海洋作为地球上最大的生态系统，蕴含着丰富的生物基因资源^[1-2]。Shewanella菌属广泛分布于包括深海在内的各类环境中，具有强大的呼吸能力，能够使用十几种甚至几十种不同的电子受体进行厌氧呼吸，它们不仅能够利用锰铁等常见的金属氧化物，还能够利用很多不常见的金属或者非金属物质作为电子受体，例如铀、铬、锝、镎、钚、钒、碘、硒、碲等，甚至还有一些菌株能够还原芳香族化合物，这使得Shewanella菌属在环境生物修复 (如放射性污染的环境) 和微生物燃料电池方面有着巨大的应用潜力^[3-5]。

由于绝大多海洋微生物，特别是深海微生物无法在实验室操作环境下获得纯培养，因此，蛋白异源表达是获取深海生物基因资源的重要途径之一^[6-7]。但是目前常用的蛋白系统在表达深海来源蛋白时经常出现基因不表达、蛋白失活及形成包涵体等问题，这在很大程度上限制了深海生物基因资源的开发利用^[8-9]。目前已报道的唯一利用深海细菌构建表达系统的尝试来自于Photobacterium profundum SS9，其分离自2 500 m水深的深海沉积物。Lauro等利用接合转移自杀载体pEE3和表达载体pJN105中的元件构建了表达载体pFL190 (9 538 bp)，并用其在P.profundum SS9中表达了β-Galactosidase，活性检测发现其效率约为以Escherichia coli为宿主的18%^[10]。

深海细菌Shewanella piezotolerans WP3分离自西太平洋1 914 m水深的深海沉积物中，为兼性厌氧菌，能利用多种物质作为电子受体生长^[11-12]。其生长温度范围在0−28之间，压力范围0.1−50 MPa^[13]，可作为深海来源基因表达的良好宿主菌。前期的研究中，我们已经将WP3包含天然噬菌体SW1改造成为穿梭质粒pSW2 (表 1)，其可在大肠杆菌及希瓦氏菌中稳定复制^[14]。虽然该载体能够在WP3中表达异源蛋白，但是其中仍然存在一些非必需基因，可进一步进行最小化改造。另外，pSW2低温诱导效率偏低，缺少蛋白纯化标签，因此还需要进一步的优化。本研究通过对pSW2优化改造构建高效低温诱导表达载体pSW4，并且表达深海来源的聚合酶亚基。本研究得到的深海低温表达系统WP3-pSW4为今后环境污染物高效降解菌的构建提供了较好的工具和经验参考。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 实验菌株和质粒: 大肠杆菌 (Escherichia coli) DH5α、WM3064和BL21(DE3) 由本实验室保藏，WP3ΔSW1菌株 (不含有噬菌体SW1的S.piezotolerans WP3菌株) 由本实验室构建并保藏。穿梭质粒pSW2由本实验室构建，克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司，表达载体pSW4-01203 (包含sps01203编码序列的pSW4表达载体) 由本研究构建。

1.1.2 培养基: 2216E培养基 (g/L)：酵母膏1.0，蛋白胨5.0，NaCl 34.0，琼脂15.0，pH 7.0；LB培养基 (g/L)：酵母膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，琼脂15.0，pH 7.0；LCD培养基：LB培养基加0.1氯霉素贮存液和0.1% DAP (二氨基庚二酸) 贮存液。

1.1.3 主要试剂和仪器: 蛋白染色液 (5.0 g考马斯亮蓝R-250，100 mL甲醇，300 mL冰醋酸，去离子水至1 000 mL)；蛋白脱色液 (100 mL甲醇，300 mL冰醋酸，去离子水至1 000 mL)；5×SDS-PAGE电泳缓冲液 (3% Tris-HCl，1% SDS，14.4%甘氨酸，pH 8.3)；15%尿素变性缓冲液 (480 g 8 mol/L Urea，142.5 g丙烯酰胺，7.5 g甲叉丙烯酰胺，50 mL 10×TBE，去离子水至1 000 mL)；15% 8 mol/L尿素变性聚丙烯酰胺凝胶 (35 ml 15% 8 mol/L尿素变性缓冲液，220 ml 10% AP，17.5 ml TEMED)；核酸酶反应buffer (20 mmol/L Tris-HCl，0.2 mol/L NaCl，2 mmol/L DTT，2 mmol/L Mg²⁺，pH 8.0)；酶活反应终止液 (90% Formanide，0.25% SDS，0.25%溴酚蓝，100 mmol/L EDTA)；DNA限制性内切酶为TaKaRa公司产品；KOD酶为TOYOBO公司产品；DNA重组酶ClonExpress为Vazyme公司产品；质粒抽提和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Omega公司；RNase A、氯霉素、卡那霉素等均购自上海生工生物工程公司；其余试剂均为进口分装或国产分析纯。高压蒸汽灭菌锅GI54DW型，美国致微仪器公司；超净工作台ZHJH-C1115C型、恒温培养箱ZDP-2160型，上海智诚分析仪器制造有限公司；可见分光光度计UV-2550型，日本岛津公司；高速冷冻离心机CR21G Ⅲ型，日本HITACHI公司；恒温培养振荡器HZQ-X100型，江苏太仓市实验设备厂；酶标仪SYNERGY H1，美国BioTek仪器有限公司。

1.1.4 引物: 引物均由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成，引物序列见表 1。

1.2 实验方法

1.2.1 pSW2突变载体的构建: 设计引物从pSW2中扩增两端各含有一个Apa Ⅰ酶切位点的片段 (表 1)，PCR反应体系和条件参照KOD-Plus-Neo说明书，Apa Ⅰ酶切割PCR产物，反应条件参照TaKaRa Apa Ⅰ说明书，切胶回收上述酶切产物后，T4连接酶连接过夜，将连接产物转化感受态WM3064，涂布抗生素平板LCD 37培养，菌落PCR筛选阳性克隆划线至新的LCD平板，最后待划线平板长出克隆后酶切验证突变载体是否构建成功。

1.2.2 质粒转化E.coli: 提取质粒采用42热激 (DH5α/BL21：45 s；WM3064：90 s) 的方法转化到E.coli感受态细胞：将目的DNA (质粒：50 ng；重组片段：2 ng) 加入到50 µl感受态细胞 (冰浴融化) 中混匀并置于冰上30 min，转移到42水浴热激45/90 s，接着立即置于冰水中2 min，加入5倍体积的LB液体培养基 (感受态为WM3064时，需添加DAP缓冲液) 于37、200 r/min活化1 h，涂布在抗生素平板中培养过夜，最后筛选鉴定克隆子。

1.2.3 接合转移: 将包含有pSW2系列质粒的WM3064菌株和WP3菌株分别于LB+Chl⁺+DAP (LCD) 和2216E培养基中，37或20、200 r/min培养过夜。转接WM3064菌株于LB+DAP培养基、转接WP3于2216E培养基37培养5 h，按照1：2、1：1、2：1的比例混合两种菌液，分别取100 µl混合菌液点在2216E+DAP平板上，28避光放置24 h后用5 ml 2216E液体培养基冲洗平板，并将冲洗液涂布于2216E+Chl⁺平板并置于20培养72 h，筛选验证克隆子，将阳性克隆活化后保存。

1.2.4 GFP荧光强度检测接合转移: 分别将带有不同载体的WP3菌株在20 ℃/4 ℃、200 r/min培养至平台期，取菌液测试其荧光强度 (测定条件：酶标仪，25 ℃，激发波长为460 nm，发射波长为490 nm)^[10]，各实验重复3次，并计算标准差。

1.2.5 蛋白纯化: 4 ℃、8 000×g离心5 min收集菌液，加入Binding buffer重悬菌体并涡旋振荡均匀后超声破碎细胞，混合液经4 ℃、12 000×g离心15 min收集上清蛋白液，同时用Binding buffer平衡Ni柱，将收集的上清液缓慢流经平衡后的Ni柱后利用Washing buffer冲洗非特异结合的杂蛋白，咪唑洗脱液按照1 ml的量依次收集5管到4 ℃预冷的离心管内，最后将洗脱的蛋白上样SDS-PAGE检测。

1.2.6 蛋白脱盐处理: 蛋白脱盐采用GT-600微量离心脱盐柱：将脱盐柱放在2 ml收集管中1 000×g离心2 min去除储存液，用交换液平衡柱子后缓慢加入蛋白缓冲液样品，静置2 min让凝胶充分吸收样品，将柱子放到一个新的离心管中1 000×g离心4 min，收集脱盐后蛋白液。

1.2.7 DNA核酸酶活性测定: 首先在冰上加入如下反应体系：底物 (ssDNA/dsDNA) 1 µl，Reaction buffer 1 µl (Tris-HCl 20 mmol/L, NaCl 200 mmol/L, DTT 2 mmol/L, Mg²⁺ 2 mmol/L, pH 8.0)，蛋白纯化液0.5 µl (约0.5 mg/ml)，金属离子 (Mn²⁺/Ca²⁺/Co²⁺/ Mg²⁺/Ni²⁺/Cu²⁺) 20 mmol/L，去离子水6.5 µl，混合均匀后将体系置于15反应30 min，1：1加入反应终止液置于95 ℃ 5 min终止反应，最后上样Urea-denatured PAGE检测核酸酶活性。

2 结果与分析 2.1 鉴定pSW2中的非必需基因

穿梭载体pSW2 (6 451 bp) 由深海丝状噬菌体SW1改造而来，因而保留一些与载体复制无关的基因，如编码衣壳蛋白 (fpsC，fpsD) 和单链结合蛋白 (fpsB) 的基因 (表 2)。因此，我们首先对这些片段进行了缺失验证，从而确定pSW2中可以删减的序列。通过反向PCR的方法构建了单基因缺失的pSW2突变质粒pSW2ΔfpsB、pSW2ΔfpsC和pSW2ΔfpsD，多基因缺失的pSW2突变质粒pSW2ΔfpsCD和pSW2ΔfpsBCD。所得质粒转入E.coli WM3064菌株，经双酶切验证正确 (图 1) 后再通过接合转移导入WP3，根据接合转移是否成功判断该序列是否为pSW2复制所必需 (表 3)。

根据不同缺失突变载体的接合转移实验结果，判定pSW2质粒上可敲除片段包括fpsB、fpsC、fpsD。另外，fpsCD也可同时敲除。编码复制蛋白的基因fpsA敲除后，接合转移无法成功，说明fpsA对于pSW2在WP3中复制是必需的 (表 3)。

2.2 pSW2突变载体的表达能力检测

对于获得的一系列pSW2突变载体，以绿色荧光蛋白GFP为报告基因对它们在低温下的蛋白表达能力进行了检测。需要指出的是，pSW2原来所用的是噬菌体自身的启动子 (PfpsA)，其存在着强度较低的问题。为了提高低温下启动子的强度，在pSW2突变载体中加入了编码冷激蛋白基因的启动子 (PcspA)。结果显示，加入PcspA后，pSW2的表达能力确实有部分提高。更显著的是，fpsB基因敲除后，pSW2突变载体 (pSW2ΔfpsB-PcspA) 的GFP强度较原始载体极大地提高。其中20条件下增加2.7倍，4条件下增加10.7倍 (图 2)。

2.3 pSW4载体的构建

在以上工作的基础上，对表达载体pSW2进行了一系列的改造，包括敲除fpsB基因，添加强启动子PcspA及RBS位点，添加多克隆位点Multiple cloning site (MCS) 和6×His标签方便外源蛋白N-末端、C-末端连接标签以供蛋白纯化 (图 3)。以上全长为101 bp的序列通过全基因合成，然后用同源重组的方法克隆到PcspA启动子的尾部。最终完成了全部的改造，新的载体命名为pSW4 (NCBI GenBank登录号KX296734)，其全长为6 623 bp。

2.4 深海来源基因sps01203基因克隆及蛋白表达纯化

为了验证pSW4的可用性，我们选择了深海嗜冷细菌Shewanella psychrophila WP2中的基因sps01203 (编码DNA聚合酶Ⅲ的ε亚基)，其全长为729 bp。将片段克隆至pSW4，双酶切验证正确 (图 4A)。构建的表达载体pSW4-01203通过接合转移到WP3中，得到表达菌株WP3-pSW4-01203。按照1：100的比例接种于锥形瓶中培养 (2216E培养基，20℃、200 r/min) 约12 h，待菌株生长至平台期 (OD₆₀₀=3.5) 将锥形瓶转移至4低温诱导36 h，最后高速离心收集菌体，提取蛋白并通过SDS-PAGE检测目的条带。结果显示目的条带单一，且大小与理论值一致 (图 4B)。蛋白纯化后计算其得率为11.13 mg/L。

2.5 Sps01203蛋白的活性检测

DNA聚合酶Ⅲ的ε亚基一般具有核酸酶活性。分别以双链和单链DNA作为底物通过Urea-denatured PAGE检测 (图 5) 发现，在金属离子Mn²⁺存在的条件下，Sps01203蛋白具有切割dsDNA的核酸酶活性。而在金属离子Mn²⁺和Mg²⁺存在的条件下，Sps01203蛋白具有切割ssDNA (图 6) 的核酸酶活性。以上结果说明，通过pSW4能表达出可溶蛋白，且具有活性。

3 结论

Shewanella piezotolerans WP3分离自深海环境，是良好的低温蛋白表达宿主菌。其天然丝状噬菌体SW1具有低温诱导的特征，已被改造成能在E.coli和Shewanella不同菌株中穿梭的质粒pSW2，但是其作为一个功能完全的表达载体还需要进一步地改造完善^[14]。通过对pSW2的敲除实验发现，单链结合蛋白FpsB的缺失不影响pSW2在WP3中的复制，同时其低温条件下蛋白表达能力显著提高。在此基础上构建的表达载体pSW4与pSW2大小相当，但包括了强启动子和蛋白纯化标签。通过深海细菌WP2的聚合酶Ⅲ ε亚基 (Sps01203) 的表达和体外活性检测，证实了pSW4的实用性。本研究构建的WP3-pSW4系统是国内首次利用深海来源的菌株和质粒构建低温蛋白表达系统。与来自于南极海水中的低温表达系统 (Shewanella sp. Ac10-pJRD215) 相比^[15]，WP3-pSW4系统在20条件下表达效率相当，4℃条件下表达效率更高；而与同样来自于深海的P.profundum SS9-pFL190系统相比^[10]，其优势包括宿主菌基因组更小 ( < 19%)、接合转移效率更高 ( > 4.5×10²)、温度范围更宽 (0−28、生物量更高 (10倍)，因而具有较好的应用潜力。

海洋是地球最大的生态系统，而深海是海洋的主要组成部分，具有黑暗、高压、低温、寡营养等极端环境，蕴含着丰富的生物基因资源^[16]。对这些基因资源利用工具，如蛋白表达系统的开发改造不仅对了解微生物的极端环境适应性机理具有重要的意义，还能够促进对于海洋生物基因资源的有效开发利用。WP3能够耐受多重极端环境，特别是具有良好的低温生长能力并能够利用多种物质作为电子受体^[11-13]，因此是构建环境污染物降解菌的良好材料。本研究中构建的深海蛋白表达载体pSW4与WP3具有天然的适配性^[17-18]，可用来高效表达一些与污染物降解相关的基因簇。今后将尝试利用该系统进行相关的应用性研究。