微生物学通报  2017, Vol. 44 Issue (4): 845−851

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杨颖, 张伟, 区炳明, 夏芃芃, 石宝兰, 张建军, 朱国强
YANG Ying, ZHANG Wei, OU Bing-ming, XIA Peng-peng, SHI Bao-lan, ZHANG Jian-jun, ZHU Guo-qiang
猪源大肠杆菌Nissle 1917菌株的分离鉴定
solation and identification of porcine-originated Escherichia coli Nissle 1917
微生物学通报, 2017, 44(4): 845-851
Microbiology China, 2017, 44(4): 845-851
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160296

文章历史

收稿日期: 2016-04-12
接受日期: 2016-10-27
优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-11-08
猪源大肠杆菌Nissle 1917菌株的分离鉴定
杨颖1,2Δ, 张伟1,2,3Δ, 区炳明1,2, 夏芃芃1,2, 石宝兰1,2,3, 张建军1,2,3, 朱国强1,2     
1. 扬州大学兽医学院    江苏 扬州    225009;
2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心    江苏 扬州    225009;
3. 国药集团扬州威克生物工程有限公司    江苏 扬州    225009
摘要【目的】 证实大肠杆菌Nissle 1917作为自然菌株存在于动物猪体内,并能从猪粪便中分离。建立大肠杆菌Nissle 1917的原位杂交鉴定方法。 【方法】 采集135份健康断奶仔猪的新鲜粪便制备DNA模板,以人源大肠杆菌Nissle 1917为阳性对照菌株,分别针对Nissle 1917的Ⅰ型菌毛亚单位FimA、F1C菌毛亚单位FocA及两个质粒pMUT1和pMUT2的相关基因序列设计5对特异性引物进行PCR扩增;并将其中427 bp大小的质粒片段pMUT2 (a) 作为目的片段回收纯化,用地高辛随机引物标记法制成DNA探针。 【结果】 从其中的2份DNA模板中扩增出上述5对特异性引物PCR预期大小相符的片段,初步认为大肠杆菌Nissle 1917可能存在于猪体内。应用制备的探针通过菌落原位杂交的方法从2份阳性粪便样品中筛选出2株阳性菌落,通过血清学检验、PCR扩增和测序进一步鉴定为阳性Nissle 1917菌株。 【结论】 动物源益生菌Nissle 1917的分离鉴定,为优良动物源益生菌研究和应用奠定了基础。
关键词大肠杆菌Nissle 1917     分离鉴定     地高辛标记探针     菌落原位杂交    
solation and identification of porcine-originated Escherichia coli Nissle 1917
YANG Ying1,2Δ, ZHANG Wei1,2,3Δ, OU Bing-ming1,2, XIA Peng-peng1,2, SHI Bao-lan1,2,3, ZHANG Jian-jun1,2,3, ZHU Guo-qiang1,2     
1. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu 225009, China;
2. Jiangsu Co-Innovation Center for Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou, Jiangsu 225009, China;
3. Yangzhou Vacbio Bio-engineering Co., Ltd, Yangzhou, Jiangsu 225009, China
Received: April 12, 2016; Accepted: October 27, 2016; Published online(www.cnki.net): November 08, 2016
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No.31672579, 30571374, 30771603, 31072136, 31270171); Project Funded by the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions; The Genetically Modified Organisms Technology Major Project of China (No.2014ZX08006-001B)
ΔThese authors equally contributed to this work
*Corresponding author: ZHU Guo-Qiang, Tel: 86-514-87972590;E-mail: yzgqzhu@yzu.edu.cn.
Abstract: [Objective] To verify that Escherichia coli Nissle 1917 also exists in swine as a natural isolate and could be isolated from swine faeces. The method for identifying the Escherichia coli Nissle 1917 using in situ hybridization was established. [Methods] All 135 pieces of fresh faeces from healthy weaned piglets were collected to prepare DNA template samples. And the DNA template samples were screened and tested by PCR with five pairs of specific primers targeting the chromosomal genes encoding the major fimbrial subunit FimA (type 1 fimbriae) and FocA (F1C fimbriae), and the two cryptic plasmids pMUT1 and pMUT2, and mean while the human E.coli Nissle 1917 was chosen as the positive control. The 427 bp-long plasmid fragment named pMUT2 (a) was purified from the gel and made into DNA probe using digoxigenin random primer labeling. [Results] The PCR result showed that the expected fragments of the five specific primers target were amplified from the two of 135 DNA template samples and the potential presence of Nissle 1917 in pigs was initially confirmed. Using the method of in situ hybridization with prepared pMUT2 (a) probe, two positive strains were screened from the two positive faecal samples. Two positive clones were finally confirmed as positive strains of Nissle 1917 through further experiments of serological test, PCR and sequencing. [Conclusion] The isolation and identification of swine-originated probiotics Nissle 1917 laid a foundation for further study and application of excellent animal originated probiotic.
Key words: Escherichia coli Nissle 1917     Isolation and identification     Digoxigenin-labeled nucleic acid probe     Colony in situ hybridization    

益生菌 (Probiotics) 又称微生态调节剂,能够改善肠道内菌群的生态平衡,是对宿主有益的活性微生物制剂[1]。其具有抗感染、抗肿瘤、抗衰老、免疫赋活、促营养消化等多种功效,在牛奶中添加益生菌可改善消化功能,促进胃肠蠕动,减轻人体乳糖不耐受症,防止婴幼儿的腹泻和消化不良,有益于婴幼儿的健康[2-5]。在医学临床上,益生菌治疗急慢性肠炎、痢疾及结肠炎,已取得良好的预防和治疗效果[6-7]。由于益生菌剂无毒性、无残留、无污染,能克服使用抗生素引起的菌群失调和二重感染,避免滥用抗生素产生的不良后果[8]

大肠杆菌Nissle 1917 (Escherichia coli Nissle 1917,EcN) 是由德国科学家Alfred Nissle于1917年发现的一种益生菌,其血清型为O6:K5:H1。实验证明EcN可以改善肠道菌群结构,抑制病原菌的生长,提高机体免疫力[9-10]。国外应用该EcN制剂治疗肠炎患者取得良好的治疗效果[11-12],并且临床上也应用于治疗新生犊牛腹泻[13],但其对猪的益生作用和安全性尚无相关研究。Blum-Oehler等依据人源性EcN的Ⅰ型菌毛亚单位FimA、F1C菌毛亚单位FocA及两个质粒pMUT1和pMUT2的基因序列,分别设计出5对特异性的PCR引物用于检测人源性EcN,应用这5对引物对大肠杆菌K-12、粪便和环境中的大肠杆菌、大肠杆菌O6:K5血清型、肠道内 (致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌) 和肠道外 (尿道致病性大肠杆菌、脑膜炎大肠杆菌、败血性大肠杆菌) 菌株进行检测,结果显示,依据质粒序列设计的3对引物,在上述大肠杆菌中,通过PCR扩增出目的条带的比率较低,所以这3对引物更适合用来特异性地鉴别EcN菌株[14]。Kleta等[15]曾用上述特异性PCR引物从猪肠道粪便制备的DNA样品中PCR扩增检测到EcN。国内尚无EcN存在于猪体的相关研究报道。本实验利用PCR扩增检测到仔猪粪便内EcN的存在,采用菌落原位杂交从仔猪粪便内筛选到猪源EcN菌株,为优良动物源EcN菌株应用研究奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

人源大肠杆菌EcN (O6:K5:H1) 和大肠杆菌DH5α由本实验室保存。

1.2 主要试剂和仪器

胰蛋白胨 (Tryptone)、酵母提取物 (Yeast extract),Oxoid公司;Taq DNA聚合酶、氨苄青霉素,生工生物工程 (上海) 股份有限公司;pMD18-T simple vector、DNA凝胶回收试剂盒、DL2000 DNA marker,宝生物工程 (大连) 有限公司;限制性内切酶Sal I和BamH I,New England Biolabs (NEB) 公司;地高辛杂交标记检测试剂盒、Expand Long Template PCR System,Roche公司;T4 DNA连接酶,Promega公司。恒温摇床,太仓实验设备厂;电热干燥培养箱,南京实验仪器厂;DYY605稳压稳流电泳仪,南京新校园生物技术研究所;DNA凝胶成像仪,美国Bio-Rad公司。

1.3 PCR引物

参考Blum-Oehler等[14]针对人源性大肠杆菌EcN的Ⅰ型菌毛亚单位FimA、F1C菌毛亚单位FocA及两个质粒pMUT1和pMUT2的基因序列共合成5对PCR引物 (表 1),由上海基康生物工程有限公司合成。

表 1 PCR扩增所用引物 Table 1 Primers used for PCR amplification
引物名称
Primers
引物序列
Sequences (5′→3′)
长度
Sizes (bp)
fimA+ ATACTACGACGGTAAATGGT 20
fimA TACATCAGTATCGGTAGCAT 20
focA+ CCACGGTTAGGTGTGGTACA 20
focA CGTCGGCGTTGGCAATACCA 20
pMUT1+ AACTGTGAAGCGATGAACCC 20
pMUT1− GGACTGTTCAGAGAGCTATC 20
pMUT2(a)+ GACCAAGCGATAACCGGATG 20
pMUT2(a)− GTGAGATGATGGCCACGATT 20
pMUT2(b)+ GCGAGGTAACCTCGAACATG 20
pMUT2(b)− CGGCGTATCGATAATTCACG 20
注:+:正向引物;−:反向引物.
Note: +: Forward primer; −: Reverse primer.
1.4 粪便样品的处理

粪便样品采集于扬州市瘦肉型猪繁殖场,选定1−3月龄健康猪135头 (该猪场未饲喂大肠杆菌EcN),用灭菌竹签刮取刚排出的新鲜粪便,置于灭菌的玻璃瓶中。将采集的仔猪粪便分别取1 g置于盛有10 mL灭菌生理盐水的试管中,200 r/min振荡

10 min充分混匀,然后静置1 h,取上清10倍梯度稀释 (10−1–10−3),分别从中取100 µL涂布LB[16]平板,37 ℃恒温培养16 h。

粪便样品的PCR模板制备选择含有500−5 000个菌落的LB平板,用10 mL PBS冲洗平板上的全部菌落,混匀后从中吸取1 mL菌液,用无菌超纯水洗涤2次。最后悬浮于100 µL灭菌超纯水中,100 ℃煮沸5 min,冷却至室温后4700×g离心10 min,取上清作为待检样品模板,−20 ℃保存。

1.5 PCR扩增5条靶向目的片段

用上述表 1中5对引物对样品模板进行扩增,50 µL PCR反应体系:超纯水38.4 µL,10×PCR buffer 5 µL,dNTP mix (2.5 mmol/L) 2 µL,上下游引物 (20 µmol/L) 各1 µL,待检样品模板2 µL,Taq酶 (5 U/µL) 0.6 µL。PCR反应条件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,54 ℃ 40 s,72 ℃ 30 s,25个循环;72 ℃ 8 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 探针的纯化及标记

回收PCR扩增出的pMUT2 (a) 片段后,与pMD18-T载体连接,转入大肠杆菌DH5α感受态中,提取重组质粒酶切鉴定并测序验证,将阳性重组菌株命名为DH5α/pM-MUT2 (a)。大量提取质粒pM-MUT2 (a),Sal I和BamH I双酶切,回收pMUT2 (a) 片段并定量,按地高辛杂交标记检测试剂盒说明进行标记。具体方法如下:取10−3000 ng回收的pMUT2 (a) 片段溶于装有15 µL双蒸水的反应管中,沸水中加热10 min使DNA变性,然后迅速在冰水中冷却;加入dNTP标记混合底物2 µL、随机引物混合物2 µL、Klenow酶1 µL于上述变性DNA中,混匀并瞬时离心将反应液收集到管底,37 ℃反应12 h,65 ℃加热10 min终止反应。

1.7 菌落原位杂交及检测程序

按照地高辛杂交标记检测试剂盒操作手册流程进行杂交及显影:将硝酸纤维素膜 (NC膜) 小心放置于含有阳性菌落的琼脂平板表面1 min,并对应菌落位置一一做好标记。随后用钝头小镊子小心把NC膜从琼脂平板上轻轻剥离,菌落面朝上,将NC膜置于变性液 (0.5 mol/L NaOH,1.5 mol/L NaCl) 中15 min;经空气干燥后,再置于中和液 (1.5 mol/L NaCl,1.0 mol/L pH 7.4 Tris-HCl) 中孵育15 min;空气干燥后,把NC膜转入2×SSC中洗膜10 min,80 ℃干烤30 min;再将NC膜在37 ℃的蛋白酶K溶液 (将14−22 g/L蛋白酶K用2×SSC以1:10的比例稀释) 中孵育1 h以除去细菌碎片;将NC膜放入62 ℃的杂交缓冲液中预杂交,温和搅拌30 min;再转入杂交液 (含地高辛标记探针的预杂交液) 中温和搅拌过夜;随后用2×SSC和0.1% SDS在室温下洗膜2次,15 min/次且不断搅拌;再用0.1×SSC和0.1% SDS在65−68 ℃洗膜2次,15 min/次且不断搅拌,随后将膜依次置于洗涤缓冲液冲洗5 min,阻断液孵育30 min,抗体溶液孵育30 min,洗涤缓冲液洗涤30 min,检测缓冲液平衡5 min处理;最后,在暗室中,将膜转入10 mL新制的显色液中反应5 min,显色完成后用TE缓冲液洗涤5 min,照相记录结果。

1.8 特异性检测

阴性对照菌为大肠杆菌EPEC、K88ac和K88ab,阳性对照菌为人源性大肠杆菌EcN,将细菌固定于NC膜后按1.7方法进行杂交显色。

1.9 敏感性检测

紫外分光光度计测定回收目的片段的浓度,进行5倍梯度稀释,各稀释度每1 µL终浓度分别为2000、400、80、16、3.2和0.64 pg。将各稀释度DNA变性后取1 µL点样于NC膜,按1.7方法进行杂交显色,判定结果。

1.10 筛选阳性菌落

将两块含阳性菌落平板上的细菌按顺序转接入新的LB平板,培养过夜后,转移到NC膜,按建立的方法进行原位杂交筛选阳性菌落。

1.11 阳性菌落进一步验证

血清学验证参考陆承平[17]的方法。将筛选出的阳性菌株与标准的大肠杆菌O、K、H诊断血清进行玻片凝集实验,验证其血清型。

PCR方法扩增目的片段并测序鉴定。对筛选出的阳性菌株按照1.5的方法扩增特异性片段,并把目的片段回收纯化后连接pMD18-T载体,送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

2 结果与分析 2.1 PCR扩增检测仔猪粪便样品中的EcN

从采集的仔猪粪便样品中检测出2份含有EcN,其模板DNA中皆扩增出5条靶向目的片段,产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,长度大小与预期结果相一致 (图 1)。

图 1 阳性仔猪粪便样品模板DNA经PCR扩增产物电泳图 Figure 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products from positive porcine faeces samples 注:M:DL2000分子量标准;1、3、5、7、9:人源性EcN;2、4、6、8、10:阳性粪便样品. Note: M: DL2000 DNA marker; 1, 3, 5, 7, 9: human-originated EcN; 2, 4, 6, 8, 10: positive faeces samples.
2.2 EcN原位杂交检测方法的建立

2.2.1 pMUT2 (a) 片段的扩增: 由于引物pMUT2 (a) 在多种大肠杆菌中均未扩增出目的条带[14],因此选择该对引物的PCR产物作为鉴定EcN的探针序列。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,得到427 bp的目的条带 (图 2)。

图 2 pMUT2 (a)片段电泳图 Figure 2 Agarose gel electrophoresis of pMUT2 (a) fragment 注:M:DL2000分子量标准;1:pMUT2 (a) 片段. Note: M: DL2000 DNA marker; 1: pMUT2 (a) fragment.

2.2.2 重组质粒pM-MUT2 (a) 的构建与鉴定: 将回收的PCR产物经过Sal I和BamH I进行双酶切后,与同样经过双酶切的pMD18-T质粒连接。将连接产物转化到DH5α感受态细胞中。通过PCR和双酶切两种方法对阳性克隆进行鉴定。经Sal I和BamH I双酶切重组质粒,酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,分别得到与预期大小一致的2.7 kb和427 bp目的条带 (图 3)。

图 3 重组质粒pM-MUT2 (a)的酶切鉴定 Figure 3 Identification of recombinant pM-MUT2 (a) by restriction enzymes digestion 注:M:λDNA/Hind Ⅲ marker;1:重组质粒pM-MUT2经Sal I和BamH I双酶切产物. Note: M: λDNA/Hind Ⅲ marker; 1: The product of recombinant pM-MUT2 (a) double-digested with Sal I and BamH I. (a) fragment.

2.2.3 pMUT2 (a) 核酸探针的制备与特异性检测: 提取pM-pMUT2 (a) 重组质粒,将重组质粒的双酶切产物回收后进行定量。根据地高辛杂交标记检测试剂盒说明书对DNA片段进行地高辛标记。为了检测探针的特异性,用地高辛标记探针分别与EPEC、K88ac、K88ab和人源大肠杆菌EcN核酸进行杂交反应,图 4结果显示,该探针只与人源EcN的核酸出现阳性杂交信号,而与EPEC、K88ac、K88ab的核酸杂交结果均为阴性。

图 4 地高辛标记探针特异性试验结果 Figure 4 The result of specificity assay of digoxigenin- labeled nucleic acid probe 注:1:人源性EcN;2:EPEC;3:K88ac;4:K88ab. Note: 1: Human-originated EcN; 2: EPEC; 3: K88ac; 4: K88ab.

2.2.4 pMUT2 (a) 核酸探针敏感性检测: 将胶回收的PCR扩增产物定量后进行梯度稀释,点样于膜上,用地高辛标记的核酸探针进行杂交,该探针对核酸的最低检出量约16 pg (图 5)。

图 5 地高辛标记探针敏感性试验结果 Figure 5 The result of sensitivity assay of digoxigenin- labeled nucleic acid probe Note: 1: 2 000 pg; 2: 400 pg; 3: 80 pg; 4: 16 pg; 5: 3.2 pg; 6: 0.64 pg.
2.3 菌落原位杂交筛选阳性菌落

粪便样品上清经稀释涂板,对PCR检测含有阳性菌平板上的菌落进行原位杂交,设置人源EcN作为阳性对照。结果表明,有两个菌落位点显色 (图 6)。

图 6 地高辛标记探针菌落原位杂交结果 Figure 6 The result of colony in situ hybridization with digoxigenin-labeled nucleic acid probe 注:1:人源性EcN;2、3:猪源性EcN. Note: 1: human-originated EcN; 2, 3: porcine-originated EcN.
2.4 阳性菌株进一步验证结果

为了进一步确证阳性菌落为EcN,分别采用血清学和PCR方法进行验证。血清学鉴定结果表明,菌落原位杂交筛选出的两株阳性菌株O抗原、K抗原和H抗原分别为O6、K5和H1,与EcN血清型报道结果一致。5条特异性引物PCR扩增的目的条带与预期大小一致 (图 7),扩增片段经测序,与GenBank中EcN对应基因序列100%符合。证明筛选的菌株为猪源性EcN。

图 7 两株猪源EcN菌株的PCR扩增电泳图 Figure 7 Agarose gel electrophoresis of PCR products from two porcine-originated EcN samples 注:M:DL2000分子量标准;1、4、7、10、13:人源性EcN;2、5、8、11、14:猪源性EcN1;3、6、9、12、15:猪源性EcN2. Note: M: DL2000 DNA marker; 1, 4, 7, 10, 13: human-originated EcN; 2, 5, 8, 11, 14: porcine-originated EcN1; 3, 6, 9, 12, 15: porcine-originated EcN2.
3 讨论

生物化学、表型和基因型鉴定方法可用于鉴别EcN菌株[18-19],但耗时较长。PCR方法简便、敏感、快速并且对标本的纯度要求不高[20],大大减轻样品采集过程的负担。本实验参考Blum-Oehler等[14]针对人源性大肠杆菌EcN基因序列设计的5对PCR引物,但对PCR反应程序进行了优化,降低了退火温度以及减少变性、退火、复性时间和循环数,确保PCR在较好的特异性和产物量的基础上缩短了反应时间。然而用PCR方法从复杂样本,比如粪便样品中筛选特定菌株较耗时且工作量大,而菌落原位杂交法更适用于复杂样本中特定菌种的筛选[21]

因此本实验选用pMUT2 (a) 特异性引物PCR扩增、纯化回收的片段制备地高辛标记探针,采用菌落原位杂交法筛选EcN菌株。菌落原位杂交将平板上单个菌落转移到NC膜上,通过碱裂解使细菌释放出DNA并经干烤固定于膜上,其再与标记探针特异结合,完成对靶序列DNA的测定[22]。实验中杂交时间过短会造成杂交不完全,而过长则会增加非特异性,因此优化杂交条件显得尤为重要,作者在预实验中对杂交的温度和时间进行了调节,选定62 ℃预杂交30 min,然后杂交过夜,同时选用蛋白酶K去掉除细菌核酸外其他物质的干扰以得到清晰的杂交信号。刘方娜等制备的地高辛标记探针对猪圆环病毒2型DNA的最低检测量为10 pg[23],陈清等制备的地高辛探针对产不耐热肠毒素大肠杆菌DNA的最低检出量为5 pg[24],本文所用的地高辛探针对人源EcN核酸的最低检出量约16 pg,相比以上结果敏感性较低,这将在后续实验中进行条件优化以待进一步提高。该探针与EPEC、K88ac、K88ab核酸杂交均呈现阴性,具有较强特异性。

EcN在国外仅获准用于人及牛的医疗应用[11-13, 25],已发表的文献显示国内畜牧业暂无在临床使用商品化大肠杆菌EcN,国内唐志如实验团队仅于2014年报道了EcN菌株作为口服益生菌对仔猪空肠黏膜屏障功能的相关调控[26-27]的实验室试验,此研究表明EcN能提高断奶仔猪生长性能和降低断奶仔猪腹泻率,为益生菌EcN应用于养猪生产提供了相关实验论证。到目前为止,国内仍没有EcN在养猪生产实际应用的相关报道。Kleta等对EcN在德国境内7个不同猪群的存在情况进行调查,从7个猪群中共抽取35只个体,采集其粪便进行检测,在其中的1个个体养殖户 (仅饲喂15只猪只) 抽取的5只猪中有3只粪便呈现EcN特异性PCR结果阳性,但其他6个猪群均未检测到EcN。这可能是由于EcN呈现地方性存在,或者由于人类的偶然传播而进入猪只体内[15]。为了调查EcN是否也存在于国内猪只中,作者在开展实验前对实验样品来源猪场中EcN菌株的使用情况进行过调研,该猪场无饲喂大肠杆菌EcN的记录,本研究从猪粪便中分离到的EcN菌株是自然条件下存在于猪只体内的,因此将其称为“自然菌株”。分离的两株猪源EcN与人源EcN的遗传亲缘关系以及益生功能有待验证,并将进一步探索该猪源EcN作为猪体内靶向投递外源抗原和药物的载体菌以及调节猪肠道微生态菌群的益生菌。

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