2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 王彦杰, 李琳, 许光素, 刘俊新, 韩云平
- WANG Yan-Jie, LI Lin, XU Guang-Su, LIU Jun-Xin, HAN Yun-Ping
- 微生物气溶胶采集技术的特点及应用
- The application and characteristics of technologies for bioaerosols collection
- 微生物学通报, 2017, 44(3): 701-709
- Microbiology China, 2017, 44(3): 701-709
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160342
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文章历史
- 收稿日期: 2016-04-27
- 接受日期: 2016-08-30
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-10-11
2. 中国科学院大学 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
微生物气溶胶由不同种类的微生物、不同粒径的颗粒物和水分组成，具有来源广泛、成分复杂、粒径差异显著的特点。与其他可吸入颗粒物一样，微生物气溶胶易沉着于人体的呼吸系统，沉着部位与微生物气溶胶的粒径有关，如10 μm−30 μm的粒子会沉积在支气管，1 μm−5 μm的粒子可直接侵入肺泡[1]。气溶胶一般携带细菌、真菌、病毒、动植物碎片等，因此会对人体健康造成危害。随着空气的流动，微生物气溶胶扩散到各处，还可能导致区域性的环境影响[2]。
为了有效监测和量化空气中的微生物气溶胶逸散水平，确定其主要来源和污染程度，多年来研究者们致力于研发高效、便捷、精确的微生物气溶胶采集技术和装置。Pouchet Acroscope是已报道的研发和使用最早 (1860年) 的微生物气溶胶采集装置。之后的150多年中，研发的采样设备种类繁多[3-5]，它们大多以发明者的名字命名 (表 1)。本文论述了常用的微生物气溶胶采集技术和装置的特点、技术原理和使用范围，为微生物气溶胶的采集、分析和研究提供科学依据和参考。
| 年代 Years |
采样方法 Sampling methods |
采样设备 Sampling devices |
| 1860 | 未报道 | Pouchet采样器 |
| 1870 | 未报道 | Miquel采样器 |
| 1881 | 沉降法 | 气溶胶收集玻璃平板 |
| 1890 | 未报道 | Michaelis采样器 |
| 1920 | 惯性采样法 | Greenburg-Smith撞击器 |
| Owens多级集尘器 | ||
| Hill集尘器 | ||
| 1950 | 惯性采样法 | Battelle 6号撞击器 |
| Brink撞击器 | ||
| 安德森采样器 | ||
| 1950-2016 | 惯性采样法 | 全玻璃采样器 |
| 过滤法 | 总悬浮颗粒物采样器 | |
| 惯性采样法 | Buarkard采样器 | |
| 惯性采样法 | 组合多管旋风采样器 | |
| 惯性采样法 | 分级式采样器 | |
| 沉降法 | 静电颗粒采集器 |
常用的微生物气溶胶采集方法包括沉降采样法、惯性采样法和过滤采样法[6]，每种方法各有其特点、技术原理和适用条件。
1.1 沉降采样法 1.1.1 重力沉降法: 沉降采样法可以分为重力沉降法和静电沉降法，其中，重力沉降也称自然沉降[3]。1860年研发和使用的Pouchet Acroscope是最早的利用粒子自然沉降原理，采集空气中的微生物气溶胶的采样器。使用自然沉降法采集样品，结合显微镜观察，可以直观地辨别空气中颗粒物与微生物，曾用于研究空气颗粒物和疾病的关系[3]。自然沉降法利用了空气微生物粒子的重力作用，在一定时间内将微生物粒子收集到带有培养基的平皿内，经过培养可以对微生物进行计数和分析鉴定，从而获得气溶胶中微生物的数量和种类方面的信息[6]。自然沉降法收集的空气中微生物气溶胶，其浓度是以每100 cm2的培养基表面5 min内收集10 L空气中所含的微生物粒子数表示的[6]，通常采用奥梅梁斯基经验公式计算 (公式1)。该计算公式没有考虑风速、温度、光照等气象条件的影响，因此结果偏差较大，只能对空气中微生物气溶胶的数量作粗略的估算。
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(1) |
其中：
C：空气中的菌落数 (CFU/m3)；
N：平皿菌落数 (CFU)；
T：暴露时间 (min)；
A：平皿表面积 (cm2)。
自然沉降法适宜在气速小、气流稳定、采样时间较长 (8−30 min) 的室内环境中使用。采集设备简单、操作便捷、经济实用。根据培养基的种类及其成分，可以有选择地培养不同种类的微生物，适合分离和鉴定目标菌株[6]。其结果可以初步反映环境空气中可培养微生物群落结构和数量。郭雅蓉等曾利用自然沉降法采集实验室微生物气溶胶，分析空气微生物污染程度。研究者将数个平皿分别置于距离地面1.5 m的3个采样点。5 min后，再将平皿放入恒温箱内36培养48 h。利用公式 (1) 计算得到室内空气中细菌总数为162−7 369 CFU/m3[6]。19世纪80年代至20世纪50年代，自然沉降法应用广泛，是研究室内空气气溶胶中可培养微生物的便捷有效的采集方法。自然沉降法的缺点是采样过程易受气流、风力等环境因素影响，无法获得不可培养微生物的数量以及微生物气溶胶的粒径尺寸与分布等方面的信息。
1.1.2 静电沉降法: 无论环境中自然存在还是人为产生的微生物气溶胶都带有一定量的电荷。由于静电作用，带电粒子进入电场时会发生偏转，利用这个原理，通过外加电场，可以收集空气中的微生物气溶胶，这种收集方法即为静电沉降法。在采集过程中，电场作用力直接施加于粒子本身，并且速度低、空气阻力小，所以静电沉降法具有捕获率高、可收集粒子的粒径范围广、能耗低、对微生物损伤较少的特点。运用微生物自身携带的电荷，可以采集空气中的细菌、真菌、过敏原和内毒素等微生物粒子[7]。Xu等在研究大肠杆菌和白色假丝酵母在空气中的存在水平时使用了静电采集装置。研究发现在流量为10 L/min、电场强度为7.5 kV/cm情况下，两种微生物的收集效率较高，分别为79%和71%；并且发现大肠杆菌和白色假丝酵母两种微生物气溶胶的粒径大多集中在1.8 μm和1.3 μm−3.1 μm[8]。不同种类微生物自身携带的电荷数量有差异，部分微生物气溶胶因自身所携带的电荷少而导致其捕获率低。新型的静电采样器在静电收集区之前设置电晕放电区，即先将荷电少的微生物输入电晕放电区增加荷电，然后再进入静电收集区收集，这样可以提高采样效率[9]。根据微生物气溶胶的特点，通过调节电压，使每种微生物都可获得理想的捕获率。但是，荷电过高会使微生物活性受损伤。因此采用静电沉降法采集微生物气溶胶时，应注意避免强电场、电晕放电等对微生物的损伤[9]。
1.2 惯性采样法空气中的微生物气溶胶粒子获得足够的惯性后会脱离气流，在惯性的作用下，撞击到采样介质上，这种采集气溶胶的方法即为惯性采样法。利用抽气管迫使含有微生物粒子的空气通过采样器上的喷嘴，形成高速喷射气流，并使喷射气流发生偏转，粒径大于或者等于切割粒径的粒子能够被收集，较小的粒子由于惯性小，会随气流发生偏转而逃逸，因此这类采样装置可以将不同粒径的颗粒分开收集。1945年May设计的May cascade impactor是最早利用惯性采样法的，既能获得浓度范围又能获得粒径分布的多级采样器[10]。之后研究者们研发的分级采样设备大多源于May cascade impactor[3]。根据收集介质，常用的惯性采样器可以分为固体撞击式采样器和液体冲击式采样器。
1.2.1 固体撞击式采样器: 固体撞击式采样器主要用于分析微生物气溶胶中的微生物种类及粒径分布，具有采集效率高、粒谱范围宽、操作简便的优点。收集介质通常是培养基，易于微生物的培养和鉴定。因此，这类采样装置还具有灵敏度高、选择性好的特点[11]。与自然沉降法相比，撞击法更具合理性、稳定性和科学性[7, 12-14]。能够检测活性粒子的粒径分布是其独有的特性，该种采样装置尤其适合采集空气中易沉着在人体呼吸道中的粒子，广泛用于分析和鉴定与获得性呼吸系统感染有关的致病微生物[11]。Andersen采样器是典型的固体撞击式采样器，可分为多级采样器和单级采样器，它们各有特点和适用范围，多级采样器采集到的粒子大小范围比单级采样器广。多级Andersen采样器不仅能够把可吸入与非可吸入微粒分离开，而且能够反映微粒进入肺部的分布状况。对于6级Andersen采样器，第1−2级对应人体的上呼吸道，第3−6级类似人体的下呼吸道[13]。根据需要采集气体的流量，Andersen采样器又分为大流量采样器和小流量采样器。大流量采样器收集的气体量大，因此易于捕获气溶胶中的微量成分。对于小流量采样器，由于流速慢，其壁损失小，采样过程中样品较少受到损伤，因此捕获率高[15]。在相同条件下，大流量采样器检测到的气溶胶浓度比小流量采样器获得的结果低，通常只有小流量的71%−80%[15]。六级Andersen采样器的每级筛网下面装有皮氏培养皿，根据所采集的目标微生物，在培养皿内配制不同的培养基可以获得不同种类的微生物信息。当使用LB培养基和孟加拉红培养基时，可以分析空气中可培养的细菌和真菌。氧化沟工艺污水处理厂微生物气溶胶逸散的研究显示，各个污水处理工艺段气溶胶中既有细菌又有真菌，充氧转刷附近细菌气溶胶和真菌气溶胶的逸散水平最高，是主要的逸散源[16]。
固体撞击式采样器收集的空气中微生物气溶胶的浓度可以利用公式 (2) 计算。
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(2) |
其中：
C：菌浓度 (CFU/m3)；
N：菌落数 (CFU)；
T：采样时间 (min)；
Q：气体流量 (L/min)。
采样过程中，由于微生物气溶胶颗粒会撞击在介质表面的同一位置，前面收集的粒子易被后面撞击的粒子覆盖，使检测结果出现偏差；而且空气中微生物气溶胶的浓度越高，偏差越大[17]。因此，Andersen采样器的使用易受空气中微生物气溶胶原有浓度的限制。为了解决这个问题，Andersen和Janet分别设计了针对每层400个孔或200个孔的采样器的数值校正表，对结果进行校正[18-19]。
依据惯性原理制造的固体撞击式采样装置还包括JWL-6型 (6级)、WSY-6型 (6级)、KHW-8型 (8级)、YCW-3型 (8级)、ETW-6型 (6级) 和FA-1型 (6级) 等。这些装置结构基本相同，由撞击器、流量计、定时器和支架等几个部分组成[20-21]。安德森采样器和FA-1型采样器多用于污水处理厂、城市不同功能区等地空气中微生物气溶胶的监测、分析和研究[22-23]。运用FA-1采样器采集污水处理厂各工艺段的微生物气溶胶，比较各工艺段微生物气溶胶的逸散特点，发现预处理工艺段、生化池和污泥脱水等工艺段是污水处理厂微生物气溶胶的主要产生源。细菌和真菌的逸散水平分别为371−6 136 CFU/m3和100−1 742 CFU/m3；并且各个工艺段气溶胶中的细菌都具有较高的多样性[23]。研究还发现，好氧生物处理单元的曝气方式对生物气溶胶的产生量影响显著，氧化沟工艺比鼓风曝气工艺产生更多的携带细菌的气溶胶，研究结果为污水处理工艺设计时控制微生物气溶胶逸散方法的选择提供了科学依据[24]。通风也会引起密闭空间微生物气溶胶粒径分布和菌群结构的差异，在相对封闭的污水处理站，经过4 h的通风，大粒径 ( > 4.7 μm) 和小粒径 (0.65 μm−1.10 μm) 的粒子比例显著减少，0.65 μm−1.10 μm的细菌减少89.1%，同时真菌减少了92.1%。而细菌的多样性明显增加，Bacillus sp.和Lysinibacillus sp.是空气中主要的细菌[25]。研究青岛近海生物气溶胶的分布特征时，使用了FA-1型采样器获得大气微生物气溶胶中大于2.1 μm的粒子所占比例，以说明青岛近海生物气溶胶受到陆地和海洋的影响状况[26]。
随着流体颗粒动力学理论的发展，高速计算机和有限积分的应用以及对采样器中流场和颗粒轨迹关系的深入理解，1970年学者们相继研发了能分辨不同粒径微生物气溶胶的采样器，如Marple采样器、Lovelace低流速采样器以及QCM多级采样器，以满足粒径分离和粒径分布分析的研究要求[3]。
因为收集介质是培养基，固体撞击式采样器只能用于检测可培养和活的微生物，不可培养和已经死亡的微生物不能检出[11]。另外，壁损失和粒子破碎等原因也会导致结果有误差。
1.2.2 液体冲击式采样器: 液体冲击式采样器是利用喷射气流的方式捕获空气中的微生物粒子。在取样瓶中加入适量收集介质，启动抽气泵，空气从吸收瓶入口处进入。由于入口末端喷嘴孔径狭小，气流速度加快；当速度达到一定程度后，微生物粒子冲击到收集介质中，利用液体的粘附性，将微生物粒子捕获。液体冲击式采样器的收集介质是无菌水、缓冲生理盐水或营养液等液体。液体具有缓冲作用，能够减少微生物的损伤。采用矿物油等黏度高的非蒸发性液体作为收集介质时，可以获得较高的捕集效能。在收集介质中加入适当的营养液或保存液，还可以长期保存样本以便随时分析检测[4, 17]。另外，使用该种装置采集的样品可以不经过培养而直接进行分析，既可以检测可培养微生物，也可以检测不可培养的微生物，因此增加了检测微生物气溶胶的范围，也能更全面地反映气溶胶中微生物的种群结构。采样过程中，空气以较高的速度进入液体，随即产生一定数量的气泡。气泡破裂时会引起部分已经进入收集介质的微生物颗粒再次气溶胶化。同时，一部分微生物粒子直接撞击到采样瓶底部发生反弹，反弹的粒子随气流逃逸出采样器。微生物粒子的逃逸和再次气溶胶化，导致计数结果出现偏差。另外，长时间采样引起的收集介质蒸发也会增加误差。因此液体冲击式采样器适用于短时间的收集样品[4, 17]。
常用的液体冲击式采样器是SKC公司生产的BioSampler[27]。该采样装置由一台高流量的空气采样泵、收集瓶和带有3个切线式弯度的喷嘴组成。BioSampler运用了旋转液体的方法，减少所捕获粒子再次气溶胶化的发生几率[28]。使用BioSampler采集仪器，结合分子生物学分析方法，发现污水厂生化池充氧过程产生的微生物气溶胶的数量、微生物群落结构和化学物质组成差异明显，与环境条件以及主要产生源的距离密切相关[28-29]。AGI系列采样器也是液体冲击式采样器，包括AGI-30和AGI-4两种主要类型，其冲击距离分别为30 mm和4 mm。AGI-30是国际空气生物学会议推荐使用的采样器。AGI-4釆样器可收集到更细小的颗粒物，但是，在收集过程中微生物的损伤也较大。AGI系列采样器为玻璃材质，易清洗和灭菌，但是也易碎和不便于携带[6]。
气旋式采样器是液体冲击式采样器的一种。该种采样器是由旋风除尘器演变而来，利用微生物粒子在气流旋转过程中的惯性离心力，将微生物从气流中分离并捕集于器壁，再借助重力作用使粒子落入采样器底部收集介质中。采集到的样本可以不断地从收集装置移走，因而在连续采样过程中不会发生因收集介质蒸发而导致结果有误差的现象。Burkard采样器是一种常用的自动多瓶气旋式采样器，可以实时快速地对空气中的孢子和颗粒物进行采集。在评价人类活动对室内空气中真菌孢子的影响时，Buttner等[30]使用了Burkard采样器。他们的研究结果证明了Burkard在室内真菌孢子采集中的有效性和在采集完整微生物方面的优势。但是，气旋式采样器也存在气体流量不稳定、系统压降大、能耗高和流量过低时采样效率低等方面的缺点，因此在实际中应用较少。
1.3 过滤法除了自然沉降法，过滤式采样器是最简单的一类采样设备。其结构主要包括抽气装置和装有多孔滤膜的收集装置。当空气以一定速度穿过多孔滤膜时，微生物粒子被拦截并滞留在滤膜上。常用的滤膜材料包括玻璃纤维、聚氯乙稀、纤维素等，可捕获粒径在0.1 μm−6.0 μm范围的粒子。微生物气溶胶的收集效率与滤膜类型、孔径以及气体流速有关。枯草芽孢杆菌孢子、MS2病毒粒子、聚丙乙烯乳胶的收集效果比较试验显示，明胶滤膜对粒子的收集率能够达到93%以上，而PC滤膜对0.1 μm以下的粒子收集效率较低[31]。
过滤式采样器采集到的样品需要进行二次处理，操作较复杂，与直接捕获粒子的采样器相比，误差较大。环境条件如空气的湿度会影响采集效果，湿度过低的干燥气体流过滤膜时，会使捕获的生物粒子失去活性[31]；湿度过高时，易在滤膜表面形成水膜，不利于微生物捕捉。适宜的相对湿度通常为30%−85%。另外，过滤法也不适宜长时间采样[32]。
总悬浮颗粒物 (TSP) 采样器是典型的过滤式采样装置，是监测环境大气质量的主要仪器[33]。由于空气的湿度会影响分析结果，李中愚等提出了用恒湿箱存放滤膜、采样期间调节湿度等方法，提高分析结果的准确性[33-34]。TSP-PM10-Ⅱ型中流量颗粒物采样设备小型便携，可以无人值守全天候工作，还可以随时查阅监测数据，适用于采集空气环境监测中总悬浮微粒物。当配备不同的切割器时，还可以采集不同粒径大小的颗粒物[35]。
2 微生物气溶胶采集技术的选择和应用各类采样技术和设备各具特点，自然沉降法和过滤式采样方法的样品采集设备较简单、便于操作和携带。与过滤法相比，沉降法因空气阻力小，还具有捕获率高、能耗低的特点。静电沉降方法在强电力作用下，对亚微米级的小粒子也能有效地收集，适于空气中浓度很低的微生物气溶胶，如致病微生物的采集。对于过敏原和内毒素等粒子的采集，静电采集装置的捕获率比固体撞击式采样器的捕获率高4−10倍[6]。惯性采样法捕获微生物粒子的粒谱范围宽、灵敏度高、选择性好。其中液体撞击式采样器壁损失小，微生物损伤少；撞击式采集技术采样压力低，微生物粒子捕获率高、菌落失活率低[11]。
沉降法主要用于分析室内空气中的微生物气溶胶，如沉降法可应用于化妆品生产车间、办公室、实验室、教室等场所[36-37]。惯性采样法应用广泛，在垃圾填埋场、污水处理厂、畜禽养殖场等均有应用 (表 2)。20世纪以来，Andersen采样器大量应用于检测污水处理过程产生的微生物气溶胶。利用Andersen采样器采集污水处理站空气中气溶胶，研究污水处理产生的微生物气溶胶的特征和影响因素。结果显示污水站空气中的细菌气溶胶在4个季节中均被检出，逸散水平随季节变化明显，夏季细菌的浓度达到4 155 CFU/m3，大部分细菌的粒径为1.1 μm−4.7 µm[38]。惯性采样法也用于检测畜禽养殖场空气细菌总数和活体病原微生物气溶胶粒子的浓度，研究空气中的微生物存活力和繁殖性，为判别病原微生物气溶胶感染养殖场动物的能力提供依据[39]。
| 采样方法 Device for bioaerosols collection |
应用场所 Applications |
微生物种类 Type of microorganism |
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| 沉降法 Sedimentation |
自然沉降法 | 化妆品生产车间、办公室、实验室、教室[36-37] | 细菌、真菌、放线菌 |
| 静电沉降法 | 室内空气[9] | 细菌、真菌、放线菌 | |
| 惯性采样法 Inertial sampling |
固体撞击法 | 垃圾填埋场[41]、污水处理厂[23-24]、室外大气[26, 42]、医院、卫生防疫站、畜禽养殖[39] | 细菌、真菌、放线菌、病毒 |
| 液体冲击法 | 室外大气[43]、污水厂[27]、医院[44] | 细菌、真菌、放线菌、花粉、病毒及其副产物 | |
| 过滤法 Filtration |
室外大气[33] | 细菌、真菌、放线菌 | |
一般地，采集细菌等大的活性粒子时，常用Andersen多级采样器，不仅能测定活性粒子的数量，还能将粒子按粒径分级，也适用于rAdvGFP模式病毒气溶胶的采集[40]。当微生物浓度过高或过低时，使用液体冲击法采集粒子，微生物计数更准确[17]。目前已有的微生物气溶胶的采集仪器和设备种类繁多，应根据需要获得的信息和使用条件进行选择。
3 微生物气溶胶采集技术的发展及可能的趋势1881年创建的自然沉降法可以直观地观察和区分微生物粒子与无机颗粒物，如灰尘等，并且能初步计算空气中微生物粒子的浓度。1945年研发的May cascade impactor不仅能够获得微生物气溶胶的浓度，还能够获得粒径分布的信息。1956年Andersen采样器及计数校正方法的出现更加准确地分析微生物气溶胶粒子的粒径分布和数量。随后的几十年，更多的采样仪器和设备如AGI-30、LWC、Andersen多级采样器被研发出来，用于各种大气环境的微生物检测。随着公众对微生物气溶胶危害认识程度的提高，近年来对其产生机制、逸散方式、扩散模式以及危害环境和人体等方面的研究也越来越多，并逐渐成为研究热点。早期微生物气溶胶的研究主要集中在工厂、医院的室内环境以及畜禽养殖、污水处理等环境，后来逐渐延伸到城市大气环境等方面；分析的微生物种类也由可培养微生物扩展到不可培养微生物；采样设备也逐渐具有专一性和特定性。2016年韩云平等研制的可调式微生物气溶胶采集设备就是对已有的TSP采样器的改进。该装置包括采样系统、延伸系统和延伸固定系统三部分 (图 1)[45]。它可以采集气-液界面及不同垂直高度的微生物气溶胶，具有快速、简易、便携等特点，尤其适用于研究污水处理厂和污水处理站的微生物气溶胶的逸散特征和扩散规律。
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| 图 1 一种可调式的污水处理厂/处理站微生物气溶胶采集装置示意图 Figure 1 Thediagram of an adjustable device for the collection of microbial aerosol from sewage treatment plant/station 注：1：采样系统；2：延伸系统；3：延伸固定系统. Note: 1: Sampling system; 2: Extension system; 3: Extended fixed system. |
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1860年至今的150多年里，被研发的微生物气溶胶采集仪器和设备多种多样，在环境监测和风险评估方面发挥了重要的作用。它们不仅能对空气中的微生物浓度进行量化并进行健康风险评价，还能进行有效的监测以制定相应控制措施并评估措施效果。今后，其研发将着重于提高采集精度、粒径分级程度以及减少微生物损伤等方面。
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