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文章信息
- 李兵, 蔡国林, 朱德伟, 陆健
- Li Bing, Cai Guo-lin, Zhu De-wei, Lu Jian
- 黑曲霉阿魏酸酯酶基因密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达
- Codon optimization of feruloyl esterase gene of Aspergillus niger and its high expression in Pichia pastoris
- 微生物学通报, 2017, 44(5): 1065-1073
- Microbiology China, 2017, 44(5): 1065-1073
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160564
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文章历史
- 收稿日期: 2016-08-02
- 接受日期: 2016-11-01
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-12-05
阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73,Feruloyl esterase,FAE)又称为肉桂酸酯酶,属羧酸酯水解酶的亚类之一,是指能够水解植物细胞壁中多糖与阿魏酸连接的酯键,释放出游离的单体阿魏酸或阿魏酸二聚体[1-2]。1991年,Faulds等[3]首次从橄榄色链霉菌(Streptomyces olitrochromogenes)中分离得到阿魏酸酯酶,目前已有超过30种阿魏酸酯酶被分离和纯化[4]。阿魏酸酯酶来源广泛,普遍存在于真菌、细菌、植物中,绝大多数阿魏酸酯酶是从真菌,尤其是曲霉菌属(Aspergillus sp .)中分离得到,如黑曲霉(A. niger)、米曲霉(A. oryzae)、泡盛曲霉(A. awamori)和构巢曲霉(A. nidulans)等[5-8]。然而,由于大多数野生菌株产阿魏酸酯酶能力很低,如黑曲霉发酵后酶活仅在0.010-0.096 U/mL之间[9],这就限制了该酶的产业化应用。
2001年,Juge等在毕赤酵母中实现了黑曲霉阿魏酸酯酶基因的异源高效表达,重组阿魏酸酯酶表达量为300 mg/L[10]。在国内,张帅兵等将黑曲霉阿魏酸酯酶基因导入毕赤酵母GS115中,分泌表达的重组阿魏酸酯酶酶活达16.6 U/mL[11]。但因外源基因的密码子并非都是毕赤酵母本身所偏好的密码子,而毕赤酵母密码子使用的偏好性尤其明显,当外源基因中含有毕赤酵母非偏好性密码子时,将严重阻碍其在毕赤酵母中的表达[12]。近年来,宿主基因密码子的偏好性优化被作为提高外源基因表达量的重要手段,主要有密码子“随机优化”和“一对一优化”[13]。
本研究在不改变重组蛋白氨基酸序列的前提下,分别对阿魏酸酯酶基因进行两种方式的密码子优化,构建表达载体pPICZαA-AnfaeA并电转化至毕赤酵母中进行诱导表达,以期提高重组阿魏酸酯酶的表达量及酶活,为后续进一步提高该酶的酶活及大规模应用奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒: 黑曲霉(Aspergillus niger) CBS 513.88、大肠杆菌(Escherichia coli) JM109和毕赤酵母X-33均为本实验室保藏;表达载体pPICZαA和pMD19-T Simple Vector均购自TaKaRa生物工程有限公司。 1.1.2 主要试剂、仪器及培养基: PCR引物由上海Sangon公司合成;PCR产物纯化试剂盒、DNA Marker、标准蛋白质Marker、博来霉素(Zeocin)、质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司;阿魏酸乙酯和阿魏酸甲酯购自Sigma公司;其他化学试剂均为国产或进口分析纯。AKTA avant25蛋白纯化仪、HisTrapTM excel (1 mL)色谱柱,美国GE Healthcare公司;Agilent 1260高效液相色谱仪,美国安捷伦公司;Mastercycler pro PCR仪,德国Eppendorf公司。YPD、BMGY、BMMY培养基均按Invitrogen公司的毕赤酵母菌实验操作手册配制。筛选平板:2%琼脂灭菌后,立即加入300μL 10% (质量体积比)阿魏酸乙酯的二甲基甲酰胺溶液,摇匀至呈现云雾状。 1.2 方法 1.2.1 黑曲霉阿魏酸酯酶基因的克隆及基因优化合成: 根据黑曲霉阿魏酸酯酶的基因序列(GenBank登录号:Y09330.2),使用软件Signal P3.0预测序列信号肽并设计重叠延伸PCR引物(表 1)。采用CTAB法[14]提取黑曲霉染色体基因组DNA,并以此为模板,用表 1中的引物组合(F1/R1,F2/R2) 分别扩增外显子1和外显子2。PCR反应条件:95℃4 min;95℃ 15s,52℃ 15s,72℃ 30s,30个循环;72℃ 10 min。胶回收PCR产物外显子1和外显子2。以外显子1和2的胶回收产物的混合物(1:1,体积比)为模板,以F1和R2为上、下游引物进行重叠延伸PCR,反应条件除了延伸时间改成60 s外,其余条件均和外显子1扩增的条件相同。将纯化的重叠延伸PCR产物与pMD19-T载体连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,获得重组质粒pMD19-AnfaeA,由上海生工生物工程有限公司进行测序。引物 Primer |
序列 Sequence (5′→3′) |
酶切位点 Restriction site |
F1 | CGGAATTCGCCTCCACGCAAGGCATCTC | EcoR Ⅰ |
R1 | CTATGGCCTGTCACGGTAAGC | None |
F2 | CGCTTACCGTGACAGGCCATAGTCTGGGAGCGTCGATGGC | None |
R2 | ATAAGAATGCGGCCGCTTACCAAGTACAAGCTCCGC | Not Ⅰ |
Opt Ⅰ-F | CGGAATTCGCCTCAACACAAGGTATCAG | EcoR Ⅰ |
Opt Ⅰ-R | ATAAGAATGCGGCCGCCCAAGTACAAGCGCCACTTG | Not Ⅰ |
Opt Ⅱ-F | CGGAATTCGCTTCTACTCAAGGTATTTCTG | EcoR Ⅰ |
Opt Ⅱ-R | ATAAGAATGCGGCCGCCCAAGTACAAGCACCACTAG | Not Ⅰ |
注:下划线部分为限制性酶切位点. | ||
Note: The underlined are restriction enzyme cutting sites. |
根据基因测序结果,在不改变阿魏酸酯酶氨基酸序列的前提下,综合考虑毕赤酵母密码子偏好性、G+C%含量、CAI-密码子适应指数、基因序列重叠区的去除等因素,对目的基因进行在线密码子“随机优化”(http://www.jcat.de/),同时根据毕赤酵母偏好性密码子进行“一对一优化”,即根据表 2所示的毕赤酵母偏好性密码子,将黑曲霉阿魏酸酯酶基因序列中的所有非偏好性密码子进行替换[15]。将两种优化后的基因序列送至上海生工生物工程有限公司合成并与pMD19-T载体连接,获得质粒pMD19-opAnfaeA Ⅰ和pMD19-opAnfaeA Ⅱ。
氨基酸 Amino acid |
密码子 Codon |
偏好密码子 Optimal codon |
Phe | TTT | * |
TTC | ||
Leu | TTA | |
TTG | * | |
CTT | ||
CTC | ||
CTA | ||
CTG | ||
Ile | ATT | * |
ATC | ||
ATA | ||
Val | GTT | * |
GTC | ||
GTA | ||
GTG | ||
Ser | TCT | * |
TCC | ||
TCA | ||
TCG | ||
AGT | ||
AGC | ||
Pro | CCT | |
CCC | ||
CCA | * | |
CCG | ||
Thr | ACT | * |
ACC | ||
ACA | ||
ACG | ||
Tyr | TAT | |
TAC | * | |
His | CAT | |
CAC | * | |
Gln | CAA | * |
CAG | ||
Asn | AAT | |
AAC | * | |
Lys | AAA | |
AAG | * | |
Asp | GAT | |
GAC | * | |
Glu | GAA | * |
GAG | ||
Cys | TGT | * |
TGC | ||
Arg | CGT | |
CGC | ||
CGA | ||
CGG | ||
AGA | * | |
AGG | ||
Gly | GGT | * |
GGC | ||
GGA | ||
GGG | ||
Ala | GCT | * |
GCC | ||
GCA | ||
GCG | ||
注:*:高表达偏好性密码子. | ||
Note: *: optimal codon. |
最适温度及温度稳定性:采用1.2.2所示的标准酶反应体系,分别在不同温度下(30-75℃)保温5 min,测定阿魏酸生成量,确定不同温度下重组阿魏酸酯酶的活性及其最适反应温度。将纯化后酶液分别于40、50、60℃保温10-60 min后,测定残余酶活,确定其稳定的温度范围。
金属离子和EDTA对重组阿魏酸酯酶活性的影响:将纯化后酶液分别与不同金属离子(Na+、K+、Ca2+、Fe2+、Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+)及EDTA (终浓度均为2.0 mmol/L)混匀,35℃保温1 h,在标准酶反应体系中50℃保温5 min,测定残余酶活,以不加金属离子或EDTA并经过35保温1 h的酶液为对照(相对酶活100%),确定金属离子和EDTA对重组阿魏酸酯酶活性的影响。
2 结果与分析 2.1 黑曲霉阿魏酸酯酶基因的克隆和基因优化后合成以提取的黑曲霉基因组DNA为模板,经重叠延伸PCR获得阿魏酸酯酶基因(不含信号肽,内含子及终止子)琼脂糖凝胶电泳显示在750 bp处有一条明显条带(图 1),测序后基因大小为780 bp,与NCBI中报道序列(GenBank登录号:Y09330.2) 进行BLAST比对,相似性达99.64%,表明获得阿魏酸酯酶基因。
密码子使用频率在线分析(http://www.kazusa. or.jp/codon)表明原基因序列中含有毕赤酵母的稀有密码子(使用率均小于15%),如CCG(Pro)、GCG (Ala)、CTC(Leu)、TCG/AGC(Ser)、ACG(Thr)和CGG/C(Arg)等。然而上述稀有密码子近半数存在于2-6个连续密码子簇中,这势必对目的基因在毕赤酵母中的高效表达造成影响。因此,对该目的基因进行偏好密码子优化可能会促进目的蛋白的高效表达。AnfaeA基因G+C%含量占碱基总量的54.4%,“随机优化”(AnfaeA-opt Ⅰ)和“一对一优化”(AnfaeA-opt Ⅱ)后G+C%含量分别降到45.1%和40.9%,而CAI-密码子适应指数由0.51升到0.91,基本符合毕赤酵母G+C%含量和CAI-密码子适应指数(CAI在0.8-1.0内被认为是毕赤酵母高表达范围)特征[15]。将3种目的基因(图 2)合成后连接pMD19-T载体保存到大肠杆菌JM109中。
2.2 重组表达载体的构建及阳性转化子的筛选将3种带EcoR Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点的目的基因插入表达载体pPICZαA中,构建了诱导型启动子AOX1的重组表达载体pPICZαA-AnfaeA (图 3A)、pPICZαA-opAnfaeA Ⅰ和pPICZαA-opAnfaeA Ⅱ。重组质粒经内切酶Sac Ⅰ线性化后电转化到毕赤酵母X-33中,将抗性平板上长出的转化子提取酵母基因组进行PCR验证,扩增出正确条带的阳性转化子经过甲醇诱导发酵3 d后,取上清进行阿魏酸乙酯平板的复筛(图 3B),透明圈的出现表明阿魏酸酯酶表达,根据透明圈的大小筛选出基因优化前后高酶活菌株各5株,并利用高效液相色谱法测定发酵液中酶活,得到酶活最高的菌株各一株,分别命名为FaeA-ori、FaeA-opt Ⅰ和FaeA-opt Ⅱ。
2.3 重组阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的表达用浓度为1%的甲醇分别诱导重组毕赤酵母菌株FaeA-ori、FaeA-opt Ⅰ和FaeA-opt Ⅱ,每隔12 h取样,离心并测定发酵液上清的酶活。如图 4所示,在发酵4.5 d时比酶活最高,FaeA-ori为6.8 U/ml,“一对一优化”菌株FaeA-opt Ⅱ酶活为5.2 U/ml,仅为优化前酶活的76.5%,但“随机优化”菌株FaeA-opt Ⅰ酶活达到39.9 U/ml,酶活提高了将近6倍。
2.4 重组阿魏酸酯酶的纯化及SDS-PAGE分析经HisTrapTM excel色谱柱纯化后,SDS-PAGE电泳显示约33 kD处有明显的单一蛋白条带(图 5),略高于理论分子量(28 kD),而阴性对照pPICZαA/ X-33诱导上清中几乎没有相应的蛋白条带。根据pPICZαA载体说明书,目的基因下游酶切位点和pPICZαA载体终止子之间含有His标签、c-myc抗体标签和其他酶切位点,蛋白表达后大小将增加约2.5 kD。利用在线软件NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)对重组蛋白潜在糖基化位点进行预测,结果表明在氨基酸序列79-82位(Asn-Tyr-Thr-Leu)有一个潜在的N-糖基化位点,重组蛋白在表达分泌过程中可能被糖基化,蛋白质分子量会因N-糖基化增大2 kD左右,从而使其实际分子量较其理论分子量增大约5 kD。
2.5 重组阿魏酸酯酶的酶学特性研究如图 6所示,反应温度在45-60℃范围时,重组阿魏酸酯酶具有较高的酶活,最适温度为50℃,高于扩展青霉(37℃和宇佐美曲霉(45℃来源的最适作用温度,当反应温度高于60℃时,酶活较低。重组阿魏酸酯酶在45-50℃范围内较稳定,50℃保温2 h后,酶活仍保留50%。当温度高于55℃时,该酶稳定性较差,保温1 h后残余酶活不到20%。
如图 7所示,重组阿魏酸酯酶在pH 4.0-6.0之间有较高的活性,其最适反应pH为5.5,与来自宇佐美曲霉[19]、泡盛曲霉[20]的阿魏酸酯酶最适pH相似。在pH 4.5-7.0范围内,该酶具有较好的稳定性,在酸性范围(pH 3.0-3.5) 时稳定性较差,35℃保温1 h,酶活大部分丢失。
通过不同金属离子和EDTA的添加考察了其对重组阿魏酸酯酶活性的影响,结果如图 8所示,金属离子及EDTA对重组酶活性影响较小,酶活均能维持在85%以上,其中Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+对重组酶活性有促进作用,而Fe2+、Co2+、Mn2+和EDTA对酶活有抑制作用。
3 讨论阿魏酸酯酶能切断植物细胞壁中酚类物质与多糖之间的共价交联结构,使木质纤维素原料变得疏松,在生物质降解过程有着重要的作用,在食品、造纸、化妆品等行业有广泛的应用前景[21],但野生菌产量低限制了其在工业生产上的应用,通过基因工程手段实现阿魏酸酯酶的异源表达是解决原始菌发酵产量低的有效途径。毕赤酵母表达系统在密码子使用上的偏好性影响外源基因的表达,尤其是稀有密码子密集区往往成为制约蛋白质翻译速率及表达水平的因素,根据表达宿主的密码子偏好性对外源基因的密码子进行优化是提高其表达量的一种有效方法。
前期报道中,来源于米曲霉和宇佐美曲霉的阿魏酸酯酶未经密码子优化在毕赤酵母中重组表达,重组酶酶活分别为2.11 U/mL[22]和10.76 U/mL[19],本研究中经密码子“随机优化”的重组阿魏酸酯酶酶活高达39.9 U/mL,显著高于前期研究,说明密码子优化对重组蛋白表达的必要性。本研究分别将黑曲霉阿魏酸酯酶基因中毕赤酵母非偏好性密码子进行“随机”或“一对一”替换为偏好性密码子,并将其克隆至表达载体在毕赤酵母中分泌表达,结果显示,密码子“随机优化”后的重组酶酶活比未经密码子优化的重组酶酶活提高了近6倍,而“一对一优化”后的重组酶酶活仅为优化前酶活的76.5%,表明密码子“随机优化”对黑曲霉阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的重组表达更有促进作用。其主要原因在于,在“随机优化”方法中除了偏好性密码子,G+C%含量、CAI-密码子适应指数、基因序列重叠区的去除等因素均被考虑进去,而“一对一优化”方法仅以密码子偏好性这一单一因素为标准,使重组阿魏酸酯酶表达量反而有所降低,这也为其他来源的基因在毕赤酵母中的密码子优化及重组表达策略提供了借鉴。此外,本研究中的重组阿魏酸酯酶具有较好的温度和pH稳定性,除Fe2+对其有轻微的抑制作用外,不受金属离子的影响,说明其可适应工业化生产及应用中的极端环境,为在饲料和造纸行业等大规模工业化应用奠定了基础。
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