2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 魏文涛, 姚焱彬, 刘全喜, 杨志鹏, 魏建忠, 孙裴, 李郁
- WEI Wen-Tao, YAO Yan-Bin, LIU Quan-Xi, YANG Zhi-Peng, WEI Jian-Zhong, SUN Pei, LI Yu
- 2012-2015年江淮地区猪丹毒杆菌分离株血清型、spaA基因遗传进化及PFGE基因型分析
- Analysis of serotypes, spaA gene phylogeny and PFGE genetic patterns of Erysipelothrix rhusiopathiae isolated between 2012 and 2015 in Jianghuai areas
- 微生物学通报, 2017, 44(3): 664-672
- Microbiology China, 2017, 44(3): 664-672
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160247
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文章历史
- 收稿日期: 2016-03-25
- 接受日期: 2016-05-09
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-08-01
2. 安徽省畜禽产业共性技术研究院 安徽 合肥 230036
2. Anhui Institute of Generic Industrial Science and Technology in Livestock and Poultry, Hefei, Anhui 230036, China
猪丹毒 (Swine erysipelas) 是由猪丹毒杆菌 (Erysipelothrix rhusiopathiae) 引起的一种人兽共患传染病，临诊特征主要包括急性败血症、皮肤荨麻疹和多发性关节炎，该病广泛流行于世界各地，给养猪业造成很大的经济损失[1]。
猪丹毒杆菌血清型众多，迄今已确认的血清型有26个 (即1a、1b、2-24及N型)，约80%以上的猪源分离菌株属于1型 (包括1a和1b) 和2型。不同血清型菌株的致病力不同，1型毒力最强，主要引起急性败血型猪丹毒，2型毒力较弱，主要与疹块型或关节炎型猪丹毒有关[2]。我国致病猪丹毒杆菌主要是1a、1b和2型。免疫接种是预防和控制猪丹毒的重要措施，当前我国使用的疫苗有猪丹毒G4T10或GC42弱毒活菌苗、猪丹毒灭活菌苗以及猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联活疫苗等。
猪丹毒杆菌spaA基因编码的产物为表面保护性抗原 (Surface protect antigen，Spa)，根据基因水平和蛋白水平的差异，可将Spa分为SpaA、SpaB、SpaC三类。研究发现，SpaA仅存在于毒力较强的血清型1a、1b、2、5、8、9、12、15、16、17和N型的菌株中，不仅具有良好的免疫原性及免疫保护功能，而且是猪丹毒杆菌的重要致病因子[3]。通过spaA基因的遗传进化研究，可从基因水平上分析猪丹毒杆菌分离株之间的差异[4]。
近年来，脉冲场凝胶电泳技术 (PFGE) 开始广泛应用于多种细菌的分子流行病学研究中。与传统的血清型分型方法相比，PFGE具有更高的分辨力和敏感性，被誉为细菌分型的“金标准”，它能够从细菌基因组水平上分析不同时间、不同地区散在分布菌株之间的流行病学相关性，了解疫病流行的内在规律[5]。此外，Opriessnig等[6]和Sawada等[7]研究报道PFGE可用于区分猪丹毒杆菌疫苗株与野毒株。
在20世纪80年代和90年代初，猪丹毒与猪瘟、猪肺疫并称为我国养猪业的三大传染病，虽已有二十余年极少见到，但近几年来，在江西、浙江、湖南、四川、云南、广州、福建、安徽等地均有猪丹毒散发的报道，猪丹毒似乎又有卷土重来的趋势。本研究系对2012-2015年江淮地区临床分离鉴定的42株猪丹毒杆菌进行血清型鉴定、spaA基因遗传进化分析和PFGE基因分型，旨在了解当前该地区猪丹毒的流行特点以及致病菌株的差异，为有效防控猪丹毒提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 受试菌株42株猪丹毒杆菌源自2012-2015年江淮地区临诊病例，详细背景资料见表 1。按地理位置分布，长江以南包括宣城、黄山、马鞍山；江淮之间包括合肥、安庆、六安；淮河以北包括蚌埠、亳州、阜阳、淮南、宿州。猪丹毒活疫苗 (G4T10株1a型)、猪丹毒活疫苗 (GC42株1a型) 分别购自哈药集团生物疫苗有限公司和辽宁益康生物股份有限公司；沙门氏菌标准株H9812由安徽农业大学动物传染病研究室保存。
| 菌株Strain | 地点Origin isolated | 时间Time | 来源Source |
| LA120609 | 六安 | 2012.06.09 | 败血症型 |
| HF120827 | 合肥 | 2012.08.27 | 败血症型 |
| TL120914 | 铜陵 | 2012.09.14 | 败血症型 |
| MAS120915 | 马鞍山 | 2012.09.15 | 败血症型 |
| HF120919 | 合肥a | 2012.09.19 | 败血症型 |
| HF120922 | 合肥a | 2012.09.22 | 败血症型 |
| HS121019 | 黄山 | 2012.10.19 | 疹块型 |
| HF130201 | 合肥a | 2013.02.01 | 败血症型 |
| HF130329 | 合肥a | 2013.03.29 | 败血症型 |
| HF130415 | 合肥 | 2013.04.15 | 败血症型 |
| BB130721 | 蚌埠b | 2013.07.21 | 败血症型 |
| AQ130724 | 安庆 | 2013.07.24 | 败血症型 |
| BB130724 | 蚌埠b | 2013.07.24 | 败血症型 |
| AQ130725 | 安庆 | 2013.07.25 | 败血症型 |
| BB130725 | 蚌埠b | 2013.07.25 | 败血症型 |
| XC130727 | 宣城 | 2013.07.27 | 败血症型 |
| HF130729 | 合肥 | 2013.07.29 | 疹块型 |
| HN130805 | 淮南 | 2013.08.05 | 败血症型 |
| AQ130807 | 安庆 | 2013.08.07 | 败血症型 |
| HF130810 | 合肥 | 2013.08.10 | 败血症型 |
| BB130818 | 蚌埠b | 2013.08.18 | 败血症型 |
| HF130820 | 合肥 | 2013.08.20 | 败血症型 |
| BB130822 | 蚌埠b | 2013.08.22 | 败血症型 |
| BZ130831 | 亳州 | 2013.08.31 | 败血症型 |
| HF130921 | 合肥 | 2013.09.21 | 败血症型 |
| LA130925 | 六安 | 2013.09.25 | 关节炎型 |
| BB131008 | 蚌埠b | 2013.10.08 | 败血症型 |
| LA131010 | 六安 | 2013.10.10 | 败血症型 |
| HF140320 | 合肥 | 2014.03.20 | 败血症型 |
| SZ140326 | 宿州 | 2014.03.26 | 败血症型 |
| HF140607 | 合肥 | 2014.06.07 | 败血症型 |
| LA140620 | 六安 | 2014.06.20 | 败血症型 |
| XC140709 | 宣城 | 2014.07.09 | 败血症型 |
| AQ140814 | 安庆 | 2014.08.14 | 败血症型 |
| TL140918 | 铜陵 | 2014.09.18 | 败血症型 |
| LA140929 | 六安 | 2014.09.29 | 败血症型 |
| FY141002 | 阜阳 | 2014.10.02 | 败血症型 |
| AQ150411 | 安庆 | 2015.04.11 | 败血症型 |
| AQ150414 | 安庆 | 2015.04.14 | 败血症型 |
| BZ150422 | 亳州 | 2015.04.22 | 败血症型 |
| FY150511 | 阜阳 | 2015.05.11 | 败血症型 |
| LA150627 | 六安 | 2015.06.27 | 败血症型 |
| 注：a、b代表分离株分别分离自A猪场、B猪场. Note: a, b represent the strains were isolated from farm A and farm B. | |||
脑心浸液肉汤 (BHI)、脑心浸液琼脂 (BHIA) 及LB培养基购自绍兴天恒生物科技有限公司；Prime STAR® Max DNA Polymerase、pMD19-T载体、Sma Ⅰ、Xba Ⅰ内切酶购自TaKaRa公司；十二烷基肌氨酸钠 (Sarcosyl)、溶菌酶、脱氧胆酸钠 (Sodium deoxycholate) 购自Solarbio公司；聚氧乙烯月桂醚 (Brij-35) 购于北京拜尔迪生物技术有限公司；蛋白酶K购自Merck公司；SeaKem Gold Agarose购自Lonza公司。CHEF-DR Ⅱ脉冲场凝胶电泳仪购自美国Bio-Rad公司；TProfessional Thermocycler梯度PCR仪购自德国耶拿分析仪器股份公司。
1.3 血清型鉴定参照文献[8]制备分型抗原，略做改动。在含10%犊牛血清的30 mL BHI (37 g/L) 培养基中接种猪丹毒杆菌受试菌株，37 ℃培养48 h，加入终浓度为1%的甲醛溶液，室温下静置24 h灭活，4 000 r/min离心15 min收集菌体，弃上清液，用含5%甲醛的PBS溶液洗涤，重复3次，1 mL灭菌蒸馏水重悬，110 kPa高压灭菌45 min，5 000 r/min离心5 min收集上清，送至英国爱丁堡大学Dr. Tanja Opriessnig的实验室进行血清型鉴定。
1.4 spaA基因克隆测序参照GenBank中登录的猪丹毒杆菌spaA基因序列设计一对引物，P1：5′-ATGAAAAAGAAAAAA CACCTATT-3′；P2：5′-CTATTTTAAACTTCCATCG TTC-3′，预期目的片段大小为1 881 bp。采用煮沸法提取细菌全基因组DNA作为PCR模板。PCR反应体系 (25 μL)：Prime STAR® Max DNA Polymerase 12.5 μL，模板 (10 mg/L) 2 μL，上下游引物 (10 μmol/L) 各0.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，51 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收目的片段，与pMD19-T载体连接过夜，转化DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板上，PCR鉴定阳性克隆，提取质粒经双酶切鉴定后，送至南京金斯瑞生物公司测序。将测序结果登录GenBank，并采用DNAStar中的MegEditSeq和MEGA 4.1软件与NCBI中已发表的spaA基因序列 (表 2) 进行相似性比较和遗传进化分析。
| 登录号Accession No. | 菌株名称及血清型Strains name and serotype | 地区 (时间) 及来源Area (time) and source |
| AB019124 | Fujisawa (1a) | 日本 (1998)，猪 |
| KF177344 | GD1201 (−) | 广东 (2013)，猪 |
| KJ660060 | GD-GZ (1a) | 广东 (2014)，猪 |
| EF635597 | C43311 (2) | 湖南 (2007)，猪 |
| JF710589 | M11 (−) | 湖南 (2011)，猪 |
| KC661045 | XY10.2 (−) | 湖南 (2010)，猪 |
| AB259653 | 422/1E1 (1b) | 日本 (2006)，猪 |
| KR606305 | ATCC 19414 (2) | 德国 (2015)，猪 |
| 注：−：未知血清型. Note: −: non serotype. | ||
参照美国疾病控制与预防中心 (CDC) 的PulseNet实验手册及文献[9]并略作调整。
1.5.1 细菌处理: 复苏冻存的猪丹毒杆菌分离株及沙门氏菌H9812标准菌株。用灭菌棉签取适量菌落于1.5 mL CSB溶液 (0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L EDTA，pH 8.0) 中制备菌悬液，混匀后调节至OD610约为1.3-1.4，取200 μL菌悬液于1.5 mL EP管中37 ℃保温10 min。 1.5.2 细菌裂解与酶切: 猪丹毒杆菌处理：用1×TE溶液制备1% SeaKem Gold Agarose：1% SDS琼脂糖，56 ℃水浴中预热，取200 μL与制备好的菌悬液轻轻混匀，之后取适量加入模具中，置室温或4 ℃中冷却；将胶块转移到终浓度为1 g/L的溶菌酶缓冲液 (0.006 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L EDTA，1 mol/L NaCl，0.5% Sarcosyl，0.2% Sodium deoxycholae，0.2% Brij 35，pH 8.0) 中，37 ℃、130 r/min水浴摇床处理12 h，破碎细胞壁；将胶块转移到终浓度为0.5 g/L的蛋白酶K裂解液 (0.25 mol/L EDTA，0.02 mol/L NaCl，1% Sarcosyl，pH 8.0) 中，55 ℃、130 r/min处理20 h，除去蛋白；用55 ℃预热的灭菌超纯水和1×TE溶液分别清洗3遍，每次15 min；胶块经Sma Ⅰ 25 ℃酶切7 h；用0.5×TBE溶液配制1% SeaKem Gold Agarose胶进行脉冲场凝胶电泳。沙门氏菌标准株H9812处理：200 μL菌悬液中加入20 μL蛋白酶K (20 g/L) 后与等量上述琼脂糖混合后制备小胶块；将胶块转移至5 mL CLB溶液 (0.05 mol/L Tris，0.05 mol/L EDTA，l% Sarcosyl，0.1 g/L蛋白酶K，pH 8.0) 中，55 ℃、130 r/min水浴摇床中裂解2 h；洗胶后经Xba Ⅰ 37 ℃酶切5 h，电泳。
1.5.3 电泳条件: 配制0.5×TBE电泳缓冲液，依次设置电泳参数：温度14 ℃，脉冲夹角120°，电压6 V/cm，第一阶段，起始转换时间1.3 s，最后转换时间为45 s，电泳时间17 h；第二阶段，起始与最后转换时间均为6.5 s，电泳时间1.4 h。 1.5.4 图像的获取与分析: 电泳完毕，将胶块置于1 mg/L溴化乙锭溶液中染色30 min，再置超纯水中脱色30 min。凝胶成像系统仪中获取图谱并以Tiff格式保存图像。电泳图像采用BioNumeries (version7.1) 软件处理，用非加权配对算术平均法 (UPGMA) 进行聚类分析，构建聚类树。参照文献[10-11]进行结果判定：当菌株间PFGE图谱完全相同时，判定为菌株一致；当图谱相差1-3个条带，且菌株相似度 > 85%时，判定为密切相关；当图谱相差4-6个条带，且相似度在50%-85%时，判定为可能相关；当图谱相差7个条带以上，且相似度 < 50%时，判定为不相关。 2 结果与分析 2.1 血清型鉴定42株猪丹毒杆菌分离株血清型均为1a型。
2.2 spaA基因序列分析在42株猪丹毒杆菌分离株中，有40株spaA基因全长均为1 881 bp，只有HF120919和SZ140326为1 821 bp。猪丹毒活疫苗G4T10株 (1a型) 和GC42株 (1a型) spaA基因全长分别为1 761 bp和1 641 bp。分离株之间核苷酸序列相似性为99.9%-100%，其中有37株相似性为100%；分离株与湖南M11株和XY10.2株、广东GD-GZ株 (1a型) 和GD1201株、猪丹毒活疫苗G4T10株 (1a型) 和GC42株 (1a型)、日本Fujisawa株 (1a型) 和422/1E1株 (1b型) 的核苷酸相似性均很高，为99.7%-100%，与德国ATCC19414株 (2型)、湖南C43311株 (2型) 的核苷酸相似性为98.5%−99.1% (表 3)。
| 菌株Strain | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 |
| 1 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 100 | 99.9 | 99.9 | 100 | 100 | 99.9 | 99.9 | 99.8 | 99.8 | 99.0 | 98.5 | |
| 2 | 0.0 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.8 | 99.8 | 99.8 | 99.7 | 99.0 | 98.5 | |
| 3 | 0.0 | 0.1 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.8 | 99.8 | 99.8 | 99.7 | 99.0 | 98.5 | |
| 4 | 0.0 | 0.1 | 0.1 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.8 | 99.8 | 99.8 | 99.7 | 99.0 | 98.5 | |
| 5 | 0.0 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.8 | 99.8 | 99.8 | 99.7 | 99.0 | 98.5 | |
| 6 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 99.9 | 99.9 | 100 | 100 | 99.9 | 99.9 | 99.8 | 99.8 | 99.1 | 98.8 | |
| 7 | 0.0 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.0 | 100 | 99.9 | 99.9 | 99.8 | 99.8 | 99.9 | 99.8 | 99.0 | 98.6 | |
| 8 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.0 | 99.9 | 99.9 | 99.9 | 99.8 | 99.9 | 99.8 | 99.0 | 98.8 | |
| 9 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.1 | 100 | 99.9 | 99.9 | 99.8 | 99.8 | 99.0 | 98.5 | |
| 10 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.1 | 0.0 | 99.9 | 99.9 | 99.8 | 99.8 | 99.0 | 98.5 | |
| 11 | 0.1 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 99.8 | 99.7 | 99.7 | 98.9 | 98.4 | |
| 12 | 0.1 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.1 | 0.2 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | 99.7 | 99.7 | 98.9 | 98.4 | |
| 13 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | 0.2 | 0.3 | 0.3 | 99.8 | 99.1 | 98.5 | |
| 14 | 0.2 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.3 | 0.3 | 0.2 | 99.0 | 98.6 | |
| 15 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 0.9 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.1 | 1.1 | 0.9 | 1.0 | 98.0 | |
| 16 | 1.5 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.2 | 1.4 | 1.2 | 1.5 | 1.5 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.4 | 2.1 | |
| 注：右上方为spaA基因核苷酸序列相似性比较，左下方为离散度. 1：以LA120609株为代表的基因序列完全相同的37株菌株；2：HF140607株；3：SZ140326株；4：TL140918株；5：FY150511株；6：HF120919株；7：G4T10株；8：GC42株；9：M11株；10：XY10.2株；11：GD1201株；12：GD-GZ株；13：Fujisawa株；14:422/1E1株；15：C43311株；16：ATCC19414株. Note: Nucleotide similarity of spaA gene on the upper right and the divergence on the lower left; 1: LA120609 represent 37 strains of idential spaA gene sequence; 2: Strain HF140607; 3: Strain SZ140326; 4: Strain TL140918; 5: Strain FY150511; 6: Strain HF120919; 7: Strain G4T10; 8: Strain GC42; 9: Strain M11; 10: Strain XY10.2; 11: Strain GD1201; 12: Strain GD-GD; 13: Strain Fujisawa; 14: Strain 422/1E1; 15: Strain C43311; 16: Strain ATCC19414. | ||||||||||||||||
与野生型强毒株Fujisawa株相比，42株猪丹毒杆菌spaA基因在609 bp处由T突变为G，对应203位氨基酸由Ile突变为Met，即为Met-203型菌株；在769 bp处由C突变为A，对应257位氨基酸由Leu突变为Ile，即为Ile-257型菌株；除此之外，FY150511株在203 bp处A突变为G，对应77位氨基酸由Gln突变为Arg；HF140607株在347 bp处由A突变为G，对应116位氨基酸由Asn突变为Ser；SZ140326株在803 bp处由G突变为T，对应268位氨基酸由Arg突变为Leu；TL140918株在865 bp处由G突变为T，对应289位氨基酸由Val突变为Phe。猪丹毒弱毒苗G4T10株和GC42株在609 bp处未发生改变，对应203位氨基酸为Ile，即为Ile-203型菌株，仅在769 bp处由C突变为A，对应257位氨基酸由Leu突变为Ile。建立的spaA基因遗传进化树显示，分离株与湖南M11株和XY10.2株、广东GD-GZ株 (1a型) 和GD1201株处于同一分支，亲缘关系最近，其次是猪丹毒弱毒苗G4T10株 (1a型) 和GC42株 (1a型)、日本Fujisawa株 (1a) 和422/1E1株 (1b型)，而与湖南C43311株 (2型)、德国ATCC19414株 (2型) 的亲缘关系较远 (图 1)。
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| 图 1 42株分离菌与参考菌株spaA基因序列的系统进化树 Figure 1 Phylogenetic tree based on spaA gene sequence of the 42 isolated strains and reference strains 注：LA120609代表spaA基因序列完全相同的37株分离菌株；括号内代表GenBank序列登录号；标尺代表进化距离；分支点上的数字代表分支的可靠程度. Note: LA120609 represent 37 strains of idential spaA gene sequence. The serial number in the bracket is GenBank accession number. The scaleplate is evolutionary distance. The number at each branch points is the percentage supported by bootstrap. |
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42株猪丹毒杆菌分离株和2株猪丹毒弱毒菌苗株 (G4T10、GC42) 被Sma Ⅰ内切酶切成大小为20.5-336.5 kb的12−14条片段 (图 2)。按照100%相似度将分离菌株分为8种PFGE基因型，分别命名为ER1-ER8，优势基因型为ER2型，占54.8% (23/42)，其次为ER7型占21.4% (9/42)，ER1型占7.1% (3/42)，ER6、ER8型均占4.7% (2/42)，ER3、ER4、ER5均占2.4% (1/42)，不同型之间相似度为88.8%-94.7%。G4T10株和GC42株相似度达100%，均为ER9型，与ER8型 (包括LA140929和FY141002株) 相似度最高 (96.3%) (图 3)。
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| 图 2 部分猪丹毒杆菌分离株脉冲场凝胶电泳结果 Figure 2 Partial PFGE images of Erysipelothrix rhusiopathiae 注：1、8、13：标准株H9812；2：G4T10株；3：GC42株；4：FY141002株；5：AQ150411株；6：AQ150414株；7：BZ150422株；9：FY150511株；10：HF140320株；11：LA150627株；12：AQ130807株. Note: 1, 8, 13: salmonella H9812; 2: Vaccine strain G4T10; 3: Vaccine strain GC42; 4: Strain FY141002; 5: Strain AQ150411; 6: Strain AQ150414; 7: Strain BZ150422; 9: Strain FY150511; 10: Strain HF140320; 11: Strain LA1506 27; 12: Strain AQ130807. |
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| 图 3 42株猪丹毒杆菌分离株PFGE基因型聚类树 Figure 3 PFGE genotype of 42 Erysipelothrix rhusiopathiae strains |
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猪丹毒杆菌血清型众多，在已报道的26种血清型中，至少有15种可以引起猪的感染。20世纪80年代，徐克勤等[12]对源自我国14个省市的234株猪丹毒杆菌，鉴定优势血清型为1a型和2型，其中9株安徽分离株均为1a型。近年来，美国、日本等国猪丹毒的发生明显增多，致病猪丹毒杆菌的血清型均以1a型和2型为主[13-14]。本研究中42株猪丹毒杆菌的血清型均属于1a型，这与2015年Zou等[15]对我国东部地区猪丹毒流行菌株血清型的调查结果完全相同。由此可见，在江淮地区卷土重来的猪丹毒，其致病菌的血清型还是毒力强的1a型，优势血清型至今没有发生变化，现有的猪丹毒G4T10株和GC42株弱毒疫苗依然有效。而没有2型菌株的出现，其原因可能在于菌株源自的临床病例数量有限，并且92.9%的临床病例属于急性败血型。
spaA基因在42株猪丹毒杆菌分离株之间仅有0-1个核苷酸的差别，其中有37株的基因序列完全一致，显示江淮地区致病猪丹毒杆菌变异性较小，同时与湖南、广东两地分离菌株的核苷酸相似性在99.8%以上，遗传进化树中处于同一分支，表明致病猪丹毒杆菌在江淮地区与湖南、广东两地之间有一定的遗传关系，存在跨地区传播的可能。42株猪丹毒杆菌分离株 (1a型) 与猪丹毒弱毒苗G4T10株 (1a型) 和GC42株 (1a型)、Fujisawa株 (1a型)、422/1E1株 (1b型)、C43311株 (2型)、ATCC19414株 (2型) 的核苷酸相似性为98.5%-99.9%，进一步证明spaA基因在猪丹毒杆菌血清型1a、1b、2型中的高度保守性和相似性[16]，而临床猪丹毒杆菌分离菌又以血清型1a、1b、2型为主。因此由spaA基因编码的SpaA蛋白作为主要免疫保护性抗原，为猪丹毒杆菌亚单位疫苗的研发提供了支持。
To等[14]在对日本2008-2011年间猪丹毒杆菌分离株的研究中发现，95%以上菌株为Met-203、Ile-257型，主要源自急性败血症病例。Uchiyama等[17]也报道了日本在2008-2010年间分离的猪丹毒杆菌中，50%以上为Met-203、Ile-257型菌株，全部来自急性败血症病例，同时研究结果还显示Met-203、Ile-257型菌株对小鼠具有很强的致病力，其中4株分离菌的LD50为4.5-14.5 CFU/mL，为强毒菌。Zou等[15]研究发现我国东部地区猪丹毒杆菌分离株50%为Met-203、Ile-257型，全部分离自急性败血症病例，103 CFU/mL的受试菌 (共计8株) 全都可以引起小鼠100%死亡，毒力较强。本研究中，42株猪丹毒杆菌100%为Met-203、Ile-257型菌株，39株 (92.9%) 来自急性败血症病例，陆萍等[18]已报道了本研究中的8株分离菌对小鼠的LD50均在14.30-2.36×102 CFU/mL之间，属于强毒菌，与上述研究报道相一致。猪丹毒弱毒活疫苗G4T10株和GC42株则均为Ile-203、Ile-257菌型。综上表明，Met-203、Ile-257型菌株致病力强，是江淮地区致病猪丹毒杆菌的流行菌型。
PFGE是近年发展起来的一种重要的分离大分子量DNA的电泳技术。1996年Feizabadi等[19]首次用于兽医领域，对牛结核分支杆菌与其他肺结核分支杆菌属进行基因组分析。2001年Okatani等[9]首次将PFGE应用于猪丹毒杆菌的分型研究，发现该方法较血清学分型、RAPD分型以及核糖体分型的能力更强。本研究在分离菌株血清型全部一致、spaA基因高度相似性的基础上，进行PFGE分型。42株猪丹毒杆菌分成8个PFGE基因型，其之间仅有0-2个条带的差异，菌株间相似度 > 88.8%，源于同一克隆系，表明江淮地区致病猪丹毒杆菌变异小、亲缘关系密切；同时ER2型菌株占优势，为江淮地区致病猪丹毒杆菌流行菌株的优势基因型，这可能是由于ER2型菌株可在不同环境中表现某种适应性，导致ER2型菌株在江淮地区大范围的流行。
虽然不同菌株的PFGE基因型与其分离地点和分离时间无明显相关性，但是在同一猪场不同时间暴发的猪丹毒致病菌则可为同一个菌株，例如B猪场，2013年7月-10月发生6起猪丹毒疫情，自病死猪中分离的6株猪丹毒杆菌，其PFGE基因型完全一致，这可能是由于猪丹毒杆菌对外界环境的抵抗力很强，一旦侵入到环境中，会借助土壤、昆虫、鼠类、鸟类等各种途径进行传播。同一猪场不同时间暴发的猪丹毒致病菌也可为不同的菌株，例如A猪场，2012年9月-2013年3月发生4起猪丹毒疫情，自病死猪中分离到4株猪丹毒杆菌，2012年和2013年各分离的2株猪丹毒杆菌PFGE基因型完全一致，而两年之间菌株的PFGE基因型则不相同，表现为2013年菌株缺少了1个大小为28.8-33.3 kb条带，一种原因可能是猪丹毒杆菌具有很强的潜伏性，在传播过程中发生了变异，另一种原因可能是通过外来途径引入了其它基因型猪丹毒杆菌。此外，Opriessnig等[6]应用PFGE技术对90株源自美国中西部猪丹毒杆菌和4株疫苗株进行比较，结果显示分离株呈现多样性，与疫苗株之间存在差别，证实PFGE能够很好的区分野毒株与疫苗株。在本研究的42株猪丹毒杆菌分离株中，没有发现与疫苗株相同的PFGE基因型，与Opriessnig等[6]的研究报道一致；同时基于spaA基因分析，分离株均为Met-203、Ile-257型，疫苗株为Ile-203、Ile-257型，两者在609 bp处存在差异；并且江淮地区大部分猪场已多年停止使用猪丹毒疫苗，由此可以排除江淮地区猪丹毒的暴发与疫苗株毒力返强有关的可能。
| [1] | Wang QN, Chang BJ, Riley TV. Erysipelothrix rhusiopathiae[J]. Veterinary Microbiology, 2010, 140(3/4) : 405–417. |
| [2] | Bender JS, Shen HG, Irwin CK, et al. Characterization of Erysipelothrix species isolates from clinically affected pigs, environmental samples, and vaccine strains from six recent swine erysipelas outbreaks in the United States[J]. Clinical and Vaccine Immunology, 2010, 17(10) : 1605–1611. DOI:10.1128/CVI.00206-10 |
| [3] | Borrathybay E, Gong FJ, Zhang L, et al. Role of surface protective antigen A in the pathogenesis of Erysipelothrix rhusiopathiae strain C43065[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2015, 25(2) : 206–216. DOI:10.4014/jmb.1407.07058 |
| [4] | To H, Nagai S. Genetic and antigenic diversity of the surface protective antigen proteins of Erysipelothrix rhusiopathiae[J]. Clinical and Vaccine Immunology, 2007, 14(7) : 813–820. DOI:10.1128/CVI.00099-07 |
| [5] | Ye R, Shi LY, Wang P, et al. Brief introduction of pulsed-field gel electrophoresis and its application in bacterial molecular typing[J]. Chinese Journal of Vector Biology and Control, 2013, 24(2) : 182–185. (in Chinese) 叶蕊, 石丽媛, 王鹏, 等. 脉冲场凝胶电泳技术简介及其在细菌分子分型中的应用[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2013, 24(2) : 182–185. |
| [6] | Opriessnig T, Hoffman LJ, Harris DL, et al. Erysipelothrix rhusiopathiae: genetic characterization of midwest US isolates and live commercial vaccines using pulsed-field gel electrophoresis[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 2004, 16(2) : 101–107. DOI:10.1177/104063870401600202 |
| [7] | Sawada T, Hassanein R, Takahashi E, et al. Pathogenic and genetic characterization of acriflavine resistant erysipelothrix isolates from arthritic pigs[J]. Journal of Veterinary Epidemiology, 2006, 10(1) : 21–28. DOI:10.2743/jve.10.21 |
| [8] | Ozawa M, Yamamoto K, Kojima A, et al. Etiological and biological characteristics of Erysipelothrix rhusiopathiae isolated between 1994 and 2001 from pigs with swine erysipelas in Japan[J]. Journal of Veterinary Medical Science, 2009, 71(6) : 697–702. DOI:10.1292/jvms.71.697 |
| [9] | Okatani AT, Uto T, Taniguchi T, et al. Pulsed-field gel electrophoresis in differentiation of Erysipelothrix species strains[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2001, 39(11) : 4032–4036. DOI:10.1128/JCM.39.11.4032-4036.2001 |
| [10] | Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1995, 33(9) : 2233–2239. |
| [11] | Talon D, Cailleaux V, Thouverez M, et al. Discriminatory power and usefulness of pulsed-field gel electrophoresis in epidemiological studies of Pseudomonas aeruginosa[J]. Journal of Hospital Infection, 1996, 32(2) : 135–145. DOI:10.1016/S0195-6701(96)90055-9 |
| [12] | Xu KQ, Hu XF, Lu QY. Serotype identification of Erysipelothrix rhusiopathiae isolated in different aera of China[J]. Jiangsu Agricultral Science, 1982(6) : 35–38. (in Chinese) 徐克勤, 胡秀芳, 陆琴英. 我国不同地区分离的猪丹毒杆菌血清型鉴定[J]. 江苏农业科学, 1982(6) : 35–38. |
| [13] | Bender JS, Irwin CK, Shen HG, et al. Erysipelothrix spp. genotypes, serotypes, and surface protective antigen types associated with abattoir condemnations[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 2011, 23(1) : 139–142. DOI:10.1177/104063871102300126 |
| [14] | To H, Sato H, Tazumi A, et al. Characterization of Erysipelothrix rhusiopathiae strains isolated from recent swine erysipelas outbreaks in Japan[J]. Journal of Veterinary Medical Science, 2012, 74(7) : 949–953. DOI:10.1292/jvms.11-0533 |
| [15] | Zou Y, Zhu XM, Muhammad HM, et al. Characterization of Erysipelothrix rhusiopathiae strains isolated from acute swine erysipelas outbreaks in Eastern China[J]. Journal of Veterinary Medical Science, 2015, 77(6) : 653–660. DOI:10.1292/jvms.14-0589 |
| [16] | Ingebritson AL, Roth JA, Haeur PJ. Erysipelothrix rhusiopathiae: Association of Spa-type with serotype and role in protective immunity[J]. Vaccine, 2010, 28(13) : 2490–2496. DOI:10.1016/j.vaccine.2010.01.041 |
| [17] | Uchiyama M, Yamamoto K, Ochiai M, et al. Prevalence of Met-203 type spaA variant in Erysipelothrix rhusiopathiae isolates and the efficacy of swine erysipelas vaccines in Japan[J]. Biologicals, 2014, 42(2) : 109–113. DOI:10.1016/j.biologicals.2013.12.002 |
| [18] | Lu P, Huang XH, Li CF, et al. Isolation, identification and characterization of Erysipelothrix rhusiopathiae in Anhui province[J]. Microbiology China, 2014, 41(9) : 1822–1828. (in Chinese) 陆萍, 黄晓慧, 李春芬, 等. 安徽部分地区猪丹毒杆菌的分离鉴定及生物学特性研究[J]. 微生物学通报, 2014, 41(9) : 1822–1828. |
| [19] | Feizabadi MM, Robertson ID, Cousins DV, et al. Genomic analysis of Mycobacterium bovis and other members of the Mycobacterium tuberculosis complex by isoenzyme analysis andpulsed-field gel electrophoresis[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1996, 34(5) : 1136–1142. |