2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 张磊, 张伟, 方金涛, 董冰雪, 黄林娜, 吴倩倩, 押玉柯, 张建丰, 张格格, 郑路
- ZHANG Lei, ZHANG Wei, FANG Jin-Tao, DONG Bing-Xue, HUANG Lin-Na, WU Qian-Qian, YA Yu-Ke, ZHANG Jian-Feng, ZHANG Ge-Ge, ZHENG Lu
- 定向进化提高灰盖鬼伞过氧化物酶染织废水脱色效率
- Directed evolution of Coprinus cinereus peroxidase to improve the decolorization of textile wastewaters
- 微生物学通报, 2017, 44(4): 774-782
- Microbiology China, 2017, 44(4): 774-782
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160347
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文章历史
- 收稿日期: 2016-04-29
- 接受日期: 2016-11-07
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-11-08
2. 南阳理工学院土木工程学院 河南 南阳 473004;
3. 南阳师范学院校医院 河南 南阳 473061;
4. 中山大学生命科学与技术学院 广东 广州 510275
2. School of Architecture and Construction, Nanyang Institute of Technology, Nanyang, Henan 473004, China;
3. School Infirmary, Nanyang Normal University, Nanyang, Henan 473061, China;
4. School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou, Guangdong 510275, China
过氧化物酶 (EC 1.11.1.7) 是一类含血红素的氧化还原酶，能够以过氧化氢为电子受体氧化多种有机和无机分子[1-3]，在免疫检测、生物传感器、工业废水处理等方面有着广阔的应用前景[4]。目前使用的大多数过氧化物酶来源于植物，其生产受地域和气候的限制，给工业应用带来不便[5]。灰盖鬼伞过氧化物酶 (Coprinus cinereus peroxidase，CIP) 因与辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase，HRP) 在酶学特性和底物广谱性上十分相似而引起了人们的广泛关注，尽管二者同源性低于10%-16%[6]。研究发现，CIP已经成功用于清除废水中的酚类物质[7-11]、降解苯类同系物及衍生物[12]、染料脱色[13-16]；生产功能性多聚芳香物[17-20]；用作生物传感器[21]和清洁剂[22]；此外，CIP在纸浆造纸工业也极具应用潜力。从商业角度看，CIP有望替代HRP成为工业用酶，有着广阔的市场前景。
近年来酶法处理染料废水因条件温和、环境友好而发展迅速，漆酶、过氧化物酶被广泛试用于染料脱色[23-28]。令人遗憾的是染织工业废水pH大多是中性甚至碱性[29]，漆酶和过氧化物酶却多为酸性酶，在中碱性条件下会快速失活[30-32]；而CIP的最适反应pH接近中性，热稳定性比HRP更强[33-34]，相对于其它酶CIP更适合用作染织业废水脱色处理。美中不足的是灰盖鬼伞属于中温菌，其产生的CIP在高温和碱性环境下不够稳定[34-35]。利用分子定向进化技术进行CIP酶学性质的分子改良是改变最适反应pH、提高酶的热稳定性和碱性环境耐受性的重要途径。Cherry等利用定向进化技术得到了一个氧化稳定性提高100倍、热稳定性提高174倍的突变CIP[35]；Houborg等研究了该突变体酶的晶体结构，揭示了蛋白结构改变对酶学性质的影响[36]。但是该突变酶在高温下仍不够稳定，40处理5 min活性下降为87%。目前国际上尚没有关于CIP的最适反应pH向中、碱性方向偏移，最适反应温度大幅提高且高温稳定性增强的分子定向进化研究。
Cherry等报道M166F和M242I能够提高CIP的氧化稳定性，V53A可以提高酶活性[35]；Houborg等研究晶体结构时提出I49S和V53A会协同发生作用[36]。本文以含有4个氨基酸突变 (I49S、V53A、M166F和M242I) 的CIP基因为模板，在保证了氧化稳定性和提高酶活性的基础上进行基于易错PCR的定向进化，以期寻找最适反应pH向中、碱性方向偏移，最适反应温度升高，更适应染料脱色处理的工业用CIP。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒: 巴斯德毕赤酵母GS115、大肠杆菌DH10B由本实验室保存；CIP/GS115来自于前期工作[37]，用于表达野生型CIP，所表达蛋白标记为CIPwt；本实验所用质粒pPICZαA购自Invitrogen。 1.1.2 主要试剂和仪器: 限制性内切酶、DNA聚合酶和连接酶购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；易错PCR试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，蛋白纯化离心柱Ni-NTA Spin Columns购自Qiagen公司，其他试剂均为进口分析纯。Heal Force Neofuge 15离心机购自力新仪器 (上海) 有限公司；NanoDrop 2000微量紫外分光光度计购自Thermo Scientific公司；S1000 PCR仪、iMark酶标仪、电泳仪、凝胶成像系统购自Bio-Rad公司。 1.2 CIPmt4基因的合成在GenBank中查找CIP序列 (登录号：X69457)，翻译出氨基酸序列并替换第49、53、166和242位氨基酸。选择密码子为毕赤酵母偏好性，用实验室构建的平台合成含4个氨基酸突变的CIP基因并连接在pPICZαA上，电击转化大肠杆菌DH10B。挑取单菌落提质粒测序，确认该质粒含突变CIP基因 (I49S、V53A、M166F和M242I) 且密码子为毕赤酵母偏好性，将该质粒命名为pPICZαA-CIPmt4。
1.3 易错PCR第一轮易错PCR以pPICZαA-CIPmt4质粒为模板，以CIP1 (5′-GCGAATTCCAAGGTCCTGGCGG AGGTGGTAGT-3′) 和CIP50 (5′-TCCCCGCGGTGGGGCTGGAGCTAAAGAAGGCAGTG-3′) 为引物，参照易错PCR试剂盒说明书进行易错PCR扩增。反应程序：95 5 min；95 45 s，56 30 s，72 1 min，30个循环；72 5 min。第二轮易错PCR以第一轮得到的1-18-E6为模板；第三轮易错PCR以第二轮得到的2-33-H4为模板进行突变。
1.4 突变酶文库构建回收每轮易错PCR产物，用Sac Ⅱ和EcoR Ⅰ 双酶切后连接在毕赤酵母表达载体pPICZαA上，命名为pPICZαA-CIPmt；电击转化大肠杆菌DH10B。提取pPICZαA-CIPmt混合重组质粒线性化处理回收备用。根据毕赤酵母使用操作手册制作感受态细胞；毕赤酵母转化，阳性克隆筛选、检测方法参考前期工作[37]。收集所有的阳性克隆构成突变酶文库。
1.5 文库筛选接种阳性克隆到深孔96孔培养板 (每孔含有1.5 mL BMGY[37])，30、200 r/min培养24 h，3 000 r/min离心8 min收集细胞，每孔加入500 μL BMMY[37] (添加8 g/L的丙氨酸，0.5 g/L的氯化血红素) 重悬，29、200 r/min摇床继续培养，每24 h添加甲醇至终浓度0.5%保持诱导。第5天离心取上清进行酶活性、中碱性pH活性、高温下酶活性检测，每个实验重复3次。经三轮筛选得到一个目的突变酶3-43-c7，测序发现该突变体含有5个氨基酸突变，命名CIPmt5，对应的工程菌命名为CIPmt5/GS115。
1.6 酶表达与纯化CIPmt5/GS115和CIP/GS115蛋白的诱导表达参考前期工作[37]；使用Qiagen公司的Ni-NTA Spin Column，参照蛋白纯化试剂盒说明书进行蛋白纯化。
1.7 重组CIP的纯度、分子量估算及浓度测定SDS-PAGE凝胶电泳检测酶的纯度并估算分子量。NanoDrop 2000微量紫外分光光度计280 nm下测定酶蛋白的浓度[ε=1.597×104 L/(mol·cm)]。
1.8 酶活性的测定酶活性测定采用ABTS法[37]，向含有0.5 mmol/L ABTS的缓冲液 (pH 5.0) 中加入适量的酶液，25保温数分钟，再加入0.1 mmol/L H2O2起始反应。利用iMark酶标仪测量405 nm光吸收值，以1 min内氧化1 μmol ABTS至蓝绿色阳离子所需要的酶量定义为一个单位 (U) [ε=3.6×104 L/(mol·cm)]。
1.9 酶学特性研究 1.9.1 pH对酶反应的影响: 最适反应pH测定以柠檬酸-磷酸缓冲液 (pH 2.0-2.5) 和Britton Robinson buffer (pH 3.0-9.0) 为缓冲液，200 μL反应体系含49.7 ng纯化的CIPwt或者CIPmt5酶，其它条件同1.8。pH稳定性测定取纯化后的CIPwt或CIPmt5，先置于不同pH的缓冲液内4保温2 h，再调至最适pH，CIPwt选用25测定酶活，CIPmt5选用45测定酶活，以未处理的酶作对照，每个反应至少3个重复。 1.9.2 温度对酶反应的影响: 最适反应温度测定设置温度范围10-60，每5一个梯度。CIPwt以pH 5.0的醋酸钠 (NaAc) 作为缓冲液，CIPmt5以pH 6.5的NaAc为缓冲液；其它条件同最适pH测定。温度稳定性测定取纯化后的CIPwt或CIPmt5，先置于不同温度下保温2 h，冰上冷却，再按最适条件测定酶活，每个反应至少3个重复。 1.9.3 动力学参数的测定: 以不同浓度的ABTS、2, 6-DMP和愈创木酚为底物，以pH 5.0的NaAc为缓冲液，反应温度设为25；相应波长下测量吸光值的变化 (2, 6-DMP和愈创木酚使用波长450 nm)，计算出各浓度下不同底物对应的酶活，每个反应至少3个重复。动力学参数 (Km和Kcat) 采用Graphpad prime 5软件中的米氏方程计算、拟合。 1.10 蛋白3D建模及分子动力学模拟使用swiss-model (http://swissmodel.expasy.org) 在线软件对CIPwt和CIPmt5进行结构预测。运用GROMACS 4.5 (http://www.gromacs.org/) 对CIPwt和CIPmt5三维结构进行分子动力学 (Molecular dynamics MD) 模拟，模拟体系选用GROMOS 96力场，溶质分子被1.5 nm的SPC/E水分子层包裹。MD模拟之前，分别对受约束和去约束的溶质分子体系进行两次能量优化，先采用最陡下降法优化800步，再采用共轭梯度法优化1 200步。MD模拟过程：首先对受约束溶质分子在300 K下模拟100 ns；然后对去约束溶质分子在500 K下模拟7 ns。MD模拟结束后，利用GROMACS 4.5的g_rms软件计算CIP突变前后的根均方偏差 (RMSD) 值，分析突变位点对酶蛋白耐热性的贡献。
1.11 染料脱色实验选pH 2.2-8.0的柠檬酸-磷酸作缓冲液，分别用CIPwt和CIPmt5的粗酶液对7种染料进行脱色能力测定。200 μL反应体系含合适初始浓度染料 (刚果红7.18 mmol/L，氨基黑8.11 mmol/L，甲基橙15.28 mmol/L，次甲基蓝14.98 mmol/L，苯胺蓝6.78 mmol/L，结晶紫12.26 mmol/L，溴酚蓝7.46 mmol/L)，双氧水10 mmol/L，CIPwt组酶用量为0.045 U/mL，CIPmt5组酶用量为0.042 U/mL，室温 (25下孵育4 h，测量脱色前后染料的浓度，计算染料脱色率，计算公式如下：
脱色率 (%)=(脱色前吸光度–脱色后吸光度)/脱色前吸光度×100。
每个实验3个重复，刚果红、氨基黑和甲基橙采用490 nm波长，次甲基蓝和苯胺蓝采用405 nm波长，结晶紫和溴酚蓝采用630 nm波长，脱色率最高的缓冲液pH被认定为最适pH。
2 结果与分析 2.1 文库构建和筛选构建工程菌CIPmt4/GS115并诱导表达突变体酶CIPmt4。以ABTS为底物CIPmt4活性是野生型酶活的1.15倍 (13.98 U/mg)，反应pH范围变宽；最适反应温度和热稳定性不变；氧化稳定性增强。以pPICZαA-CIPmt4质粒为模板进行第一轮易错PCR扩增，转化酵母后得到3 800个转化子，随机挑选10个用高保真酶扩增，测序结果显示每个基因含有0-3个碱基突变。以ABTS为底物检测，45%的突变体没有活性或者活性很低；超过50%的突变体活性和野生型相似 (12.16 U/mg)。突变体1-18-E6 (I49S、V53A、M166F和Y272F) 由第一轮突变而来，其活性是CIPwt的1.2倍 (14.59 U/mg)，最适反应pH为5.5，最适反应温度35。经过第二轮突变后，从4 220个克隆中得到一个突变体2-33-H4 (I49S、V53A、M166F、E239G和Y272F)，其活性提高到野生型的1.7倍 (20.67 U/mg)，最适反应pH为6.0，最适反应温度45。经第三轮突变后从3 640个转化子中得到一个突变体3-34-c7，其活性是CIPwt的2.01倍 (24.44 U/mg)，最适反应pH为6.5，最适反应温度45。测序结果显示该突变体含有5个氨基酸突变 (I49S、V53A、T121A、M166F和Y272F)，命名为CIPmt5。与CIPmt4相比，丢失了242位的突变，同时在121位和272位两个位点引入了氨基酸突变。
2.2 蛋白表达纯化诱导表达CIP/GS115和CIPmt5/GS115，纯化后皆得到单一条带，大小在43 kD左右 (图 1)，符合预期大小。测得CIPwt的浓度为14.916 g/L，CIPmt5的浓度为9.827 g/L。
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| 图 1 纯化后重组CIPwt和CIPmt5的SDS-PAGE分析 Figure 1 SDS-PAGE analysis of purified recombinant CIPwt and CIPmt5 注：M：蛋白分子量标准；1：纯化后的重组CIPmt5；2：纯化后的重组CIPwt. Note:M: standard protein molecular mass marker (sizes in kilodaltons are indicated on the left); 1: recombinant CIPmt5 purified by Ni-NTA Spin column; 2: recombinant CIPwt purified by Ni-NTA Spin column. |
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| 图 2 pH对重组CIPwt和CIPmt5活性和稳定性的影响 Figure 2 Effect of pH on activity and stability of recombinant CIPwt and CIPmt5 注：A：pH对CIPwt和CIPmt5活性的影响；B：pH对CIPwt和CIPmt5稳定性的影响；图上的点代表 3个测量数据的平均值，误差线代表±1 s. Note: A: Effect of pH on activity of recombinant CIPwt and CIPmt5; B: Effect of pH on stability of recombinant CIPwt and CIPmt5; Data points are the average of triplicate measurements, error bars represent ±1 s. |
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| 图 3 温度对重组CIPwt和CIPmt5活性和稳定性的影响 Figure 3 Effect of temperature on activity and stability of recombinant CIPwt and CIPmt5 注：A：温度对CIPwt和CIPmt5活性的影响；B：温度对CIPwt和CIPmt5稳定性的影响；图上的点代表 3个测量数据的平均值，误差线代表±1 s. Note: A: Effect of temperature on activity of recombinant CIPwt and CIPmt5; B: Effect of temperature on stability of recombinant CIPwt and CIPmt5; Data points are the average of triplicate measurements, error bars represent ±1 s. |
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| Substrate | CIPwt | CIPmt5 | |||||
| Km (mmol/L) |
Kcat (s–1) |
Kcat/Km (L/(s·mmol)) |
Km (mmol/L) |
Kcat (s–1) |
Kcat/Km (L/(s·mmol)) |
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| ABTS | 62.80±7.77 | 17.190±0.310 | 0.274 | 54.86±5.68 | 19.75±0.47 | 0.36 | |
| 2, 6-DMP | 711.00±9.40 | 0.122±0.006 | 1.72×10–4 | 504.60±36.64 | 2.10±5.66 | 4.00×10–3 | |
| Guaiacol | 150.20±3.05 | 0.200±0.005 | 0.001 | 117.70±15.27 | 2.55±2.43 | 0.02 | |
从3D结构图可以看出CIPwt和CIPmt5活性中心的疏水性口袋形状和大小明显不同 (图 4)。经软件预测分析，野生型CIP含有两个钙离子配体、一个氰根离子配体和一个原卟啉IX配体，其中氰根离子配体和卟啉相结合。CIPmt5因49位和53位氨基酸发生了改变，失去了与卟啉结合的氰根离子配体；CIPmt5活性中心更开放，更容易与底物结合。分子动力学模拟显示随着模拟高温时间的延长，突变酶的RMSD值低于野生型酶 (图 5)，RMSD值越低分子越稳定[38]，预示着突变酶在模拟高温环境中变形小于野生型酶，具有更好的热稳定性。
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| 图 4 swiss-model预测的CIPwt (A) 和CIPmt5 (B) 的结构图 Figure 4 Structural mapping of CIPwt (A) and CIPmt5 (B) predicted by swiss-model software |
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| 图 5 CIPwt和CIPmt5的RMSD值 Figure 5 RMSD values of CIPwt and CIPmt5 |
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选择不同类型的染料进行脱色，结果显示除次甲基蓝外，CIPmt5脱色染料的最适pH和野生型相比均向中、碱性方向偏移，脱色效率普遍高于野生型。对甲基橙的脱色，虽然和野生型相比脱色效率无显著差异，但CIPmt5对甲基橙脱色的最适pH为7.0，更适合染料处理。CIPmt5对溴酚蓝脱色的优势最明显，脱色的最适pH为8.0，且脱色率显著提高，是野生型的4倍 (表 2)。
| Dyes | CIPmt5 | CIPwt | |||
| Decolorization rate (%) | Optimal pH | Decolorization rate (%) | Optimal pH | ||
| Amino black | 42.99±1.39 | 6.0 | 35.05±0.86 | 3.0 | |
| Methylene blue | 40.34±0.02 | 3.6 | 35.08±0.99 | 5.0 | |
| Congo red | 31.71±1.99 | 5.0 | 26.78±0.81 | 4.6 | |
| Methyl orange | 26.84±0.16 | 7.0 | 26.31±0.26 | 3.0 | |
| Crystal violet | 58.70±0.73 | 6.6 | 53.31±0.94 | 5.0 | |
| Aniline blue | 68.56±0.62 | 6.6 | 65.09±1.63 | 6.0 | |
| Bromophenol blue | 92.51±0.73 | 8.0 | 23.88±1.14 | 5.8 | |
酵母在表达含稀有密码子的外源基因时，细胞中氨酰tRNA对氨基酸的正常转运可能受到限制，致使翻译提前终止。大量实验证明，密码子优化可以显著提高蛋白在酵母中的表达[37, 39]。在实验中将CIP密码子调整为毕赤酵母偏好性，保证了突变CIP能够在酵母中成功表达并完成表达后的翻译、翻译后加工、分泌等过程。根据Cherry等的报道向CIP中引入了4个氨基酸突变，为定向进化奠定了基础，使得到的酶有可能在最适反应pH向中、碱性方向偏移，最适反应温度升高的同时保持氧化稳定性。
Cherry等对CIP进行定向进化时发现单个V53A可以提高酶活性，但不会引起稳定性的改变，而M166F似乎和I49S、V53A协同发生作用，对稳定性增强贡献最大[35]。用swiss-model建模分析发现I49S、V53A导致酶蛋白缺失一个与原卟啉IX结合的氰根离子配体，使突变酶活性中心更开放，所以表现出Km值下降，亲和力增强。第49、53和121位的3个疏水性氨基酸同时变成亲水性氨基酸，使蛋白侧链变小，从而增加了蛋白的稳定性。分子动力学模拟进一步验证了这一观点。Cherry等分析E239G能够改善CIP在高pH时的热稳定性[35]，而本实验在定向进化中得到了一个含有E239G的突变3-26-G5 (I49S、V53A、M166F、E239G、M242I和Y272F)，最适反应pH为6.5，酶活性是野生型的1.13倍 (13.74 U/mg)，最适反应温度为40，但是后期实验发现其在各pH和温度处理后稳定性尚不如野生型 (数据未显示)。E239G的引入并没有提高热稳定性，可能是各突变位点之间存在着复杂的相互作用，机理仍需进一步研究。
染料废水处理是环境保护领域的一大难题，理化方法成本昂贵且会形成二次污染；酶法处理染料逐渐引起人们的重视。植物来源的过氧化物酶生产周期长、成本高不适合工业化应用。而真菌来源的漆酶和过氧化物酶多为酸性酶，在中、碱性环境会快速失活。本实验用定向进化的手法得到了酶学性质显著改善的突变灰盖鬼伞过氧化物酶，并对不同类型的7种常用染织染料进行脱色检测。虽然CIPmt5可能会在较高温度时 (比如37和45具有更高的活性和高的脱色效率，但考虑到室温能耗低、利于降低处理成本，因此选择了在室温 (25下对染料进行处理。因酶法脱色染料反应体系和条件不同，无法与其他人的具体结果进行比较，从本实验结果来看突变后的酶取得了比野生型酶更好的脱色效果，反应条件更接近实际排放的染料工业废水状况，从方法的适应性和节约成本出发，CIPmt5更适合染料工业废水的处理应用。
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