由黑腐皮壳属真菌 (Valsa mali) 引起的苹果树腐烂病是严重危害我国苹果产区的重要病害之一。由于对苹果树腐烂病菌的致病机理了解甚少，导致生产上防控该病害盲目、低效。探究苹果树腐烂病菌的致病机理对制定有效的病害防控策略具有重要意义。

有许多研究表明果胶酶是病原真菌的一个重要致病因子。早在1966年，Bateman和Millar^[1]发现了果胶酶在植物细胞壁降解中的作用。Gairola等^[2]发现果胶酶在桃树腐烂病菌 (Cytospora) 降解寄主细胞壁的过程中起关键作用。在黄曲霉 (Aspergillus flavus) 和灰霉菌 (Botrytis cinerea) 中，同样证实了多聚半乳糖醛酸内切酶为病菌的致病因子^[3-4]。在炭疽菌 (Colletotrichum magna) 的致病力缺失突变体研究中，果胶裂解酶基因的缺失能够导致病原菌的致病力缺失^[5]。此外，研究者们还发现Didymella bryonia等病原真菌能够产生果胶酶，且在病菌侵染过程中对寄主组织的降解起重要作用^[6-7]。

同样，果胶酶在苹果树腐烂病菌致病过程中的作用也逐渐被人们发现。20世纪80年代，刘福昌等^[8]对苹果树腐烂病病原菌致病因素进行了探讨，认为病原菌产生的果胶酶在其致病过程中起着重要作用。此外，研究发现在苹果树腐烂病菌的发酵液中检测到高活性的果胶酶^[9-10]。Ke等^[11]利用电子显微镜以及免疫胶体金细胞化学标记技术发现，在腐烂病菌侵染树皮过程中有大量的果胶酶产生，而其他细胞壁降解酶类没有明显的积累。转录组分析发现苹果树腐烂病菌在侵染过程中，果胶酶等大量水解酶基因显著上调表达^[12]。通过测定不同致病力的苹果树腐烂病菌突变体的胞外果胶酶活性，发现其与病菌致病力呈正相关^[13]。以上结果从不同层面证实了果胶酶是苹果树腐烂病菌的致病关键因子。

本研究拟通过分离、纯化苹果树腐烂病菌发酵液中的果胶酶并开展酶学性质研究，以确证苹果树腐烂病菌的果胶酶类型，为以后果胶酶抗体的制备和组织细胞化学研究奠定基础，进而为揭示苹果树腐烂病菌的致病机理和防治提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌种及培养基: 供试菌种为苹果树腐烂病菌 (Valsa mali) 野生型菌株03-8，由西北农林科技大学植物病害综合治理实验室提供，4 ℃保存，在PDA培养基 (200 g马铃薯洗净去皮切碎，加水1 L煮沸30 min，八层纱布过滤，加入葡萄糖20 g，琼脂粉15 g) 上活化后使用。发酵培养基为0.5%淀粉MS液体培养基，配方为每1 000 mL培养基含可溶性淀粉5.00 g，L-天门冬酰胺2.00 g，KH₂PO₄ 1.00 g，MgSO₄·7H₂O 0.50 g，ZnSO₄·7H₂O 0.88 g，Fe (NO₃)₃·H₂O 1.50 mg，MnSO₄·5H₂O 0.44 mg，生物素 (VH) 5.00 µg，VB1 0.10 mg。

1.1.2 主要试剂和仪器: 钌红、叠氮化钠、果胶购自美国Sigma-Aldrich公司；考马斯亮蓝G-250、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自西安沃尔森生物技术有限公司。

AKTA蛋白层析系统、蛋白层析柱购自美国GE Healthcare公司；冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；mini protein Ⅲ蛋白电泳系统购自美国Bio-Rad公司；紫外分光光度计购自上海尤尼柯仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制备: 将苹果树腐烂病菌野生型菌株03-8接种于PDA平板培养基，25 ℃培养3 d，于菌落边缘的幼嫩菌丝打菌饼 (6 mm)，将菌饼接种于配好的0.5%淀粉MS液体培养基，每250 mL培养基放置10个菌饼，接种后将三角瓶置于25 ℃恒温分别静置培养5、10、15 d，每天定时摇动两次。将培养好的菌液10 000 r/min离心10 min，弃掉菌体得粗酶液。

1.2.2 粗酶液果胶酶定量测定方法: (1) D-半乳糖醛酸标准曲线的制作。果胶酶的定量测定采用DNS法^[14]。配制2 g/L的D-半乳糖醛酸标准溶液100 mL，分别取标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL具塞试管中，用蒸馏水补足到1 mL，分别加入0.5 mL pH 4.8的柠檬酸缓冲液和3.0 mL DNS试剂，沸水浴中反应5 min，用流动水冷却至室温，用蒸馏水定容到10 mL。以D-半乳糖醛酸含量为0的试管为对照，测定各处理在540 nm波长下的吸光值A。以吸光值为纵坐标，D-半乳糖醛酸毫克数为横坐标，绘制标准曲线。(2) 粗酶液果胶酶活性定量检测。取1 mL粗酶液于试管中，在50 ℃水浴中平衡5 min，加入预平衡至50 ℃的果胶底物0.5 mL，50 ℃恒温浴30 min，加入3.0 mL DNS终止反应后，沸水浴5 min，用流动水冷却至室温，最后加蒸馏水定容到10 mL。以煮沸10 min灭活的粗酶液为对照在540 nm处测吸光值。酶活力单位 (U)：1 mL酶在50 ℃、pH 4.8的条件下，1 h分解果胶产生1 mg D-半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

1.2.3 果胶酶活性定性测定: 果胶酶活性定性测定方法采用钌红染色法^[15]。取0.1 g果胶溶于100 mL pH 5.0、50 mmol/L醋酸钠缓冲液，称取2 g琼脂糖加入到果胶溶液中加热至琼脂糖溶解，然后降温至60 ℃，再补加叠氮化钠使其终浓度为2.5 mmol/L，将配好的液体直接倒入培养皿中，每个皿50 mL。培养皿冷却之后打2 mm直径的小孔，然后取20 μL粗酶液于小孔中，取20 μL适当稀释的Sigma果胶酶作阳性对照，在25 ℃培养16 h，用0.05%钌红染液染色45 min，然后用蒸馏水简单冲洗凝胶。

1.2.4 粗酶粉的制备: 将发酵10 d的苹果树腐烂病菌03-8发酵液抽滤，硫酸铵分级沉淀，根据果胶酶活性确定最佳硫酸铵饱和度，透析除盐，冷冻干燥，即得粗酶粉^[16]。

1.2.5 果胶酶的纯化: Sephacryl S-100凝胶过滤层析：将粗酶粉用3 mL pH 5.0、50 mmol/L醋酸钠缓冲液溶解，0.22 μm滤膜过滤，样品预处理后过Sephacryl S-100 (Ф1.6 cm×60 cm) 柱，洗脱液为pH 5.0、50 mmol/L醋酸钠缓冲液，先用洗脱液平衡Sephacryl S-100 (Ф1.6 cm×60 cm) 柱子至基线平衡，上样，洗脱，流速为1.5 mL/min，分管收集洗脱液，每管1.5 mL，用钌红染色法逐管检测是否有果胶酶活性。将有果胶酶活性的样品合并，过DEAE-Sepharose Fast Flow (1 mL) 阴离子交换柱。A液：pH 5.0、50 mmol/L醋酸钠缓冲液；B液：1 mol/L NaCl的pH 5.0、50 mmol/L醋酸钠缓冲液。先用A液平衡柱子，然后B液从0−100%进行梯度洗脱，流速为0.5 mL/min，分管收集洗脱液，每管1 mL，用钌红染色法逐管检测酶活性。将有活性的样管用SDS-PAGE电泳进行检测，条带相同的样管进行浓缩合并后备用。同时取有果胶酶活性的样品进行SDS-PAGE电泳，切下条带通过LC-ESI-MS/MS技术进行肽段氨基酸序列的测定。

1.2.6 果胶酶性质研究: (1) 蛋白质分子量的测定。采用SDS-PAGE电泳法来测定蛋白质亚基的分子量，详细方法参考Laemmli等^[17]，采用5%和12.5%的SDS聚丙烯酰胺凝胶分别为浓缩胶和分离胶。考马斯亮蓝染色，根据蛋白Marker和条带迁移率计算分子量。(2) 酶的最适温度。100 μL酶液与50 μL 0.5%的果胶溶液 (用pH 5.0、50 mmol/L的醋酸钠缓冲液溶解)，分别在20、30、35、40、45、50、55、60、70、80 ℃反应30 min，用DNS法测定酶活力，确定酶的最适反应温度。(3) 酶的最适pH。用不同pH值 (2.0、2.4、3.0、3.5、4.0、4.4、5.0、6.0、6.5、7.0、7.6、8.0) 的50 mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制0.5%的果胶溶液。100 μL酶液与50 μL不同pH的0.5%果胶溶液在50 ℃反应30 min，用DNS法测定酶活，确定酶的最适反应pH。(4) 酶的热稳定性。100 μL酶液与50 μL 0.5%果胶溶液 (用pH 5.0、50 mmol/L的醋酸钠缓冲液溶解) 分别在30、40、50、60、70 ℃水浴中反应，每隔10 min测一次酶活，比较相对酶活力，以0 min为对照，确定酶的热稳定性。(5) 酶的pH稳定性。用不同pH的缓冲溶液溶解果胶和果胶酶，4 ℃过夜，分别调pH至4.8后用DNS法测酶活，比较相对酶活力，确定酶的pH稳定性。(6) 金属离子对酶活力的影响。分别取20 μL 50 mmol/L的AgNO₃、KCl、CaNO₃·4H₂O、MgSO₄·7H₂O、FeSO₄·7H₂O、CuSO₄·5H₂O、LiCl、BaCl₂·2H₂O、MnSO₄·H₂O、Pb (C₂H₃O₂)₂·3H₂O、NiCl·6H₂O、Co (NO₃)₂·6H₂O、ZnSO₄·7H₂O盐溶液加入50 μL 0.5%果胶溶液 (用pH 5.0、50 mmol/L的醋酸钠缓冲液溶解) 中，各加入100 μL酶液于50 ℃反应30 min，用DNS法测定酶活力，以双蒸水作对照，确定这些金属离子对果胶酶活性的影响。(7) 酶的动力学常数V_m及K_m。分别取50 µL浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的果胶 (用pH 5.0、50 mmol/L的醋酸钠缓冲液溶解) 与100 µL酶液50 ℃反应30 min，用DNS法测定酶活力，用Lineweaver-Burk作图法求酶动力常数V_m及K_m。

2 结果与分析 2.1 不同发酵天数的粗酶液中果胶酶活性的定量及定性检测

发酵液果胶酶活性用DNS法进行定量测定，D-半乳糖醛酸的标准曲线见图 1。通过测定，发现苹果树腐烂病菌在0.5%淀粉MS培养基中发酵10 d后果胶酶活性最高 (图 2)，以后的研究均采用此条件。

为了进一步检测该活性的特异性，用钌红染色法对该粗酶液果胶酶进行了定性检测。由图 3可以看出，缓冲液 (图 3中3) 和酸碱 (图 3中2和6) 都没有显色圈，甲基化 (图 3中5) 也不能产生显色圈，只有Sigma果胶酶对照 (图 3中1) 和粗酶液具有明显的显色圈，表明该方法作为检测果胶酶的存在十分有效，同时也表明粗酶液中含有果胶酶。

2.2 硫酸铵分级沉淀

发酵液过滤后用不同饱和度的硫酸铵进行梯度盐析。结果见表 1，当硫酸铵饱和度低于40%时没有沉淀析出；当硫酸铵饱和度达到70%时，析出大量沉淀，沉淀溶解之后检测到较强的果胶酶活性；上清中继续加硫酸铵至饱和度为90%，此时仍有沉淀析出，但是沉淀中果胶酶的比活较低，可能大部分是一些杂蛋白，因此选择硫酸铵饱和度为70%的沉淀作为目的蛋白。

2.3 果胶酶的分离纯化

粗酶粉经缓冲液稀释后过分子筛柱Sephacryl S-100后，每管测果胶酶活 (图 4)，结果表明2-S和1-S两个峰对应的酶液均有酶活，但2-S峰的果胶酶活性整体高于1-S峰中果胶酶活性。由于果胶酶是一种复合酶，说明1-S和2-S可能是两种不同的果胶酶。

将1-S和2-S对应的粗酶液分别过阴离子交换柱DEAE-Sepharose Fast Flow (图 5)。进行果胶酶活性检测，将有果胶酶活性的样品进行SDS-PAGE电泳 (图 6)，1-S由于蛋白种类太多没有得到有效分离，由2-S分离得到的果胶酶已达到电泳纯。肽段序列测定发现该氨基酸序列为MTAGTGGGNLFFIEHTTDFEFYSANSK和GGNK GGLDGIDIWGTNIWVHDVEVTNK，通过NCBI数据库比对可知该酶为鼠李糖半乳糖醛酸酶，等电点为6.03。

2.4 果胶酶的酶学性质

2.4.1 分子量: SDS-PAGE电泳后根据标准蛋白的标准曲线方程计算出鼠李糖半乳糖醛酸酶的分子量为58.83 kD (图 6)。

2.4.2 最适反应温度: 利用DNS法对鼠李糖半乳糖醛酸酶进行最适反应温度测定，发现其最适反应温度约为40 ℃；在20 ℃和30 ℃时，酶活性较低，分别为最高酶活性的21.06%和35.89%；当温度达到45 ℃时酶活性比较高，为最高酶活性的90.45%；当温度超过45 ℃时，果胶酶活性开始明显下降；在80 ℃时，酶活性仅为最高酶活性的17.97% (图 7)。

2.4.3 最适反应pH值: 由图 8可以看出，鼠李糖半乳糖醛酸酶的最适反应pH为3.5左右；pH范围在2.0−4.0时，果胶酶的相对酶活力能保持在最高酶活力的80%以上；当pH高于5.5时，相对酶活力下降，低于50%。

2.4.4 果胶酶的稳定性: (1) 热稳定性。由图 9可以看出，鼠李糖半乳糖醛酸酶在30 ℃时酶活力较为稳定，保温1 h后仍能保持80%以上的酶活力；在40 ℃，40 min以内时仍能保持80%以上的酶活力，40 min以上时酶活力急剧下降；温度高于50 ℃时酶活力迅速下降；60 ℃和70 ℃保温10 min时酶活力仅为22.0%和16.8%。(2) pH稳定性。鼠李糖半乳糖醛酸酶在pH 2.0−5.5之间的果胶酶活性比较稳定，能保持50%以上的酶活力；在pH 7.0−8.0之间检测不到果胶酶活性，见图 10。(3) 金属离子的稳定性。金属离子对鼠李糖半乳糖醛酸酶活性的影响见表 2。由表 2可以看出，Ca²⁺对酶活力有强烈的激活作用，Li⁺、Co²⁺对酶活有轻微的激活作用，K⁺对酶活有轻微的抑制作用，Fe²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Ni⁺对酶活有较强的抑制作用，Ba²⁺、Mg²⁺加入之后检测不到果胶酶活性。

2.4.5 酶促反应动力学研究: 用定量的果胶酶鼠李糖半乳糖醛酸酶与不同浓度的底物 (果胶) 反应，测得不同底物浓度条件下的反应速度。根据Lineweaver-Burk法可得y=23.095x+6.415 3，求出：K_m=23.095/6.415 3=3.600 g/L，V_m=1/6.415 3=0.162 7 g/(L·min)。

3 结论

苹果树腐烂病菌的侵染致病过程是一个相当复杂的互作过程。目前，已有很多研究表明果胶酶可能是苹果树腐烂病致病过程中的一个重要致病因子。

本实验通过测定发酵液果胶酶活性确定了最适发酵时间，并通过对发酵液进行硫酸铵盐析、透析、冷冻干燥、Sephacryl S-100，DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析等过程从苹果树腐烂病菌发酵液中分离得到了鼠李半乳糖醛酸酶，等电点为6.03。与SDS-PAGE中标准蛋白的相对迁移率 (R_f) 比较，得到其亚基分子量为58.83 kD。经测定，该果胶酶最适反应温度为45 ℃，最适pH为3.5。Normand等^[18]通过毕氏酵母真核表达分离到了担子菌中存在的一种鼠李聚半乳糖醛酸酶，它的分子量为56 kD，最适反应温度为40−50 ℃，最适pH为4.5−5.0之间。二者的研究数据基本一致。同时，本研究还对分离到的酶的酸稳定性和热稳定性进行了研究，发现该酶在pH 2.2−5.5之间酶活性基本稳定，在40 ℃以下比较稳定，这些数据目前尚未见报道。此外，本实验还发现，Ca²⁺对鼠李半乳糖醛酸酶活力有强烈的激活作用，Li⁺和Co²⁺离子对酶活也有一定的激活作用，而K⁺、Fe²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Ni⁺对该酶活有抑制作用，特别是Ba²⁺和Mg²⁺离子完全能抑制该酶的活性。由此可以推测，如果在苹果树腐烂病防治过程中能考虑到Ba²⁺和Mg²⁺离子或者K⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺等离子的应用，也许可以增强树木对病菌侵染的抵抗能力。这一结果对苹果树腐烂病的防治具有重要的指导意义。

本实验在分离过程中分析有两个果胶酶区段 (1-S和2-S)，但由于1-S中蛋白种类较多，各组分含量较少，未能分离纯化出来。实际上，在苹果树腐烂病菌的致病过程中，起致病作用的成分也许是能够分解果胶物质的果胶复合酶。许多研究也表明不同微生物产生的果胶酶都不是单一组分，通常为一种或几种复合酶^[19]。因此要研究清楚苹果树腐烂病菌的致病机理，还需要进一步分离纯化其他果胶酶。