2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 杨金保, 刘卫, 姜南, 吴海龙, 李岩, 李润植, 张红梅, 解志红
- YANG Jin-Bao, LIU Wei, JIANG Nan, WU Hai-Long, LI Yan, LI Run-Zhi, ZHANG Hong-Mei, XIE Zhi-Hong
- 茎瘤固氮根瘤菌甲基化受体蛋白Tlp1的功能
- Function of a methyl-accepting chemotaxis protein Tlp1 in Azorhizobium caulinodans ORS571
- 微生物学通报, 2017, 44(3): 648-654
- Microbiology China, 2017, 44(3): 648-654
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160270
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文章历史
- 收稿日期: 2016-03-31
- 接受日期: 2016-06-13
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-07-19
2. 中国科学院烟台海岸带研究所 山东 烟台 264003
2. Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai, Shandong 264003, China
茎瘤固氮根瘤菌 (Azorhizobium caulinodans ORS571) 属于α-变形菌，与其它根瘤菌一样，可以固定大气中游离的氮，为宿主提供氮素养料，从而减少宿主对土壤中氮肥的需求。此外，它还有一个与其它根瘤菌不同的特点：它既可以与豆科宿主毛萼田菁 (Sesbania rostrata) 共生固氮，又可以自生或作为内生菌在其它植物体内固氮[1]，能够同时在根部和茎上结瘤[2]。这样，茎瘤固氮根瘤菌具有根瘤菌的共性和自生固氮的特点，赋予其比其它根瘤菌更为独特的研究价值。
细菌趋化性是指运动性细菌对其生长环境中存在的化学物质的浓度梯度所进行趋向或远离该化学物质的反应，是细胞对碳源、能源竞争的一种表现[3-4]。土壤中的细菌能够感受植物根部释放出的信号物质，因此趋化作用是许多种属植物的根系细菌侵染、定殖的起始[5]，也在固氮菌与植物共生关系建立中发挥重要作用[6]。对根瘤菌趋化性研究较多的是苜蓿中华根瘤菌 (Sinorhizobium meliloti) 和豌豆根瘤菌 (Rhizobium leguminosarum bv. viciae)。目前，对于茎瘤固氮根瘤菌趋化研究的报道并不多见。
信号受体蛋白是趋化系统的重要组成部分。它是位于细菌细胞质膜上，可以感受外界或细胞内部的趋化物质并将信号向下游传递的蛋白。通常由位于胞外的与区划物质结合的结合结构域、两个跨膜区和多个胞内结构域组成，胞内结构域包括HAMP区域、甲基化区域和信号区。
基因组分析发现，茎瘤固氮根瘤菌与其它菌属相比趋化系统具有高度同源性，但同时存在自身的独特性[7]。其含有大量与细菌运动和趋化性相关的基因：43个信号受体蛋白，一个趋化基因簇 (由CheA组氨酸蛋白激酶、CheW蛋白、CheY1反应调节蛋白、CheR/CheB适应蛋白组成)，以及CheY2反应调节蛋白及CheZ磷酸酯酶[8]。AZC0660位于基因簇上游，是一个甲基化受体蛋白，被命名为Tlp1 (Transducer-like protein)，由一个高度可变的负责与刺激物结合的细胞周质感受区和一个保守的提供与CheA和CheW结合平台的细胞质信号区构成，推测其是一个与趋化相关的受体蛋白。深入研究受体蛋白tlp1的功能及调控机理，有助于更为深入和全面地了解茎瘤固氮根瘤菌ORS571的趋化机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒: 实验中用到的菌株和质粒详见表 1。| Strains and plasmids | Relevant characteristics | Source or reference |
| Strains | ||
| A. caulinodans ORS571 | Wild type strain, NaI and Amp | [9] |
| mutant strain | ORS571 derivative, Gen | this study |
| complemented strain | tlp1 mutant derivative, Kan | this study |
| Escherichia coli DH5α | General cloning strain | Transgen |
| Plasmids | ||
| pMD18-T | The vector cloning PCR products, Kan | Takara |
| pCM351 | The construction of mutant, Gen, Tc | [10] |
| pRK2013 | Helper plasmid, carriestra genes, Kan | [11] |
| PBBR1MSC-2 | The construction of complemented strain, Kan | [12] |
| Note: NaI represent nalidixic acid; Amp represent ampicillin; Gen represent gentamicin; Tc represent tetracycline; Kan represent kanamycin. | ||
| Primer | Sequence (5′→3′) | restriction site |
| 0660-up-F | GGGGTACCCCACCAGCCTGTCGATCTG | Kpn Ⅰ |
| 0660-up-R | GGAATTCCATATGTGGCTCGGCTTAGCATCG | Nde Ⅰ |
| 0660-down-F | TCCCCGCGGCCGCTCCGTGCTTAACCCT | Sac Ⅰ |
| 0660-down-R | CGACGCGTTGACCGCGACTTCCTTCTTC | Mlu Ⅰ |
| 0660-F | GCTCGATAACGTGGACCAAC | |
| 0660-R | CCGTCTGAACGTTGCTTGTA | |
| 0660-com-F | CGTCTAGAGCCAGGGCTCGAGTACAAG | Xba Ⅰ |
| 0660-com-R | CGAGCTCCCTCTCCCGTGAGGGTTAAG | Sac Ⅰ |
使用引物分别扩增tlp1基因的上游臂782 bp和下游臂768 bp，纯化后分别连接到pEASY载体上进行测序验证。验证正确的上游片段用Kpn Ⅰ和Nde Ⅰ酶切后，将酶切产物与经过Kpn Ⅰ和Nde Ⅰ酶切的PCM351质粒使用T4连接酶连接，得到PCM351::0660up质粒。将PCM351::0660up质粒转入大肠杆菌感受态中，通过菌落PCR验证，并将验证正确的克隆子进行质粒提取后酶切验证。用同样的方法，将测序验证正确的下游片段连接在酶切验证正确的PCM351::0660up质粒上，得到PCM351::0660up-down质粒。
1.3 茎瘤固氮根瘤菌tlp1突变株的构建将含有PCM351::0660up-down质粒的大肠杆菌DH5α、含有辅助质粒PRK2013的大肠杆菌DH5α、野生型菌株ORS571按一定比例做三亲本结合[15]，用PCM351质粒中914 bp的庆大基因片段和tlp1基因的1 913 bp片段重组互换。用抗性的方法在TY平板上筛选突变株，并用在tlp1基因内部设计的一对引物0660-up/0660-down来验证重组载体是否整合到野生型ORS571的染色体上，得到tlp1突变株。
1.4 回补菌株的构建以tlp1基因全长加启动子区域及其下游30 bp共2 139 bp作为回补片段，连接到pEASY载体上进行测序。验证正确的回补片段用Xba Ⅰ和Sac Ⅰ酶切后，将酶切产物与经过Xba Ⅰ和Sac Ⅰ酶切的PBBR1MSC-2质粒使用T4连接酶进行连接获得包含回补序列的载体PBBR1MSC-2׃׃0660-com，运用三亲本接合转移的方法将该载体转入tlp1突变株中。挑选在含有NaI、Gen和Kan抗性的TY平板上的单菌落，通过PCR验证得到tlp1回补菌株。为了排除PBBR1MSC-2质粒的影响，在野生型菌株和tlp1突变株中转入了该空载质粒。
1.5 生长曲线的测定将待测菌株在TY固体平板上进行活化，取单菌落于TY液体培养基中，37、200 r/min进行再次活化培养至OD600为0.6−0.8。然后取适量菌液转接至50 ml的TY液体培养基中，起始OD600值设为0.05。每隔2 h取样，测定OD600。
1.6 趋化实验趋化实验用半固体平板方法来测定[16]。将37、200 r/min培养过夜的野生型菌株、突变株和回补菌株的OD600值调为0.6−0.8，各取5 μl滴到0.3%的TY半固体培养基上。在37温箱培养3 d左右，观察各菌株的趋化圈大小。
1.7 胞外多糖和次生代谢物的观察配制以甘油 (10 mmol/L) 为碳源的含氮和无氮刚果红固体培养基，其中琼脂的量为15 g/L，刚果红浓度为0.04%。将OD600为0.6−0.8的同浓度野生型菌株、突变株和回补菌株的菌液滴到两种固体刚果红平板上，37培养3 d以后，每天观察各菌株的胞外多糖和次生代谢产物的分泌情况。
1.8 固氮酶活实验采用乙炔还原法 (ARAs) 来测定固氮酶活。将待测的野生型、突变株和回补菌株同时活化，保持生长状态一致，然后接入含有NaI和Amp抗性的液体L3培养基，37 200 r/min振荡培养20 h后，把各菌株用生理盐水洗两次去掉抗性，并调OD600值到1.0。在体积为7 ml的小瓶中加入3 mL的L3半固体培养基，并各接入10 μL菌液，然后注入400 μL新制乙炔并在37温箱静置培养12 h左右。从每个半固体小管中用微量进样器取出100 μL气体用气相色谱法测定乙烯含量，根据各样品乙烯峰值的高低来比较其固氮酶活性高低。固氮酶活测定公式如下：
固氮酶活性=记录仪上乙烯峰的面积×(瓶体积7 mL/进样量100 μL)/(1 nmol标准乙烯峰的面积×反应时间1.3 min)。
2 结果与分析 2.1 tlp1基因的结构分析对茎瘤固氮根瘤菌ORS571进行基因组序列分析，发现甲基化受体蛋白Tlp1位于趋化基因簇的上游 (图 1A)。此外，在其结构的C端含有保守的甲基化受体结构域，该结构能够感应外界信号；并且还有一个HAMP结构域，其能够通过细胞外结构域感应外界刺激，是一个高度可变的负责与刺激物结合的细胞周质感受区 (图 1B)。因此，推测Tlp1是一个重要的趋化受体蛋白。
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| 图 1 tlp1基因与其上下游在ORS571染色体上的排布 (A) 及其结构域 (B) Figure 1 Physical map (a) of tlp1 gene as well as the region (b) of its both ends and the predicted domain architecture Note: A: The arrows indicate the direction of transcription; HY: hypothetical protein. B: Domains of the predicted Tlp1 protein, as defined by the SMART database; HAMP: Histidinekinase, Adenylylcyclases, Methylbindingproteins, Phosphatases; MA: methyl-accepting chemotaxis-like domain; Black rectangles depict transmembrane regions. |
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三亲本接合转移以后，筛选在含有NaI和Gen抗性的TY平板上能够生长，同时不能在含有NaI、Gen和Tc抗性的TY平板上生长的接合子即为潜在的tlp1突变株。利用引物0660-F/0660-R，能在野生型ORS571中扩增出预期764 bp大小的片段，同时不能在潜在菌株中扩增出相应大小片段，即表明突变株构建成功 (图 2A)；能够用引物0660-com-F/0660-com-R在潜在回补菌株中扩增出和野生型中一样2 139 bp的片段，表明回补菌株构建成功；用该引物在突变株里可以扩增出重组交换后相应的1 340 bp大小片段，再次验证了突变株的成功构建 (图 2B)。另外，把PBBR1MSC-2空质粒转入野生型菌株和突变株中，这样就获得了WT (PBBR2)、∆tlp1(PBBR2)、∆tlp1(PBBR2-tlp1) 这3株菌株，分别代表野生型菌株、突变株和回补菌株。
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| 图 2 突变株和回补菌株的PCR验证 Figure 2 PCR confirmation of the mutant and complemented strain Note: A: primers: 0660-F/0660-R; 1: the genomic DNA of wild strain; 2: the genomic DNA of mutant strain. B: primers: 0660-com-F/0660-com-R; 3: the genomic DNA of wild strain; 4: the genomic DNA of complemented strain; 5: the genomic DNA of mutant strain. |
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在TY液体培养基中测定野生型菌株和tlp1突变株不同时期的OD600值，结果如图 3所示。从图 3中可以看出，突变菌株的生长曲线几乎与野生型一致，说明甲基化受体蛋白Tlp1缺失后并不影响菌株的生长情况。
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| 图 3 野生型和tlp1突变株生长曲线的测定 Figure 3 The growth curve of wild type and tlp1 mutant |
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在tlp1基因突变后不影响其生长的前提下，进行了趋化能力的测定。取OD600为0.6−0.8的菌液5 μL滴在半固体TY平板上，培养3−4 d后观察平板上趋化圈的大小。结果如图 4所示，与野生型菌株相比，tlp1突变株的趋化圈都有所减小，并且其回补菌株对缺失表型都能够部分回补，说明甲基化受体蛋白Tlp1能够感应甘油并对其有一定的趋化性。
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| 图 4 3株菌株对甘油的趋化能力 Figure 4 The chemotaxis ability to glycerol of three different strains Note: A: The chemotaxis ring of three strains in L3 semi-solid plate with the carbon source of glycerol (+/−N). B: The ratio of tlp1 mutant and its complemented strain swarm diameter to wild type. |
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在以甘油为碳源的刚果红固体平板上，野生型菌株和tlp1突变株的菌落形态没有明显的差异，其胞外多糖的分泌也没有差别。但存在氮源的情况下 (图 5)，培养5 d左右的tlp1突变株菌落中央开始产生黑色素，而野生型菌落仍然没有变化，但在继续培养数天后两菌株菌落全部变黑，说明受体蛋白Tlp1可能与菌株的次生代谢产物中黑色素的分泌快慢有关。
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| 图 5 野生型和突变株在刚果红平板上黑色素的分泌情况 Figure 5 The secretion of melanin of the wild type and mutant strain on Congo red solid culture medium Note: About 4 to 5 days, the center of mutant strain began to appear shallow black substance, and wild type does not have any similar phenomenon; About 5 to 6 days, wild type began to appear black substance, the black color of mutant strain deepened and have the diffusion trend; About 7 to 8 days, the center of wild type and mutant all become dark black. |
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根据公式分别计算出野生型菌株、tlp1突变株及其回补菌株的固氮酶活，结果如图 6所示。从图 6中可以看出，tlp1突变株的固氮酶活相对于野生菌株减弱了87.4%，回补菌株的固氮酶活能够回补52.7%。数据说明甲基化受体蛋白Tlp1可能间接影响茎瘤固氮根瘤菌ORS571的自生固氮过程。
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| 图 6 3株不同菌株的固氮酶活 Figure 6 The nitrogenase activity of three different strains |
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本研究采用体外趋化试验技术、分子生物学、生物化学及生物信息学等手段，以各种氨基酸、有机酸等为信号物质，探究茎瘤固氮根瘤菌中基因簇上游的甲基化受体蛋白Tlp1在趋化、茎瘤竞争性以及其次生代谢产物分泌等方面的功能，结果表明，在ORS571中，甲基化受体蛋白Tlp1的缺失影响了菌体对甘油的趋化能力和固氮酶活，同时该受体还与黑色素的分泌相关。
模式菌株大肠杆菌信号转导通路包含5种甲基化受体蛋白：感受天冬氨酸和麦芽糖的受体 (Tar)，感受丝氨酸的受体 (Tsr)，感受核糖和半乳糖的受体 (Trg)，感受二肽的受体 (Tap) 及感应氧的受体 (Aer)。对根瘤菌趋化性研究较多的苜蓿中华根瘤菌 (Sinorhizobium meliloti) 的受体有9种[17]，巴西固氮螺菌 (Azospirillum brasilense) 的受体有48种，其中AerC受体蛋白可以感受胞内的氧化还原状态 (FAD)，从而对外界的氧气浓度变化做出反应[18]。茎瘤固氮根瘤菌的受体有43种[19]，本实验研究的其中一种甲基化受体蛋白Tlp1的缺失突变对菌株感应甘油的能力产生了比较大的影响，也说明此蛋白在茎瘤固氮根瘤菌中确实是一种趋化受体蛋白，并且对甘油表现出一定的趋化性。我们将进一步研究甲基化受体蛋白Tlp1在不同氨基酸和有机酸中对菌株趋化能力的影响，并探索其影响趋化的机理过程。
一般来说，黑色素并不是微生物生长、繁殖、代谢所必需的。固氮菌所产生的黑色素主要为腐殖质和腐殖酸，主要作用是保护细胞免受辐射伤害和微生态环境中其他微生物的溶菌作用。黑色素具有抗氧化、阻止心磷脂脂质体的氧化、清除自由基、抗辐射功能以及在食品和化妆品中的重要性[20]。而固氮酶在严格厌氧条件下固氮，甲基化受体蛋白Tlp1的缺失突变株提前产生黑色素，可能是固氮酶的一种自我保护作用。但用以甘油为碳源的液体L3培养基培养菌株，均未发现有黑色素的产生，可能和其培养条件有关。下一步将通过筛选培养基 (碳源、氮源) 和不断改变培养条件 (温度、PH、通气量、菌液浓度等) 使茎瘤固氮根瘤菌中的黑色素快速大量地产生并把其提取出来，确定它的类型。
在根瘤菌中，大多数生物固氮作用是由依赖钼的固氮酶进行催化，而固氮酶是由Fe蛋白和MoFe蛋白组成。之前研究已经证实nifE、nifN、nifX、nifB、nifQ、nifV、nifY和nifH基因对于固氮酶中MoFe的合成是非常重要的，nifM对于固氮酶中Fe蛋白的正确折叠是不可或缺的[21]。目前趋化受体蛋白影响固氮能力的研究并不多见，受体蛋白究竟是通过何种方式来影响固氮酶活还不清楚，是否与趋化能力的降低相关等将需要进一步研究。
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