褐藻胶(Alginate)是存在于褐藻细胞壁及细胞间质中的一种水溶性酸性多糖，广义上褐藻胶是褐藻酸、褐藻酸盐及褐藻酸有机衍生物的统称，市场上商品一般指的是褐藻酸钠盐。褐藻胶是世界上用途最广的三大海藻胶之一，广泛应用于工业、农业、医药等领域^[1-5]。褐藻胶在藻体中含量丰富，工业上应用的褐藻胶大部分来源于3个属：巨藻(Macrocystis)、海带(Laminaria)和泡叶藻(Ascophyllum)，欧美国家生产的褐藻胶主要源自巨藻，我国生产的褐藻胶则主要来源于海带。褐藻胶分子由两种互为C5差向异构体的单体[β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)]聚合而成^[6]，其组成方式有3种：同聚物G段、同聚物M段和异聚物G/M段。同一种褐藻胶中可同时包含一种及多种结构。

由于褐藻胶凝胶性强、黏度大、不易被机体吸收等缺点，使其在应用方面受到限制。随着海洋科学和寡糖生理活性研究的不断深入，褐藻胶寡糖的价值逐渐被揭示。研究表明，褐藻胶寡糖有抗肿瘤、抗凝血、抗自由基氧化、抗菌、预防龋齿、增强免疫、促进植物生长和诱导抗逆性等生物活性^[7-8]。褐藻胶裂解酶作为一种海藻工具酶^[9]，因其反应条件温和，专一性强，且在制备过程中不改变寡糖结构，得到的寡糖也较酸解寡糖生物活性更强等优点，将逐步取代传统酸碱制备方法。因此对褐藻胶裂解酶的开发引起了国内外学者的关注。

褐藻胶裂解酶来源广泛，可从土壤微生物、海洋软体动物和微生物、海藻、海水甚至一些噬菌体、病毒中分离获得，但主要来自海洋微生物^[10]。不同来源的褐藻胶裂解酶，其酶学性质差异较大，在分子量、底物特异性、最适pH和温度等方面也各不相同。本文采用基因工程方法，克隆褐藻胶裂解酶基因，构建重组表达载体，转化大肠杆菌进行异源表达，并对重组酶进行分离纯化和酶学性质研究，为褐藻胶裂解酶的开发应用打下基础。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒: 交替假单胞菌BYS-2菌株：从福建南日岛鲍鱼养殖场水样中筛选获得；宿主大肠杆菌Top10为本实验保存菌株；宿主大肠杆菌BL21(DE3) 购于北京TransGen公司；质粒pET-22b(+)为本实验室保存质粒。

1.1.2 主要试剂和仪器: Pfu DNA Polymerase购自北京TransGen公司；质粒提取试剂盒购自美国OMEGA公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、蛋白Marker购自美国Thermo Fisher Scientific公司；IPTG购自生工生物工程(上海)股份有限公司。梯度热循环PCR仪Veriti^® 96-Well Thermal Cycler，美国Applied Biosystems公司；凝胶成像仪JS-680，上海培清科技有限公司；DYY-8C型电泳仪、DYCP-31DY型电泳槽，北京六一仪器厂；YXQ-LS-100SII型高压蒸汽灭菌锅、SW-CJ-2FI类B型超净工作台，上海博迅实业有限公司；SHP-250型隔水式恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；752N型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；CF16RXⅡ型高速冷冻离心机，日本HITACHI公司；ZWY-2101C型恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计与基因克隆: 引物设计：alg738-F：5′-AACTGAATTCAGCGCATCCAAATTTGGTAATA ACC-3′，alg738-R：5′-AAGTCTCGAGCTCCTGATTA TTCTTCATCGCATAAAC-3′。以交替假单胞菌BYS-2菌株DNA为模板，50 µL体系扩增alg738基因。扩增体系：2×Pfu PCR master 25 µL，20 pmol/L alg738-F 1.5 µL，20 pmol/L alg738-R 1.5 µL，基因组DNA 3 µL，ddH₂O 19 µL。扩增条件：94 ℃ 5 min；94 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2.5 min，30个循环；72 ℃ 10 min；10 ℃保存^[11]。将扩增PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，回收目的片段。

1.2.2 表达载体构建: 将alg738基因和质粒pET-22b(+)用EcoR I和Xho I双酶切，回收的基因片段和酶切质粒用T4 DNA连接酶连接，构建重组表达质粒pET-22b-alg738，转化至感受态细胞大肠杆菌Top10，挑选阳性转化子送至Invitrogen公司测序，提取序列正确的重组质粒转化至感受态细胞大肠杆菌BL21(DE3)。

1.2.3 序列分析: 采用Expasy中ProtParam (http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)预测褐藻胶裂解酶alg738基因的蛋白质分子量以及等电点等；采用SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)预测蛋白质信号肽以及剪切位点，为目的蛋白表达提供一定基础条件；利用SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/interactive)在线对褐藻胶裂解酶Alg738进行三维建模。

1.2.4 重组酶rAlg738诱导表达: 将构建的大肠杆菌工程菌接种到LB液体培养基^[12]中(含Amp终浓度为100 mg/L)，37、200 r/min振荡培养。菌液OD₆₀₀达到0.5-0.8时，加入IPTG (终浓度为1 mmol/L)进行诱导，以未添加IPTG诱导作为对照组。收集菌液，4、13 000 r/min离心5 min，收集上清液并测定褐藻胶裂解酶活力。

1.2.5 重组酶rAlg738活力检测: 采用DNS (3, 5-二硝基水杨酸)法测定还原糖含量^[13]。取0.1 mL酶液与0.9 mL的0.3%褐藻酸钠底物于40水浴中反应15 min，加入1 mL DNS并煮沸5 min显色，然后立即冷水冷却至室温并定容至5 mL，同时以灭活酶液组作为空白对照，在540 nm下测定吸光值，根据上述葡萄糖标准曲线计算还原糖含量。

酶活力单位定义：在该反应条件下，每分钟催化底物产生1 μmol还原糖所需的酶量作为一个酶活力单位(U)。

1.2.6 重组酶rAlg738分离纯化: 利用中空纤维柱对诱导上清液进行初步浓缩；将浓缩液进行硫酸铵分级沉淀，检测酶活力并收集^[14]；将收集的重组酶溶液置于2 L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0) 中进行透析；通过Ni-NTA亲和层析对重组酶rAlg738进行分离纯化，SDS-PAGE检测纯度。

1.2.7 重组酶rAlg738比活力测定: 以考马斯亮蓝染色(Bradford)法测定纯化酶液的蛋白含量^[15-16]；在最适反应条件下测定重组酶活力，计算比活力(酶活力/蛋白含量)。

1.2.8 重组酶rAlg738纯酶性质研究: (1) 最适反应pH和pH稳定性研究。在40℃条件下，分别测定在不同pH缓冲溶液配制的褐藻胶底物中的酶活力，以测得的最高酶活力值为100%，计算相对酶活力，确定最适反应pH。将其置于不同pH缓冲液中37℃条件下保温1 h，在最适pH和温度下测定酶活力，以测得的最高酶活力为100%，计算各pH下褐藻胶裂解酶的残余酶活百分比。(2) 最适反应温度和温度稳定性研究。在最适pH条件下，分别测定在不同温度(20、30、40、50、60、70℃) 下的褐藻胶裂解酶活力，以测得的最高酶活力为100%，计算相对酶活力，确定最适反应温度。将其分别置于不同温度水浴中保温，在不同时间点(2、5、8、15、30、45、60 min)分别取样并在最适pH和温度下测定酶活力，以未处理组的酶活力定义为100%，计算各温度条件下褐藻胶裂解酶的残余酶活百分比。(3) 不同金属离子及化学试剂对酶活力的影响。在最适反应条件下，比较浓度为1 mmol/L和5 mmol/L的14种金属离子(Na⁺、Ca²⁺、K⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Li⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺)和2种化学试剂(EDTA、SDS)对酶活性的影响，以相同条件下未加金属离子和化学试剂的酶促反应为对照。(4) 酶K_m值和V_max值测定。配制不同浓度(0.8-6.0 g/L)的反应底物，在最适反应条件下测定酶活力，重复3次，计算酶促反应速度，利用双倒数法求得K_m值和V_max值^[17]。(5) 酶底物特异性研究。分别配制0.3% (质量体积比)的褐藻酸钠、聚古罗糖醛酸钠、聚甘露糖醛酸钠底物，在最适条件下测定酶活力，确定该重组酶对不同底物的作用特异性。

2 结果与分析 2.1 褐藻胶裂解酶全长基因调取及序列分析

以交替假单胞菌BYS-2菌株基因组DNA为模板，设计全长特异性引物alg738-F/R进行PCR扩增；扩增得到一条约2 200 bp大小的片段(图 1)，送测序。将测序获得的序列利用Vector软件进行开放阅读框分析，在NCBI数据库中进行蛋白序列比对，确认该序列为完整的褐藻胶裂解酶基因全长，记为alg738。

褐藻胶裂解酶基因alg738全长2 217 bp，利用ProtParam预测该蛋白的氨基酸组成和理化性质，发现其可以编码738个氨基酸，分子量约为79.512 kD，理论等电点为6.42。带负电的氨基酸Asp和Glu共有79个，而带正电的氨基酸Arg和Lys有72个，由此推断该蛋白为一个酸性蛋白。SignalP 4.1预测结构表明蛋白N端含28个氨基酸的信号肽序列；通过NCBI中BLASTp对预测蛋白序列分析，该蛋白含Alginate lyase和Hepar_Ⅱ_Ⅲ两个保守结构域。利用SWISS-MODEL在线对褐藻胶裂解酶Alg738进行同源建模，以4nei.1.A为模板，对Alg738中第28-734个氨基酸进行结构模拟，得到一个低同源性的蛋白结构(图 2)，一致性仅为50.07%，该结构中螺旋区和折叠区分区明显，N端约370个氨基酸部分富含α-螺旋，剩余部分富含β-折叠结构。

2.2 重组酶rAlg738的表达与纯化

重组工程菌BL21(DE3)/pET22b-alg738经IPTG诱导分泌重组酶rAlg738。诱导结束后，离心收集上清液测定褐藻胶裂解酶活力并进行SDS-PAGE检测(图 3)。发现经过IPTG诱导的发酵上清液在80 kD处出现一条很明显的蛋白条带，与预测的理论分子量大小(79.512 kD)一致，说明重组褐藻胶裂解酶基因alg738在大肠杆菌中诱导表达成功。

将诱导和未经诱导的发酵上清液经过中空纤维柱初步浓缩、硫酸铵分级沉淀和镍柱纯化后得到单一条带(图 3)，表明重组酶rAlg738已获得纯化。在最适条件下测定重组酶活力为560 U/L，比活力为0.34 U/mg。

后续进一步对经过分离纯化的重组酶rAlg738进行酶学性质研究。

2.3 重组酶rAlg738性质分析

2.3.1 最适反应pH和pH稳定性: 将rAlg738置于不同pH缓冲液中测定酶活力，结果表明该重组酶的最适反应pH为8.0，当pH小于5.0或大于10.0时酶活力降为0 (图 4A)。将重组酶置于不同pH缓冲液中37℃保温1 h并测定酶活力，结果表明该酶在pH 6.0-9.0范围内稳定性较好，能保持84%以上的相对酶活力；在pH低于4.0或高于11.0条件下该酶完全失活(图 4B)。

2.3.2 最适反应温度和热稳定性: 将rAlg738置于不同温度条件下测定酶活力，结果表明该重组酶的最适反应温度为45℃ 图 5A)。热稳定性试验结果显示，该酶在43℃以下较稳定，37℃保温60 min其残余酶活力仍达66.6%；当温度超过50℃，酶快速失活，保温15 min，相对酶活降为0 (图 5B)。

2.3.3 金属离子及化学试剂对酶活性影响: 14种金属离子及2种化学试剂对重组酶活性的影响见表 1。当浓度相对较低(1 mmol/L)时，Na⁺、K⁺、Ca²⁺对该酶有一定促进作用，Co²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、EDTA对该酶具有明显的抑制作用，Cu²⁺和SDS可完全抑制酶活性；当浓度为5 mmol/L时，Na⁺、Mg²⁺、Mn²⁺对该酶具有明显的促进作用，其中Mn²⁺促进作用最明显，酶活力提高了50.7%，K⁺、Ca²⁺和Fe²⁺有一定促进作用，而Ni²⁺、Co²⁺、EDTA、β-巯基乙醇具有明显的抑制作用，Cu²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺、SDS可完全抑制该重组酶活性。

2.3.4 酶促反应动力学参数测定: 采用Linewaeaver-Burk作图法，测得重组酶rAlg738的V_max为0.011 g/(L·min)，K_m为1.11 g/L (图 6)。

2.3.5 重组酶rAlg738的底物特异性: 褐藻胶分子由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)两种单体聚合而成。褐藻胶裂解酶根据作用底物不同可分为三类：特异性裂解1, 4-β-D-甘露糖醛酸片段酶、特异性裂解1, 4-α-L-古罗糖醛酸片段酶或者可同时裂解两种片段的双功能裂解酶。分别以褐藻酸钠、聚甘露糖醛酸钠(poly M)、聚古罗糖醛酸钠(poly G)为底物测定重组酶活力，结果发现该重组酶为poly M偏好型的双功能酶，作用于聚甘露糖醛酸片段效果远大于作用于聚古罗糖醛酸片段(表 2)。

3 结论

以交替假单胞菌BYS-2基因组DNA为模板，克隆目的基因alg738全长，构建工程菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b(+)-alg738，诱导表达，对重组酶rAlg738进行分离纯化和酶学性质研究。

重组酶的最适反应pH为8.0，最适反应温度为45，在pH 6.0-9.0、43以下稳定性较好；低浓度(1 mmol/L)下Na⁺、K⁺、Ca²⁺对该酶有一定促进作用，而高浓度(5 mmol/L)下Na⁺、Mg²⁺、Mn²⁺则具有明显的促进作用；在1 mmol/L和5 mmol/L下，Cu²⁺、Co²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、EDTA和SDS对该酶都具有显著的抑制作用。酶促反应参数K_m值、V_max值分别为1.11 g/L和0.011 g/(L·min)；底物特异性分析表明该重组酶为偏好聚甘露糖醛酸钠(Poly M)裂解作用的双功能酶。