2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 杨秀清, 吴瑞薇, 韩作颖, 王保玉
- YANG Xiu-Qing, WU Rui-Wei, HAN Zuo-Ying, WANG Bao-Yu
- 基于mcrA基因的沁水盆地煤层气田产甲烷菌群与途径分析
- Analysis of methanogenic community and pathway of coalbed methane fields in the Qinshui Basin based on mcrA gene
- 微生物学通报, 2017, 44(4): 795-806
- Microbiology China, 2017, 44(4): 795-806
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160955
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文章历史
- 收稿日期: 2016-12-27
- 接受日期: 2017-01-19
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2017-01-20
2. 煤与煤层气共采国家重点实验室 山西 晋城 048000;
3. 易安蓝焰煤与煤层气共采技术有限责任公司 山西 晋城 048000
2. State Key Laboratory of Coal and CBM Co-mining, Jincheng, Shanxi 048000, China;
3. Yi'an Lanyan Coal and Coal-bed Methane Simultaneous Extraction Technology Co., Ltd, Jincheng, Shanxi 048000, China
自工业革命以来，煤作为一种广泛的资源应用于许多方面，世界总的化石燃料约有71.4%以煤的形式储藏[1]。煤层气 (CBM) 是在煤层中以自生自储形式存在的一种非常规天然气[2]，其主要成分为甲烷。CBM在煤化作用下的形成机制有两种，即热成因和生物成因，热成因主要受煤阶和煤层深度控制；生物成因则由多种因素调控，如盐度、微生物的可利用性、煤的渗透性、物化特性等，而微生物被认为是生物成因煤层气形成的关键因素[3-6]。CBM作为一种非常规的新型清洁能源，近年来受到国内外许多研究学者的关注，尤其是生物成因煤层气的开采和利用，为已有煤层气田的可持续利用提供了有力的事实依据。已有研究报道，在实验室模拟及煤层气田，通过微生物分子生态学分析微生物群落，同时利用生物添加和生物刺激促进煤的生物转化，从而产生生物气[7-8]，这些研究将有助于解析生物成因气的形成机理。研究上述问题的首要任务是明确微生物群落中由哪些微生物参与煤的生物降解。
2007年始，Shimizu等首次报道了煤层气田的微生物多样性，其选择日本北海道煤层气田产出水为研究对象，通过16S rRNA基因文库的构建解析了产出水中细菌和古菌群落多样性[9]。随着微生物分子生态学的发展，煤层气田产出水和煤中微生物多样性的表征有了很大的突破，有通过系统发育研究煤层气田相关微生物多样性的，如构建16S rRNA基因文库，例如以烟煤为主的美国伊利诺斯州盆地[10]、含褐煤煤层的加拿大西部[11]和亚烟煤为主的美国粉河盆地[12]；也有通过克隆文库的构建同时结合实时荧光定量PCR对古细菌总细胞数定量来分析微生物群落多样性的[13]；还有采用PCR-DGGE指纹技术对微生物群落直观快速检测的[14]，这些方法均有不同程度的局限性。高通量测序技术由于具有数据容量大，从而弥补了上述手段的不足，该技术有助于更加全面地解析微生物群落组成，成为研究者的首选。
甲基辅酶M还原酶 (MCR) 是甲烷生产所必需的酶，它催化甲烷生成的最后一步，还原一个甲基基团连接到辅酶M形成甲烷，这种酶在所有已知的产甲烷菌中被发现[15]。MCR操作子有两种形式：MCRⅠ编码mcrA基因，MCRⅡ编码mrtA基因，MCRⅠ出现在所有的产甲烷菌中，MCRⅡ仅在甲烷杆菌目 (Methanobacteriales) 和甲烷球菌目 (Methanococales) 中发现[16]。因此mcrA基因常被用作一个特异的功能基因用于定量产甲烷菌。根据甲烷生成过程中产甲烷菌所利用的代谢底物类型，可将产甲烷菌分成3个营养型，即氢营养型、甲基营养型和乙酸营养型[17]。从2008年开始，mcrA基因开始被用作靶标研究环境微生物的多样性，如沉积水、淤泥、沼气池和少量的煤气田中。如Guo等在研究高阶煤层甲烷古菌多样性时，采用mcrA基因克隆文库法[18]，分析两口煤层气井出水样的微生物。在Guo等的报道中，所有的克隆子均属于Methanobacterium，菌群结构单一，没有挖掘出其他已命名的甲烷古菌或是未鉴定的菌属。该研究没有从mcrA基因的角度全面揭示高阶煤地质环境的甲烷古菌，使理解煤层甲烷的生物成气机理受到一定的限制。所以基于mcrA基因，全面地认识煤地质甲烷菌群及其组成就显得尤为必要。
在本研究中，我们以山西沁水盆地煤层气田为研究对象，该地区为典型的高煤阶区域，也是我国煤层气田开采最为活跃的地方。实验从寺河 (SH) 和亚行 (YH) 两个矿区取样，基于mcrA功能基因，采用454焦磷酸高通量测序检测不同煤层气井产出水中的产甲烷菌。在煤层气田产气微生物研究中，很少利用mcrA基因进行高通量测序分析来表征产甲烷菌群结构特征，本文为生物成因气相关微生物多样性的研究在方法和全面深入理解生物成气机理方面提供了可参考依据。
1 材料与方法 1.1 样品采集产出水样品的采集在产气井的排水口完成。实验采集了5口煤层气井中的出水样，分别是SHX-181、SHJM-30、SHX-203、YH13-24和ZXCC-09，井位示意图如图 1所示。为方便标记，依次编号为A、B、C、D和E，其中，A、B、C和E来自于同一矿区，即寺河；样品D取自亚行。产出水首先由煤层气生产设备通过钢管从井下采抽到地面，由排水口排出，同时为防止空气及钢管的污染，在采集水样前，不断抽取产出水3 d以上，然后将水样收集在5 L的无菌样品桶中，水样灌满排除桶内空气，用橡胶塞封紧瓶口，最后将收集好的水样放置在冰上，快速运回实验室。将收集的产出水样品用0.22 μm膜过滤器 (Millipore，USA) 无菌过滤，在–80储存用于基因组DNA的提取。
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| 图 1 取样井位示意图 Figure 1 Location of wells providing samples for study of the formation water 注：A、B、C和E样品属于寺河矿区，D样品属于亚行矿区. Note: The A, B, C and E water samples from the SH block, sample D was collected from YH block. |
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胶回收试剂盒，中科瑞泰 (北京) 生物科技有限公司；蛋白酶K，生工生物工程股份有限公司；SDS，北京索莱宝科技有限公司；DNA聚合酶，北京全式金生物技术有限公司。0.22 μm膜过滤器，美国Millipore；机械振荡器Mini-Bead Beater，BioSpec Products，USA；PCR仪，美国伯乐公司PTC-200型 (PTC-200，Bio-Rad，USA)；酶标仪，美国伯腾仪器有限公司 (BioTek，USA)。
1.3 煤层出水样基因组DNA的提取为了分析不同位点井产出水的产甲烷菌群结构变化，5口井的产出水样DNA被提取。由于煤层水样中成分复杂，腐殖酸、吸附性颗粒物质等有影响，为得到高质量的基因组DNA，对提取方法进行优化。在基因组的提取过程中，细胞破碎为关键步骤，实验采用机械破碎、化学破碎与酶解法相结合的破碎方法得到了较高质量的基因组。首先将附有产出水菌体的滤膜剪碎，置于10 mL STE缓冲液中 (1 L STE缓冲液的配制：NaCl 60 g，20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L EDTA)；然后将含有菌体的缓冲液移入装有0.6 g玻璃珠的预冷螺旋帽管中，用Mini-Bead Beater (MBB) 对菌体进行破碎，重复2–3次，每次2 500 r/min离心30 s。重复过程中每次将上清液移至新的Ep管后，再向螺旋帽管中加满STE缓冲液，破碎后将上清与之前的上清液合并；再次加入蛋白酶K和SDS继续对菌体进行消化；之后按常规步骤进行基因组DNA的抽提、纯化及沉淀；最后加入超纯水溶解沉淀即可得到微生物总DNA。为验证提取的DNA大小及完整性，在0.7%的琼脂糖凝胶中检测提取的基因组DNA，并通过酶标仪测定其浓度以验证提取质量和纯度。
1.4 基于mcrA基因片段的扩增用提取的基因组DNA作为模板，采用通用引物mcrA-f/mcrA-r[19]进行片段扩增，大约464-491 bp。PCR扩增体系：10×Easy Taq buffer 5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，10 μmol/L引物各2 μL，Easy Taq ploymerase 1 μL，DNA模板1 μL，最后用水补至50 μL。PCR扩增条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，循环35次；72 ℃ 10 min。PCR产物在1% (质量体积比) 的琼脂糖凝胶中检测目标片段长度，以验证PCR的正确性，随后用胶回收试剂盒对目的产物进行纯化，具体步骤则参照说明书。最后将纯化后的产物进行Roche 454 FLX高通量测序。
1.5 高通量测序的数据处理 1.5.1 mcrA的454高通量测序数据处理: 样品测序完成后，首先运用Qiime (version 1.7.0，http://qiime.org/) 进行序列过滤，然后运用Mothur软件 (version 1.31.2，http://www.mothur.org/) 对有效序列进行进一步过滤和去除嵌合体处理，从而得到优质序列进行进一步分析，在Qiime中调用Uclust的方法对优质序列按序列相似度0.97进行聚类，选取每个类中最长的序列为代表序列，为了保证分析结果的准确性，进一步对OTUs (Operational taxonomic units) 进行精简处理，精简标准为去掉丰度值小于总的序列条数0.001%的OTUs，也可将序列通过Mothur软件计算微生物α多样性及稀释分析等。 1.5.2 丰度分析: 基于高通量测序获得的读长数 (reads)，同一菌属的reads数总和与样品总的reads数之比，即该菌属在样品中的丰度百分比。 1.6 系统发育分析结合高通量测序结果，选取OTU的代表序列构建系统发育树。每一类菌属中，取每个样品中已知菌属序列和未知菌属序列中读长数较多的作为代表序列；同时为了对未知菌属的分类地位进行分析，从GenBank中选取具有代表性的12种产甲烷菌的mcrA基因序列作为参考序列进行系统发育分析。然后通过Clustal软件进行多序列比对，最后运用MEGA 5.0软件中的Neighbor-joining法构建mcrA功能基因的系统发育树，1 000次重复的自展值 (bootstrap) 分析。
2 结果与分析 2.1 基因组DNA含量的测定应用分子生物学的方法对环境微生物群落多样性进行全面解析的最关键一步是样品基因组总DNA的提取。样品基因组DNA的琼脂糖凝胶检测结果如图 2所示，基因组主带完整，均在23 kb附近处。同时对提取的5个不同井产出水样的DNA用酶标仪进行了浓度和质量测定，结果如表 1所示，可以看出所用样品的OD260/OD280均在1.6–2.0之间，浓度均在20 mg/L以上，能用于后续的相关PCR及高通量测序分析。
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| 图 2 5个产出水样基因组DNA提取结果 Figure 2 Genomic DNA in five formation water samples of the Qinshui Basin Note: M: λDNA/Hind Ⅲ; 1: Sample D; 2: Sample A; 3: Sample E; 4: Sample C; 5: Sample B. |
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| 样品编号 Samples ID |
OD值 OD260/OD280 |
浓度 Concentration (mg/L) |
| A | 1.88 | 172.8 |
| B | 1.99 | 47.4 |
| C | 1.93 | 112.1 |
| D | 1.60 | 38.2 |
| E | 1.65 | 24.8 |
将所有样品测序完成后，经过质量监控处理后总共得到69 891条优质序列用于后续分析 (表 2)，5个样品的优质序列读长数在9 389-22 480，包含的OTU数目在64-157 (表 2)。同时对每个样品的优质序列按序列相似度97%进行OTU聚类和后续分析。用Chao 1指数和ACE指数来评估微生物群落的丰富度，Shannon指数用来表征微生物的多样性，由表 2可以看出产甲烷菌群的Chao 1指数均高于每个样品检测到的OTU数；样品D的Chao 1、ACE和shannon指数最大，即该样品环境中检测到的菌群多样性最大。
| 样品编号 Samples ID |
读长数 Reads |
操作分类单元 OTUs |
Chao指数 Chao index |
ACE指数 ACE index |
香农指数 Shannon index |
| A | 22 480 | 98 | 109.333 | 109.303 | 2.340 |
| B | 9 743 | 129 | 177.750 | 168.192 | 3.157 |
| C | 9 389 | 64 | 90.250 | 87.122 | 2.415 |
| D | 12 629 | 157 | 193.250 | 176.189 | 4.139 |
| E | 15 620 | 83 | 93.929 | 97.481 | 1.495 |
| 注：序列相似度在97%以上为一个OTU. Note: The operational taxonomic unit (OTU) was defined with 97% similarity. | |||||
研究得到的高通量测序结果提交至NCBI SRA (Sequence read archive) 数据库，获取的登录号为SRA495307。
2.4 高通量测序分析产甲烷菌群的结构变化 2.4.1 产甲烷菌群组成分析: 为了分析不同井位产出水样的产甲烷菌群结构变化，对产甲烷菌群属水平进行了分类分析 (图 3)。由图 3a可以看出，在样品A中检测到的菌属为Methanobacterium (2.63%)、Methanomicrobium (0.01%) 和Methanolobus (0.06%)，在图 3b中，样品B的主要优势菌属为Methanobacterium (48.25%)，其次为Methanomicrobium (0.49%)、Methanolobus (0.09%) 和Methanospirillum (0.05%)；样品D的产甲烷菌群结构分布如图 3d所示，相比其他样品而言，该水样被检测到的产甲烷菌属丰度最低，包括Methanobacterium (0.21%) 和Methanomicrobium (0.02%)；样品C和E被检测到的菌属和样品A相同 (图 3c和图 3e)，主要菌属均为Methanobacterium，所占比例分别为25.52%和80.73%。综上所述，可以看出mcrA功能基因在本研究能检测到的产甲烷菌属主要有3种，即Methanobacterium、Methanomicrobium和Methanolobus，它们分别属于Methanobacteriales、甲烷微菌目 (Methanomicrobiales) 和甲烷八叠球菌目 (Methanosarcinales)，且均属于广古菌门 (Euryarchaeota)。
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| 图 3 5个样品中产甲烷菌群属类水平的微生物组成分布 Figure 3 Relative abundances of genus level methanogens based on sequencing of mcrA gene in five samples Note: A: Sample A; B: Sample B; C: Sample C; D: Sample D; E: Sample E. |
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| 图 4 基于高通量测序的5个样品中mcrA基因序列的系统发育分析 Figure 4 Phylogenetic tree showing relationships of mcrA gene sequences obtained from five formation water samples by 454 high-throughput sequencing 注：通过454高通量测序的mcrA基因序列全部提交至NCBI SRA，登录号为SRA495307；节点上的数值为自展值 (bootstrap)；低于50%的数值 (1 000次重复) 没有显示；比例尺代表有5%的序列误差；圆括号内是在GenBank中该菌种部分mcrA基因序列的登录号；方括号内是每个样品中该菌属的读长数. Note: The mcrA gene sequences derived from 454 pyrosequencing are deposited in the NCBI SRA (Sequence Read Archive) under accession No. SRA495307; numbers at the node are the bootstrap values (%); Bootstrap values (1 000 replicates) less than 50% are not shown; The scale bar represents 5% sequence difference; Accession numbers of partial sequences of mcrA gene from these genera are shown in parentheses in GenBank; The digital in bracket represents the number of the genus's sequence reads in each sample. |
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| 图 5 基于OTUs的产出水样产甲烷菌韦恩图和主成分分析 Figure 5 Venn diagram and PCA (principal component analysis) methanogens communities from the formation water based on OTUs |
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| 图 6 不同煤层气井产出水样的Heatmap图分析 Figure 6 Heatmap of five formation water samples from different CBM wells of the Qinshui Basin |
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基因组DNA的提取是进行环境分子生物学分析的关键步骤，也是评估微生物多样性的可靠保障。总DNA提取得不完整及腐殖酸和蛋白质等对PCR的抑制，都会对环境微生物多样性造成偏低的估量[20]。煤具有复杂和难降解结构，有机质主要是由缩聚的芳香环、脂环、杂环和各种官能团支链所组成，同时含有腐殖酸等物质，而产出水样中本身又含有煤渣，微生物同时也会吸附在煤颗粒表面。因此该种环境样品微生物的提取和DNA的品质保障具有一定的难度。在本研究中，我们通过优化基因组提取过程中细胞破碎这一重要环节，得到了高质量的环境样品总DNA (图 2)，从而为下一步的实验提供了前提条件。引物对物种的选择性也会对群落多样性的评估有一定的误差[21]。在本研究中，我们选用了含有简并碱基的mcrA基因通用引物，该引物能够检测到5种主要的产甲烷菌目[19]，即Methanobacteriales、Methanomicrobiales、Methanosarcinales、Methanococales和甲烷火菌目 (Methanopyrales)。在所有煤层气田相关微生物的研究中，甲烷形成中的功能产甲烷菌也大部分来自Methanobacteriales、Methanococales、Methanomicrobiales和Methanosarcinales[22-25]。此外，mcrA基因作为检测产甲烷菌靶标基因，也多用于一些厌氧颗粒污泥、鸡粪沼气池、芦苇床污泥等厌氧环境中。例如基于mcrA基因对阿维菌素废水处理工业化UASB厌氧颗粒污泥中的产甲烷菌群进行分析时，通过mcrA基因的PCR-DGGE分析得到了Methanobacteriales和Methanosarcinales两种优势产甲烷种群[26]；又如在分析污泥干化芦苇床中的产甲烷菌时，利用mcrA基因的PCR-DGGE和系统发育树分析，表明该污泥样品中主要的产甲烷优势菌属是Methanobacterium和Methanomicrobium[27]。
mcrA基因的高通量测序结果显示，样品A、C和E均检测到3种菌属，即Methanobacterium、Methanomicrobium和Methanolobus，而且Methanobacterium在所有样品中所占比例最大。其中Methanobacterium与Methanomicrobium为氢营养型[28-29]，而Methanolobus则是典型的甲基营养型产甲烷菌属[30]；在样品B中，除上述3种菌属外，还检测到一种产甲烷菌，即Methanospirillum，该菌属同样是氢营养型的产甲烷菌[31]；而样品D仅检测到2种菌属，Methanobacterium与Methanomicrobium。从产甲烷菌群的系统发育分析 (图 4) 可以看出，未明确地位菌属主要与Methanomicrobium、Methanobacterium、Methanococcus和Methanoculleus有较近的亲缘关系，Methanococcus通常利用H2+CO2、甲酸盐生成CH4，而不利用乙酸和甲基胺；Methanoculleus同样不利用乙酸和甲基胺作为生成CH4的底物。5个样品中都检测到了Methanobacterium，这个结果与部分厌氧环境中的甲烷菌较为相似，如在俄罗斯北极永冻土中同样检测到了Methanobacterium[26]；Shlimon等在海洋沉积物中发现也有Methanobacterium的存在，并分离得到Methanobacterium aarhusense sp. nov.菌株[32]，同时也有报道在一些煤层气田中，如日本北海道的煤层地下水[9]和加拿大西部亚伯达煤层中的煤样[11]也发现了Methanobacterium。高通量测序所得的已知菌属和未知菌属的分析结果表明，5种产出水样的生物成因气生成途径相同，均为氢营养型产甲烷菌占主导地位。与本研究结果较为相似的是，Zhang等在研究分析美国伊利诺斯州盆地烟煤产出水中的微生物群落组成中，有89.8%的产甲烷菌来自于氢营养型的Methanobacteriales[10]；Shimizu等在日本北海道煤层地下水的研究中，通过构建16S rRNA基因克隆文库发现产甲烷菌克隆子主要来自氢营养型的Methanoculleus和Methanobacterium[9]。
同为高煤阶煤出水样微生物分析，Guo等的研究中[18]以mcrA功能基因建立的文库，在两个样品中仅获得了30个阳性克隆子，并且都是同样的种属，即Methanobacterium，而且没有检测出其他已知的和未鉴定的菌属，这与本文的结果有着明显的不同。这可能是由于克隆文库容量制约了其他菌属的发现。本研究除了检测到Methanobacterium，还包括氢营养型的Methanomicrobium、Methanospirillum、Methanococcus和Methanoculleus，甲基营养型的Methanolobus，表明无烟煤产甲烷菌成气过程是一个多菌群联合作用，而不是单一菌属来完成的。当然，就产气类型而言，它们都是以氢营养型产甲烷为主。由此可见，以mcrA功能基因为靶标，有助于更全面地理解生物成气机理。
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