2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 顾文杰, 赵冬梅, 卢钰升, 徐培智, 解开治, 李夏, 孙丽丽
- GU Wen-Jie, ZHAO Dong-Mei, LU Yu-Sheng, XU Pei-Zhi, XIE Kai-Zhi, LI Xia, SUN Li-Li
- 响应面分析法优化耐高温假黄色单胞菌硫氧化性能
- Optimization of oxidation by a thermotolerant Pseudoxanthomonas through response surface methodology
- 微生物学通报, 2017, 44(4): 991-998
- Microbiology China, 2017, 44(4): 991-998
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160419
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文章历史
- 收稿日期: 2016-05-26
- 接受日期: 2016-09-20
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-09-29
我国每年畜禽粪便、作物秸秆等农业有机固体废弃物产生量巨大，利用高温好氧堆肥技术进行处理是实现这些有机固体废弃物无害化、减量化和资源化利用的主要途径[1-3]。然而，堆肥一直存在着臭气释放这个重要问题不能解决[4]。堆肥臭气主要成分是氨气、硫化氢以及挥发性有机硫化物。相对于堆肥中氮素转化和氨气释放的研究，对堆肥硫素的研究相对较少。通常在好氧或厌氧光照条件下，硫氧化细菌 (Sulfur oxidizing bacteria，SOB) 将硫化物、单质硫和硫代硫酸盐等氧化为硫酸盐等；硫 (S) 是植物必需的营养元素之一，它主要以SO42−的形式被植物吸收，参与氨基酸、脂肪和碳水化合物的合成[5]，因此堆肥过程中将H2S等含硫物质转化成硫酸盐不仅有利于减少臭气释放，也有利于作物对硫元素的吸收利用[6]。
目前筛选出的硫氧化细菌主要有硫杆菌属、假单胞菌属、红球菌属、棒杆菌属、短杆菌属、土壤杆菌属、分枝杆菌属、戈登式菌属、克雷伯氏杆菌属、诺卡氏菌属、不动杆菌属、节杆菌属、拜叶克林氏菌属、硫化叶菌属、根瘤菌属、芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属等[7-9]。过去对于SOB的应用主要集中在污水处理和生物过滤等，除臭效果良好。近年来人们开始研究堆肥中的硫转化和SOB。Asano等从牛粪堆肥中分离了一株SOB，经鉴定为盐硫杆菌 (Halothiobacillus neapolitanus)[10]。作者利用S和Thiobacillus thioparus联合控制堆肥氮素损失，有效地增加了堆肥中SO42−含量，效果良好[11]。堆肥过程中臭气的释放主要集中在高温期，然而，目前所获得的SOB大多都是自养型[12]，往往不耐受高温，在堆肥的高温期受到抑制，影响其效果的发挥。本实验室在前期研究中筛选获得一株具有硫氧化作用的菌株，并且可以耐受高温，经鉴定为假黄色单胞菌属 (Pseudoxanthomonas byssovorax)，目前少见有关该属可利用硫化物的报道，该菌在50条件下可将S2−转化为SO42−[13]。本试验利用响应面分析方法优化假黄色单胞菌的培养条件，增强其氧化性能，提高SO42−转化率，为其今后的应用奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种: 假黄色单胞菌Pseudoxanthomonas byssovorax HB3由本实验室筛选并保藏，优化前硫酸根转化率为36.89%[13]。 1.1.2 培养基: 基础发酵培养基 (g/L)[14-15]：KH2PO4 2.0，NH4Cl 0.4，Na2CO3 0.4，MgCl2·6H2O 0.2，Na2S 0.5，pH 7.0。活化培养基 (NB)[14]。 1.1.3 主要试剂和仪器: 牛肉膏购于上海中科昆虫生物技术开发有限公司；酵母膏购自广东环凯生物科技有限公司；麦芽糖、乳糖、氯化铵、氯化镁、硫酸锰均购于广州化学试剂厂。恒温培养摇床THZ-300C、生化培养箱LRH-250，上海一恒科学仪器有限公司；超净工作台SW-JC-IFD，苏州净化设备有限公司。 1.2 培养方法菌株经斜面活化后，从斜面培养基上取一环菌体接入到200 mL活化培养基中，30、150 r/min培养36 h，以5% (体积比) 接种量接入基础发酵培养基中，装液量为100 mL (250 mL三角瓶)，30 ℃、150 r/min培养72 h。
1.3 分析方法取培养液4 500 r/min离心25 min，取上清液测定硫酸根含量，SO42−测定采用经典的改良硫酸钡比浊法[16]。
1.4 优化结果验证试验根据响应面分析方法优化获得的最佳参数条件进行Pseudoxanthomonas byssovorax HB3的发酵试验，测定硫酸根转化率，设置3个重复试验，验证响应面分析模型的准确性和可行性。
1.5 模拟堆肥效果验证试验采用恒温培养箱进行好氧堆肥模拟试验。将鸡粪和蘑菇渣1：1 (质量比，干重) 混合均匀后装入3 000 mL容器中。试验设置3个处理：添加优化前的HB3发酵液处理 (T1)、添加优化后的HB3发酵液处理 (T2) 和对照处理 (CK)。分别按照基础发酵培养基和培养方法以及优化后的培养基和培养方法进行Pseudoxanthomonas byssovorax HB3发酵，发酵液离心后用无菌水调整有效活菌数为108 cfu/mL，T1和T2处理按原料干重接种2.5%的菌悬液，同时分别添加5.0%的基础发酵培养基和优化后的培养基。堆肥温度模拟实际堆肥温度变化规律进行设定：第1天30；第2天40；第3天45；第4−5天50；第6−8天55；第9−10天60；第11天55；第12天50；第13天45；第14天40；第15天30结束堆肥。每隔一天采集堆肥样品，采用重量法测定模拟堆肥过程中T1、T2和CK的SO42−含量[11]。
1.6 数据处理及分析所得数据用软件Design Expert 8.05分析。
2 结果与分析 2.1 Plackett-Burman试验设计与主要因素筛选Plackett-Burman设计法是一种适用于从众多考察因素中快速有效筛选出最为重要因素的方法。根据之前单因素实验的结果，Plackett-Burman选用试验次数N=12的PB设计表，对碳酸钠、麦芽糖、乳糖、酵母膏、氯化铵、牛肉膏、镁离子 (Mg2+)、锰离子 (Mn2+)、pH等9个因素进行考察，设置两个虚拟列 (X，Y)，以考察实验误差[17-18]。设置两个水平，响应值为硫酸根转化率 (%)，见表 1。通过Plackett-Burman试验筛选对硫酸根转化率影响显著的因素，表 2分析结果显示，牛肉膏、镁离子 (Mg2+)、麦芽糖对硫酸根的转化率具有极显著影响 (P < 0.01)。其中麦芽糖为负效应，牛肉膏和镁离子 (Mg2+) 为正效应。
| No. | X | Sodium carbonate (%) | Malt sugar (%) | Lactase (%) | Yeast extract (%) | Ammonium chloride (%) | Beef extract (%) | Mg2+ (%) | Mn2+ (%) | pH | Y | sulfate conversion rate (%) |
| 1 | –1 | –1 | –1 | –1 | –1 | –1 | –1 | –1 | –1 | –1 | –1 | 9.12 |
| 2 | –1 | –1 | –1 | 1 | –1 | 1 | 1 | –1 | 1 | 1 | –1 | 19.25 |
| 3 | 1 | 1 | 1 | 1 | –1 | –1 | –1 | 1 | –1 | 1 | –1 | 13.93 |
| 4 | 1 | 1 | –1 | 1 | 1 | 1 | –1 | –1 | –1 | 1 | 1 | 1.44 |
| 5 | –1 | –1 | 1 | 1 | –1 | 1 | 1 | 1 | –1 | –1 | 1 | 30.56 |
| 6 | –1 | –1 | –1 | –1 | 1 | –1 | 1 | 1 | –1 | 1 | 1 | 28.37 |
| 7 | –1 | –1 | 1 | 1 | 1 | –1 | –1 | –1 | 1 | –1 | 1 | 14.07 |
| 8 | –1 | –1 | 1 | –1 | 1 | 1 | –1 | 1 | 1 | 1 | –1 | 81.26 |
| 9 | 1 | 1 | 1 | –1 | 1 | 1 | 1 | –1 | –1 | –1 | –1 | 16.73 |
| 10 | 1 | 1 | 1 | –1 | –1 | –1 | 1 | –1 | 1 | 1 | 1 | 33.93 |
| 11 | 1 | 1 | –1 | –1 | –1 | 1 | –1 | 1 | 1 | –1 | 1 | 72.03 |
| 12 | 1 | 1 | –1 | 1 | 1 | –1 | 1 | 1 | 1 | –1 | –1 | 31.65 |
| Note: X, Y: Dummy variable. | ||||||||||||
| Factor | Level | Regression coefficient | F value | P value | Significance order | |
| –1 | 1 | |||||
| Sodium carbonate (%) | 0.02 | 1.00 | 4.86 | 6.87 | 0.119 9 | 6 |
| Malt sugar (%) | 0.05 | 0.15 | –217.57 | 142.90 | 0.006 9 | 3 |
| Lactase (%) | 0.02 | 1.00 | −0.90 | 0.24 | 0.675 4 | 8 |
| Yeast extract (%) | 0.02 | 0.05 | 501.11 | 68.23 | 0.014 3 | 4 |
| Ammonium chloride (%) | 0.02 | 0.05 | –174.22 | 8.25 | 0.102 9 | 5 |
| Beef extract (%) | 0.06 | 0.12 | 453.50 | 223.51 | 0.004 4 | 1 |
| Mg2+ (%) | 0.02 | 0.05 | 844.67 | 193.85 | 0.005 1 | 2 |
| Mn2+ (%) | 0.01 | 0.10 | 7.44 | 0.14 | 0.748 1 | 9 |
| pH | 5.50 | 9.01 | –1.12 | 4.66 | 0.163 4 | 7 |
根据Plackett-Burman试验确定的显著因素，设计最陡爬坡试验分析它们对硫酸根转化率的影响 (表 3)。响应面拟合方程只有在考察的邻近区域里才充分近似真实情形。因此，要先逼近最佳值区域后才能建立有效的响应面拟合方程[19]。最陡爬坡法以试验因素的正、负效应为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速、经济地逼近最佳值区域。由Plackett-Burman试验结果设计主要因素的最陡爬坡路径，其中麦芽糖为负效应，应减小；牛肉膏和镁离子 (Mg2+) 为正效应，应增加。由试验结果可知 (表 3)，在第4组试验附近麦芽糖为0.075%、牛肉膏为0.105%、镁离子 (Mg2+) 为0.042 5%时硫酸根转化率最高，因此被确定为响应面试验的中心轴。
| No. | Malt sugar (%) | Beef extract (%) | Mg2+ (%) | Sulfate conversion rate (%) |
| 1 | 0.150 | 0.060 | 0.020 0 | 19.25 |
| 2 | 0.125 | 0.075 | 0.027 5 | 54.60 |
| 3 | 0.100 | 0.090 | 0.035 0 | 68.35 |
| 4 | 0.075 | 0.105 | 0.042 5 | 81.29 |
| 5 | 0.050 | 0.120 | 0.050 0 | 74.25 |
根据最陡爬坡试验确定出响应面中心点及各个显著因素的变化步长。根据Box-Behnken中心组合设计原理设计了以麦芽糖添加量A、牛肉膏添加量B、Mg2+添加量C为自变量，每个因素取3个水平，以 (−1、0、1) 编码试验。响应面分析方法试验因素编码和水平见表 4。根据表 5中Box-Behnken设计的试验结果，利用Design-Experts 8.05软件对结果进行二次回归分析，各试验因子对响应值的影响可用下列函数表示：硫酸根转化率 (%)=−557.41+ 2 339.47×A+6 068.93×B+11 022.51×C−2 506.67× A×B−106.67×B×C−15 200×A×C−14 785.6×A2− 24 782.22×B2−109 618×C2 (表 6)。对该模型进行方差分析和显著性检验，该二次回归模型的F值为52.60 (P < 0.000 1)，模型仅有0.01%的机会是由误差导致的。相关系数R2=0.980 2，说明模型能解释98.02%硫酸根转化率。因此，回归方程为优化培养基的配方提供了一个合适的模型。
| Factors | Level | ||
| –1 | 0 | 1 | |
| A: Malt sugar (%) | 0.050 | 0.075 0 | 0.100 |
| B: Beef extract (%) | 0.090 | 0.105 0 | 0.120 |
| C: Mg2+ (%) | 0.035 | 0.042 5 | 0.050 |
| No. | A | B | C | Sulfate conversion rate (%) |
| 1 | 0 | –1 | –1 | 65.48 |
| 2 | 0 | 0 | 0 | 81.28 |
| 3 | –1 | 0 | 1 | 69.26 |
| 4 | 1 | 0 | –1 | 62.85 |
| 5 | 0 | –1 | 1 | 73.26 |
| 6 | –1 | –1 | 0 | 68.53 |
| 7 | 1 | 1 | 0 | 62.84 |
| 8 | –1 | 1 | 0 | 71.59 |
| 9 | 0 | 1 | 1 | 70.50 |
| 10 | 1 | 0 | 1 | 61.48 |
| 11 | 0 | 0 | 0 | 80.95 |
| 12 | 0 | 0 | 0 | 81.66 |
| 13 | 0 | 0 | 0 | 81.52 |
| 14 | 1 | –1 | 0 | 63.54 |
| 15 | –1 | 0 | –1 | 70.55 |
| 16 | 0 | 0 | 0 | 81.80 |
| 17 | 0 | 1 | –1 | 69.56 |
| Source | Sum of squares | df | Mean square | F value | P value | Prob > F |
| Model | 849.87 | 9 | 94.43 | 38.54 | < 0.000 1 | significant |
| A: Malt sugar | 106.73 | 1 | 106.73 | 43.56 | 0.000 3 | |
| B: Beef extract | 1.69 | 1 | 1.69 | 0.69 | 0.433 3 | |
| C: Mg2+ | 4.59 | 1 | 4.59 | 1.87 | 0.213 4 | |
| AB | 3.53 | 1 | 3.53 | 1.44 | 0.268 8 | |
| AC | 1.60E–003 | 1 | 1.60E–003 | 6.53E–004 | 0.980 3 | |
| BC | 11.70 | 1 | 11.70 | 4.77 | 0.065 2 | |
| A2 | 359.56 | 1 | 359.56 | 146.74 | < 0.000 1 | |
| B2 | 130.91 | 1 | 130.91 | 53.43 | 0.000 2 | |
| C2 | 160.08 | 1 | 160.08 | 65.33 | < 0.000 1 | |
| Residual | 17.15 | 7 | 2.45 | |||
| Lack of fit | 16.70 | 3 | 5.57 | 49.48 | 0.001 3 | significant |
| Pure error | 0.45 | 4 | 0.11 | |||
| Cor total | 867.02 | 16 | ||||
| Note: s: 1.57; R-Squared: 0.980 2;x: 71.57; Adj R-Squared: 0.954 8; C.V.%: 2.19; Pred R-Squared: 0.691 0. | ||||||
响应面是各个因素对应的响应值所描述的三维曲面图，从响应面上可以看出各个因素之间的相互作用关系。本试验经RSM分析得到二次模型的特征值有正有负，响应曲面为马鞍曲面[20]。由图 1–3可以看出，该模型的响应面有真实的最大值。为了进一步验证最佳点的值，对回归方程取一阶偏导等于零，得到结果。当麦芽糖 (%)=0.07，牛肉膏 (%)=0.11，镁离子 (Mg2+, %)=0.04时，硫酸根转化率有最大值：81.83%。由响应面、等高线的变化趋势分析，在0.09%–0.105%之间时，硫酸根转化率呈上升的趋势，而0.105%–0.12%硫酸根转化率又逐渐下降；麦芽糖含量在0.05%– 0.075%之间时，硫酸根转化率呈上升的趋势，0.075%–0.1%之间时，硫酸根转化率下降；镁离子含量在0.035%–0.042 5%时，硫酸根转化率上升，0.042 5%–0.05%时硫酸根转化率呈下降趋势。牛肉膏和镁离子 (Mg2+) 的交互作用对硫酸根转化率的影响最大。
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| 图 1 牛肉膏和麦芽糖交互作用下的响应曲面图 (A) 和等高线图 (B) Figure 1 Response surface plots (A) and contour plots (B) showing interactive effects of malt sugar and beef extract |
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| 图 2 镁离子 (Mg2+) 和麦芽糖交互作用下的响应面曲图 (A) 和等高线图 (B) Figure 2 Response surface plots (A) and contour plots (B) showing interactive effects of malt sugar and Mg2+ |
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| 图 3 镁离子 (Mg2+) 和牛肉膏交互作用下的响应面曲图 (A) 和等高线图 (B) Figure 3 Response surface plots (A) and contour plots (B) showing interactive effects of beef extract and Mg2+ |
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为了验证优化结果的可靠性，按照响应面分析法预测的最佳培养基组成进行3次培养验证试验，硫酸根转化率平均可达82.17%，试验值非常接近理论最大值，模型与实际值拟合良好，说明该模型比较真实地反应出各个筛选因素对硫酸根转化率的影响，能够较好地预测实际培养条件。
2.6 菌株硫氧化效果验证利用室内模拟堆肥试验验证不同培养条件下耐高温假黄色单胞菌属 (Pseudoxanthomonas byssovorax HB3) 在堆肥应用中氧化硫的能力。由图 4可知，菌株Pseudoxanthomonas byssovorax HB3在堆肥中可以有效提高SO42−的含量。尤其是经过发酵条件的优化后其氧化硫的能力大幅提升。在堆肥1−3 d菌株需适应堆肥的高温环境，氧化能力较弱，T1和T2处理SO42−的含量略高于CK处理，第5天后经T2处理菌株氧化能力开始提升，T2处理SO42−的含量迅速增加，T1处理的SO42−含量也始终高于CK处理，最终堆肥结束时T2处理SO42−的含量为3.95 g/kg，比CK和T1处理分别高了高78.7%和34.3%，差异显著 (P < 0.05)。
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| 图 4 堆肥过程中各处理硫酸根含量变化 Figure 4 Changes of the SO42− concentration during 15 d composting |
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采用响应面分析法对影响耐高温假黄色单胞菌属 (Pseudoxanthomonas byssovorax) HB3的培养基配方进行优化，从而得到硫酸根最高的转化率：当麦芽糖为0.07%，牛肉膏为0.11%，镁离子 (Mg2+) 为0.04%时结果最优为81.83%。经回归方差分析得出试验模型的F值为52.60 (P < 0.000 1)，相关系数R2=0.980 2，说明该二次方程是显著的，该模型在整个回归区域内的拟合较好，可以用于分析和预测耐高温假黄色单胞菌属 (Pseudoxanthomonas byssovorax) 最优化培养基配方。从响应面、等高线的变化趋势分析，牛肉膏和镁离子 (Mg2+) 的交互作用对硫酸根转化率的影响最大。该菌株可耐受较高温度，经优化后该菌株硫氧化性能大幅提升，SO42−转化率达80%以上。经室内模拟堆肥试验验证优化前后的发酵菌液在堆肥中的硫氧化能力，经发酵条件优化后的Pseudoxanthomonas byssovorax HB3与基础发酵条件下菌液相比更加有效增加了堆肥中SO42−的含量，尤其在高温期效果显著，进一步说明经过发酵条件的优化该菌具有较好的产业化应用前景。
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