨+酵母粉(3:1) 为0.25%，NaCl为0.18%，发酵时间为72 h，发酵温度为27 ℃，转速为210 r/min，250 mL摇瓶装液100 mL，接种量为1.7%，抑菌圈直径实测达到19.94 mm，在误差范围之内。抑菌效果见图 8。

3 结论与讨论

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种嗜温性的好氧产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，对人畜无毒无害，对环境无污染，具有显著的抗菌活性和极强的抗逆能力，是一种理想的生防微生物^[19-20]。国内外已有许多研究报道生防枯草芽孢杆菌能有效地防治多种植物病害。Ma等^[21]研究表明枯草芽孢杆菌B99-2制成的微型胶囊生防产品可有效地防治番茄立枯病。Park等^[22]研究也发现，枯草芽孢杆菌BS07能有效地降低辣椒炭疽病和辣椒软腐病的发病率。喻国辉等^[23]进行田间防治实验发现枯草芽孢杆菌TR21对巴西蕉枯萎病的防治连续两年分别达到63.23%和73.90%。

本研究从湖南沅江市亚麻立枯发病区健康亚麻植株的根际土壤中，分离出13株对亚麻立枯病原菌有拮抗效果的细菌。其中，菌株HXP-5对病菌的拮抗能力最强，抑菌圈直径达到21.6 mm。综合HXP-5菌株形态学特征、生理生化特性以及基于16S rRNA基因的系统发育分析结果，将HXP-5菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。为了确定菌株HXP-5的生防潜力，本研究检测了其对几种植物真菌病原菌的拮抗效果，实验结果表明菌株HXP-5均能有效地抑制几种植物真菌病原菌的生长，具有高效广谱的拮抗能力。温室防病实验结果也进一步表明菌株HXP-5能有效地防治亚麻立枯病的发生，其防治效果达到71.22%，说明枯草芽孢杆菌HXP-5具有较好的应用前景。

生防菌发挥生物防治作用的重要物质基础是抑菌活性代谢产物，其产量的高低直接影响菌株的生防效果，而微生物代谢产物的类型和产量与其培养条件密切相关。本研究采用单因素实验和均匀设计实验进行发酵条件的优化，确定了菌株HXP-5的发酵条件为葡萄糖2.3%，胰蛋白胨+酵母粉(3:1) 0.25%，NaCl 0.18%，发酵时间72 h，发酵温度27 ℃，转速210 r/min，250 mL摇瓶装液100 mL，接种量1.7%，其抑菌圈直径可达19.94 mm，为其工业化生产和大面积推广应用提供理论依据。

综上所述，亚麻立枯病拮抗菌HXP-5被鉴定为枯草芽孢杆菌，且具有高效广谱的拮抗能力，在温室条件下能有效地防治亚麻立枯病的发生，通过发酵条件优化，显著地提高了拮抗菌HXP-5无菌发酵液的抑菌能力。后续工作将在此优化基础上，进一步地研究其拮抗作用机制以及分析鉴定其抗菌物质的有效成分。同时，也将进行大田实验，确定其田间防治效果并进行相应生物防治产品的开发及应用。